BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis Penelitian
Jenis penelitian adalah eksperimen satu faktor dengan menggunakan rancangan pola acak lengkap.
B. Rancangan Penelitian
Penelitian yang dilaksanakan merupakan penelitian eksperimen, rancangan penelitian yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL) dengan empat kelompok, yaitu : 1 kelompok kontrol dan 3 kelompok perlakuan dengan masing-masing kelompok 4 ekor tikus putih sebagai ulangan. Pemberian ekstrak kacang kedelai hitam dengan volume 2 ml perhari sesuai dengan dosis masing-masing perlakuan selama 21 hari secara oral yang didasarkan pada hasil uji pendahuluan, yaitu sebagai berikut:
1. Kontrol = kelompok tanpa perlakuan ekstrak kacang kedelai hitam (Glycine soja) 0 mg/200 g/hari dan diberi perlakuan aquadesh 2 ml/200 g/hari.
2. Perlakuan 1 = kelompok dengan perlakuan ekstrak kacang kedelai hitam (Glycine soja) 50 mg/200 g/hari. 3. Perlakuan 2 = kelompok dengan perlakuan ekstrak kacang
kedelai hitam (Glycine soja) 100 mg/200 g/hari.
4. Perlakuan 3 = kelompok dengan perlakuan ekstrak kacang kacang kedelai hitam (Glycine soja) 150 mg/200 g/hari.
C. Waktu dan Tempat Penelitian
1. Waktu
Penelitian ini dilaksanakan pada 12Oktober –30November2016. 2. Tempat Penelitian
a. Pembuatan ekstrak kacang kedelai hitam dilakukan di Unit II Fakultas Farmasi UGM dengan teknik ekstraksi maserasi.
b. Pemeliharaan tikus dilakukan di Unit Pengelolaan Hewan Laboratorium Biologi FMIPA UNY.
c. Pembuatan preparat histologik organ dilakukan di Laboratorium Biologi FMIPA UNY dan di Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Hewan UGM.
d. Pengamatan preparat histologik endometrium dilakukan di laboratorium Mikroskopi dan Zoologi Jurdik Biologi FMIPA UNY.
D. Populasi dan Sampel
1. Populasi
Tikus putih. 2. Sampel
16 ekor tikus putih betinaumur ± 2 bulan dan memiliki berat 200 gram yang diberi perlakuan ekstrak kacang kedelai hitam.
E. Variabel Penelitian
1. Variabel Bebas
Ekstrak kacang kedelai hitam dengan dosis perlakuan : P0 : 0 mg (kontrol)
P1 : 50 mg/200 g/hari. P2 : 100 mg/200 g/hari. P3 : 150 mg/200 g/hari. 2. Variabel Tergayut
a. Jumlah kelenjar endometrium
b. Ketebalan lapisan endometrium tikus putih.
3. Variabel Kontrol
Dosis ekstrak masing-masing dengan volume 2 ml, tikus putih betina strain wistar, waktu pemberian ekstrak kacang kedelai hitam.
F. Alat dan Bahan Penelitian
1. Alat
a. Kandang tikus
b. Tempat pakan dan minum
c. Alat suntik 5 ml d. Botol jam e. Botol flakon f. Sarung tangan g. Sonde oral h. Cotton buds i. Kertas label j. Mikroskop k. Bak parafin l. Alat bedah m.Gelas preparat n. Mikrometer objektif o. Mikrometer okuler
p. Alat ekstraksi maserasi
q. Alat tulis
r. Mikrotom
s. Nampan
2. Bahan
a. Tikus putih betina umur 2 bulan. b. Alkohol 70%, 80%, 96%, absolut c. Pakan tikus d. Formalin10% e. Chloroform f. Aquadesh 4
g. Pewarna Eosin
h. Parafin
i. Pewarna Giemsa
j. NaCl
k. Serbuk gergaji
l. Kacang kedelai hitam
m.Xylol n. Toluol o. Haematoxylin p. Glyserin q. Etanol 96% r. Canada balsam 5
G. Langkah Penelitian
1. Tahap persiapan
a. Menyiapkan 16 tikus putih betina dengan umur ± 2 bulan dengan berat 200 gram.
b. Menyiapkan kandang tikus sebanyak 4 buah.
c. Menyiapkan kacang kedelai hitam yang sudah dikeringkan.
d. Melakukan ekstraksi kacang kedelai hitam dengan teknik ekstraksi maserasi di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT) UGM.
H. I.
2. Tahap pembuatan ekstrak kacang kedelai hitam dengan teknik ekstraksi maserasi
a. Biji kering kacang kedelai hitam dihancurkan menjadi bentuk serbuk, kemudian massa yang telah halus dimasukkan ke dalam maserator dan dituangi dengan etanol 96% .
b. Proses maserasi yang dilakukan dengan cara perendaman dibiarkan selama 24 jam.
c. Cairan hasil ekstraksi ditampung dan sisa ampas direndam kembali dengan etanol 96% dan dibiarkan selama 24 jam.
d. Cairan hasil maserasi ditampung kembali dan dilakukan kembali maserasi pada sisa serbuk kacang kedelai hitam hingga didapat tiga cairan hasil maserasi.
e. Seluruh hasil maserasi tersebut dievaporasi menggunakan alat evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental yang terpisah dari pelarut etanolnya. 3. Aklimatisasi
a. Menyiapkan 16 ekor tikus putih betina (Rattus norvegicus, L.) berumur 2 bulan.
b. Menyiapkan 4 buah kandang dan memasukkan tikus putih secara acak sebanyak 4 ekor tikus kedalam masing-masing kandang.
c. Memberikan pakan dan minum tikus setiap hari.
d. Membersihkan kandang 2 kali seminggu dengan mengganti alas berupa serbuk gergaji.
e. Tahap aklimatisasi berlangsung selama 7 hari.
4. Perhitungan dosis
J. Penentuan dosis perlakuan pada penelitian didasarkan pada hasil uji pendahuluan, dimana pada uji pendahuluan terdiri dari 4 kelompok perlakuan. Satu kelompok kontrol (0 mg ekstrak kacang kedelai hitam) dan tiga kelompok perlakuan, masing-masing 50 mg, 100 mg, 150 mg ekstrak kacang kedelai hitam. Berikut hasil dari uji pendahuluan:
K. Tabel 2. Rata-rata Jumlah Kelenjar Endometrium (unit) Uji Pendahuluan
L. Jumlah Kelenjar Endometrium M. Perlakuan O. Kontrol P. P1 (50mg) Q. P2 (100mg) R. P3 (150mg) T. 6,590 U. 11,675 V. 9,985 W. 8,335 X.
Y. Tabel 3. Rata-rata Ketebalan Lapisan Endometrium (µm) Uji Pendahuluan
Z. Ketebala n Lapisan Endometrium
AA. Perlakuan AC. Kontrol AD. P1
(50mg)
AE. P2 (100mg)
AF. P3 (150mg) AH. 359,068 AI. 370,280 AJ. 433,110 AK. 316,682 AL.
AM. Hasil uji pendahuluan diatas, dosis yang berpengaruh menaikkan jumlah kelenjar dan ketebalan lapisan endometrium adalah pada dosis perlakuan P1 (50mg) dan P2 (100mg). Berdasarkan besar dosis tersebut, pada penelitian ini ditentukan 4 kelompok perlakuan, yaitu 1 kelompok kontrol (0mg ekstrak kacang kedelai hitam) dan 3 kelompok perlakuan P1 (50mg), P2 (100mg) dan P3 (150mg) ekstrak kacang kedelai hitam, dengan selisih dari dosis perlakuan adalah 50mg.
b. Kandungan isoflavon pada setiap dosis perlakuan.
AN. Kacang kedelai hitam mengandung fitoestrogen jenis isoflavon, dalam 100 gram kacang kedelai hitam mengandung isoflavon sebanyak 206 mg. Sehingga kandungan isoflavon dalam setiap dosis perlakuan adalah sebagai beriku:
d.1) Dosis 50 mg
AO. 100 gram = 100.000 mg
AP. 100.000 mg mengandung 206 mg isoflavon
AQ. Maka, dalam 50 mg mengandung isoflavon sebanyak:
AR. 100.000 X = 206 x 50 mg
AS. X = 10.300 : 100.000
AT. X = 0,103 mg isoflavon.
d.2) Dosis 100 mg
AU. 100 gram = 100.000 mg
AV. 100.000 mg mengandung 206 mg isoflavon
AX. 100.000 X = 206 x100 mg AY. X = 20.600 : 100.000 AZ. X = 0,206 mg isoflavon. d.3) Dosis 150 mg BA. 100 gram = 100.000 mg BB. 100.000 mg mengandung 206 mg isoflavon
BC. Maka, dalam 150 mg mengandung isoflavon sebanyak:
BD. 100.000 X = 206 x150 mg
BE. X = 30.900 : 100.000
BF. X = 0,309 mg isoflavon.
5. Tahap pelaksanaan
a. Pemberian ekstrak kacang kedelai hitam.
BG. Ekstrak kacang kedelai hitam diberikan secara oral pada tikus putih sesuai dosisnya masing-masing, setiap 1 kali sehari selama 21 hari pada pukul 16.00 WIB.
b. Pemeliharaan tikus putih dengan pemberian pakan secara rutin dan teratur setiap hari.
c. Pengambilan apus vagina.
BH. Pengambilan apus vagina dilakukan untuk mengetahui
siklus estrus pada tikus putih. Siklus estrus perlu diketahui karena perlakuan dimulai dan diakhiri saat tikus putih sedang mengalami fase estrus. Prosedur pembuatan apus vagina adalah gelas benda dibersihkan dengan alkohol 70%. Cotton bud dicelupkan ke dalam NaCl fisiologis, kemudian dimasukkan ke dalam vagina tikus sedalam 1 cm kemudian diputar secara perlahan dan merata sehingga diperoleh jaringan mukosa vagina selanjutnya dioleskan di atas gelas objek sambil diputar sehingga diperoleh olesan yang merata. Gelas objek kemudian dikeringanginkan dan difiksasi dengan methanol 70% selama 15 menit dan diwarnai menggunakan pewarna giemsa selama 20 menit. Setelah itu, sediaan tersebut dicuci menggunakan air mengalir dan dikeringkan pada suhu kamar. Preparat apus vagina kemudian diamati dibawah mikroskop cahaya.
d. Pembuatan preparat histologik
BI. Eutanasi dilakukan terhadap tikus setelah perlakuan selama 21 hari. Eutanasi dilakukan saat tikus sedang dalam fase estrus, sehingga eutanasi 16 ekor tikus tidak bisa dilakukan secara serempak dalam satu hari, tergantung
tikus mana yang sedang mengalami siklus estrus terlebih dahulu. Pembuatan preparat dilakukan di Laboratorium Pathologi Kedokteran Hewan UGM dengan prosedur sebagai berikut:
1) Melakukan pembiusan terhadap tikus dengan menggunakan kloroform.
2) Section (pembedahan)
BJ. Pembedahan bertujuan untuk mengambil organ uterus tikus putih yang akan dibuat preparat dan diamati jumlah kelenjar dan ketebalan lapisan endometriumnya.
3) Labelling (pemberian label)
BK. Uterus dimasukkan kedalam botol flakon dan ditempeli label.
4) Fixation
BL. Uterus yang telah diberi label segera dimasukkan dalam larutan fiksatif supaya tidak terjadi autolisis post mortal. Fiksatif yang digunakan adalah formalin 10%.
BM. BN. BO.
BP.
5) Dehydration
BQ. Dehidrasi merupakan penggantian molekul air dengan molekul alkohol bertingkat mulai konsentrasi rendah hingga absolut dalam waktu yang telah ditentukan:
a) Alkohol 70%, 3x @ 30 menit
b) Alkohol 80%, 3x @ 30 menit
c) Alkohol 90%, 3x @ 30 menit
d) Alkohol 96%, 2x @ 30 menit
e) Alkohol absolute, 1x @ 30 menit
6) Clearing (penjernihan)
BR. Pada proses clearing bertujuan untuk membersihkan cairan dehidran dari dalam jaringan. Reagen penjernihan yang dipakai dalam pembuatan preparat uterus adalah toluol, reagen pembersih ini akan diganti dengan paraffin dengan cara penetrasi ke dalam jaringan.
BS. Proses infiltrasi dilakukan dengan oven pada temperatur 70-80ºC, suhu tersebut bertujuan supaya temperaturnya sesuai untuk penetrasi parrafin selama proses berlangsung agar jaringan tgidak rusak. Parrafin yang dipilih untuk membuat preparat adalah parrafin dengan titik leleh yang tidak merubah keadaan sitologik dan sitokimia organ. Proses ini dilakukan dengan memakai parrafin bertingkat, yaitu parrafin: toluol perbandingan 1:1, parafin murni 1, 2 dan 3 masing-masing selama 30 menit. Penetrasi parrafin tergantung dari tebal tipisnya pemotongan preparat yang dipakai. Parrafin kemudian dibiarkan memadat dan diberi petunjuk arah pemotongan dan nama dari jaringan tersebut.
8) Sectioning (pemotongan dengan mikrotom)
a) Blok parrafin berisi jaringan diiris menggunakan scalpel, sehinggga bagian yang akan diiris menggunakan mikrotom berbentuk segi empat. Pengirisan menggunakan scalpel ini bertujuan supaya organ yang akan dibuat menjadi preparat terletak pada tengah coupes (irisan tengah pita preparat), kira-kira 3-5 mm dari tepi.
b) Meletakkan blok parrafin di holder kayu dengan mencairkan sedikit parrafin pada kayu yang digunakkan.
c) Memasang holder dengan blok parrafin pada rotary mikrotom yang direkatkan.
d) Setelah terpasang, kemudian menyiapkan tempat pita preparat dan kuas kecil untuk digunakan mengambil coupes dari pisau mikrotom.
e) Memasang pisau mikrotom pada tempatnya dan mengatur tebal tipisnya coupes dengan pengaturan mikrotom.
f) Segera setelah diiris, pita preparat langsung dimasukkan dalam tempat yang telah berisi air hangat, ini bertujuan agar coupes dapat terlentang dan tidak terlipat.
9) Affixing
a) Meletakkan sejumlah coupes pada gelas benda yang telah diberi perekat Gliserin albumin.
b) Memindahkan gelas benda yang berisi coupes di atas hotplate yang bersuhu (40-45ºC), mengatur letak coupes dan merentangkannya, menghisap kelebihan air dengan menggunakan kertas saring dan membiarkan gelas benda di atas hotplate sampai kering selama 24 jam. 10)Staining (pewarnaan)
BT. Langkah pertama adalah melakukan deparafinnasi dengan mencelupkan kaca benda yang telah ditempeli coupes ke dalam Xylol selama 30 menit. Hematoxylyn-Eosin digunakan pada proses pewarnaan selanjutnya.
a) Proses penghilangan parrafin selesai dilakukan, coupes dikeringkan dari xylol mengguanakan kertas filter maupun tissue, selanjutnya melakukan rehidrasi berturut-turut dengan mencelupkan ke dalam alkohol absolute, alkohol 96%, 90%, 80%, 70% kemudian memasukkan dalam Eosin selama 2 menit, mencelupkan ke dalam alkohol 60%, 50%, 40%, 30%, 20% kemudian dicelupkan ke dalam Hematoxylyn selama 10 menit dan mencucinya menggunakan air mengalir.
b) Melakukan rehidrasi dengan mencelupkan berurutan mulai alkohol 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96% dan alkohol absolute beberapa kali celupan kemudian mengeringkannya dengan kertas filter atau tissue.
c) Menetesi slide dengan Canada Balsam.
BU. 11)Penutup
BV. Setelah ditetesi mengguanakan Canada Balsam kemudian objek gelas ditutup dengan gelas penutup dan diusahakan tidak muncul gelembung, karena adanya gelembung akan mengganggu pengamatan. 12)Pengamatan struktur histologik
BW. Preparat histologik uterus yang telah dibuat diamati menggunakan mikroskop dengan perbesaran 100X. Preparat diamati secara sampling dan diamati seluruh bidang pandangnya, kemudian membandingkan hasil yang diperoleh antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol.
a) Cara menghitung jumlah kelenjar endometrium adalah dengan menghitung seluruh kelenjar yang tampak melalui cara sampling, yaitu kelenjar dihitung per satuan lapang pandang dengan perbesaran 100X. Cara menentukan satuan lapang pandang adalah dengan menghitung luas area pandang menggunakan rumus r2, yang sebelumnya telah
dilakukan kalibrasi antara mikrometer okuler dan obyektif. BX. Hasil kalibrasi tersebut adalah sebagai berikut:
BY. Skala objektif (ob) = 1 µm
BZ. Skala okuler = 10 µm
CA. Perbesaran = 100X
CB. Rumus: skala okuler = skala objektif X perbesaran
CC. Sehingga, 10 ok = 1 ob X 100
CE. ok = 10, jadi 1 skala okuler = 10 µm
CF. Satuan lapang pandang = , dimana r = 108 µm
CG. r = 108 X 10 = 1080 µm
CH. Satuan lapang pandang =
CI. = 3,14 X 10802
CJ. = 3,66 X106 µm2.
b) Cara mengukur ketebalan lapisan endometrium diukur mulai lapisan yang berbatasan langsung dengan lumen uterus sampai batas antara lapisan endometrium dengan lapisan miometrium menggunakan bantuan mikrometer okuler yang telah dikalibrasi dengan mikrometer obyektif melalui rumus kalibrasi di atas. Ketebalan diukur menggunakan skala pada mikrometer okuler, kemudian hasil yang diperoleh dikaliakan dengan nilai kalibrasi 10, sehingga diperoleh nilai ketebalan lapisan. Ketebalan lapisan endometrium diperoleh dari rerata empat kali pengukuran sampling yaitu bagian atas, bawah, kanan dan kiri endometrium.
CL. Sampel yang digunakan adalah 16 ekor tikus putih berumur ± 2 bulan yang sudah dibagi menjadi 4 kandang dengan 1 kandang merupakan kelompok kontrol dan 3 kandang merupakan kelompok perlakuan .
CM. Pemilihan sampel dilakukan secara acak dengan pemberian tanda berupa angka 1 sampai 16 di kepala tikus putih. Kemudian membuat potongan kertas yang diberi tulisan angka 1 sampai 16. Kertas dilipat kemudian dimasukkan ke dalam toples kecil. Kertas dipilih dan diambil dengan mata terpejam secara acak. Kertas yang terpilih disesuaikan dengan tikus putih yang dengan nomor dikepalanya. Kemudian dimasukkan ke dalam masing-masing kandang sebanyak 4 ekor sampai ke empat kandang terisi rata.Berikut adalah tabel data pengacakan tikus putih:
CN. Tabel 4. Data Pengacakan Tikus Putih pada Masing-masing Kandang
CO. CP. Kandang 1 CQ. Kandang 2 CR. Kandang 3 CS. Kandang 4 CT. Angk a di kepal a tikus putih CU.5 CV. 1 CW.7 CX.8 CZ. 12 DA.4 DB.16 DC.13 DE.15 DF. 10 DG.2 DH.9 DJ. 3 DK.6 DL. 14 DM. 11 DN.
DO. Teknik Pengumpulan data
DP. Penelitian diakhiri pada hari ke-21 dan tikus di eutanasi untuk diambil organ uterusnya, kemudian dilakukan proses preparasi dan dibuat preparat organ
uterus dengan pengecatan HE. Pengumpulan data melalui pengamatan pada preparat uterus yang telah dibuat dan diambil dokumentasinya kemudiann dihitung jumlah kelenjar endometrium dan diukur ketebalan lapisan endometrium pada kelompok kontrol dan kelompok perlakuan ekstrak kacang kedelai hitam, keseluruhan hasil pengamatan kemudian dianalisis.
DQ. DR. DS.
DT.Analisis Data
DU. Data jumlah kelenjar endometrium dianalisis menggunakan analisis nonparametrik kruskal-wallis untuk mengetahui ada tidaknya pengaruh pemberian ekstrak kacang kedelai hitam terhadap jumlah kelenjar endometrium.
DV. Data ketebalan endometrium dianalisis dengan analisis statistik One Way Anova untuk mengetahui apakah terdapat perbedaan pengaruh dosis ekstrak kacang kedelai hitam terhadap ketebalan endometrium tikus putih kelompok kontrol dan kelompok perlakuan, selanjutnya apabila terdapat pengaruh nyata, maka dilanjutkan dengan uji Duncan’s Multiple Range Test (DMRT) untuk mengetahui perbedaan dari masing-masing kelompok perlakuan.
