1 PENDAHULUAN
Kitin adalah polimer alam terbesar kedua setelah selulosa. Paling tidak, sekitar 10 gigaton (109 ton) kitin disintesis dan didegradasi setiap tahun di biosfer (Ueda et. al., 2005). Kitin tersebar luas di alam, terutama pada dinding sel jamur, eksoskeleton arthropoda, nematoda. Kitinase adalah enzim pengatalisis reaksi penguraian kitin, menghidrolisis ikatan -1,4 antara monomer N-asetil-D-glukosamin. Kitinase dihasilkan oleh berbagai organisme, dari virus, bakteri, archae, jamur, insektisida, tanaman tingkat tinggi dan mamalia (Dahiya et. al., 2005).
Pemanfaatan kitin skala industri belum dapat dicapai secara efisien karena hingga saat ini masih belum tersedia enzim yang dapat menghidrolisis ikatan ß-1,4 tanpa praperlakuan dengan asam klorida (Oku et. al., 2006). Asam klorida digunakan untuk memotong kitin kristalin menjadi kitin koloid. Solusi untuk permasalahan ini adalah menemukan kitinase yang dapat bekerja langsung pada kitin kristalin atau menemukan kitinase yang tahan asam.
Indonesia sebagai negara kedua dengan keanekaragaman hayatinya yang begitu besar dan memiliki banyak daerah rawa dengan kisaran pH 3-5, berpotensial untuk menemukan bakteri penghasil kitinase tahan asam. Rawa Indralaya Sumatera Selatan merupakan habitat bagi banyak mikroba, salah satunya adalah Chromobacterium violaceum. Kitinase yang dihasilkan C. violaceum diharapkan dapat bersifat tahan asam, sehingga dapat digunakan sebagai enzim yang mendegradasi kitin yang ramah lingkungan dan juga efisien dalam pemanfaatannya.
Pada penelitian ini telah dilakukan konfirmasi C. violaceum sebagai mikroba penghasil kitinase dan kloning fragmen gennya pada vektor kloning pGEM-T ke dalam Escherichia coli JM 109. Pada penelitian selanjutnya, fragmen gen tersebut dapat diekspresikan untuk mengisolasi enzim kitinase murni. Enzim kitinase kemudian digunakan dan dimanfaatkan dalam berbagai industri, termasuk industri farmasi sebagai penghasil N-asetil-D-glukosamin atau D-N-asetil-D-glukosamin.
2 BAB 1
TINJAUAN PUSTAKA
1.1 Kitin
Kitin adalah homopolimer dengan monomer ß-(1,4)-N-asetil-D-glukosamin (GlcNAc). Ikatan pembentuk polimer kitin adalah ikatan ß-1,4 yang menghubungkan monomer – monomer membentuk rantai panjang dan lurus serta ikatan hidrogen yang menghubungkan antar rantai polimer (Whistler, 1953) (Gambar 1.1). Kitin memiliki 3 bentuk struktur yang berbeda, yaitu: kitin a, kitin ß, dan kitin . Perbedaan terletak pada penyusunan rantai molekul pada struktur kristal. Rantai kitin a tersusun secara antiparalel, rantai kitin ß secara paralel dan rantai kitin tersusun campuran paralel dan antiparalel. Diantara ketiga bentuk tersebut, kitin a merupakan bentuk yang paling banyak membentuk kitin. Kitin memiliki penggunaan yang sangat luas pada bidang biokimia, industri makanan dan kimia. Kitin memiliki aktifitas antimikroba, antikolesterol dan antitumor. Kitin dan bahan – bahan yang berhubungan dapat digunakan pada pengolahan air limbah (Dahiya et. al., 2005).
Gambar 1.1 Struktur kitin yang dimodifikasi1
1.2 Kitinase
Kitinase adalah enzim pendegradasi kitin, bekerja dengan mekanisme mengatalisis reaksi hidrolisis ikatan ß-1,4 pada rantai plimer kitin menghasilkan oligomer – oligomer bahkan monomer N-asetil-D-glukosamin (GlcNac) (Dahiya et. al., 2005).
1.2.1 Klasifikasi kitinase 1 http://www.ocean.udel.edu/horseshoecrab/Research/chitin.html (10 September 2007)
1
4
ß
3 Berdasarkan tempat pemotongan dan produk yang dihasilkan, kitinase diklasifikasikan menjadi 3 jenis, yaitu jenis pertama adalah endokitinase yang memotong kitin secara acak pada daerah – daerah tengah rantai kitin, menghasilkan massa molekul multimer yang rendah seperti kitotetraose, kitotiose, dan diasetilkitobiose. Jenis kedua adalah eksokitinase yang dapat memotong diasetilkitobiose pada ujung mikrofibril kitin yang tidak tereduksi. Jenis terakhir ß-1,4-N-asetil-glukosaminidase yang memotong hasil produk oligomer endokitinase dan eksokitinase menghasilkan monomer N-asetil-D-glukosamin (Huang, 1998).
Berdasarkan kemiripan urutan asam amino, enzim kitinolitik dikelompokkan dalam glukosa hidrolase keluarga 18, 19 dan 20. Keluarga 18 mencakup kitinase yang berasal dari bakteri, virus, hewan, dan beberapa jenis tumbuhan, sedangkan keluarga 19 mencakup kitinase dari tanaman (kelas I,II dan IV) dan Streptomyces. Baru – baru ini ditemukan keluarga 20 mencakup ß-N-asetilheksosaminidase dari bakteri, Streptomyces dan manusia. Kitinase yang berasal dari bakteri dikelompokkan menjadi 3 subkeluarga, yaitu subkeluarga A, B dan C (Dahiya et. al., 2005).
1.2.2 Mekanisme kerja
Saat ini dikenal 2 mekanisme hidrolisis kitin yaitu mekanisme pergantian satu tahap dan pergantian dua tahap. Pada glukosa hidrolase keluarga 18, setelah atom oksigen glikosidik diprotonasi, senyawa antara ion oksokarbonium distabilkan oleh gugus N-asetil yang merupakan gugus tersubtitusi pada rangka glukosa senyawa tersebut. Stabilisasi terjadi melalui interaksi muatan antara karbon C1 dan oksigen karbonil pada gugus N-asetil. Senyawa antara ion oksokarbonium diserang oleh suatu nukleofilik yang berasal dari molekul air yang teraktivasi oleh suatu basa (asam glutamat) dari arah ß untuk melengkapi reaksi. Pada mekanisme ini hanya digunakan satu karboksilat yang berperan ganda, sehingga tidak memungkinkan terjadinya reaksi terjadi secara bersamaan maka mekanisme ini disebut pergantian dua tahap. Produk yang dihasilkan memiliki konfigurasi yang sama dengan senyawa awal.
Mekanisme pergantian satu tahap dimiliki oleh keluarga 19 glukosa hidrolase melalui beberapa tahap yaitu, pada tahap pertama, sebuah asam (asam glutamat 67) memprotonasi atom oksigen glikosidik, membentuk senyawa transisi ion oksokarbonium. Di sisi lain sebuah molekul air diaktivasi oleh basa (asam glutamat 89) untuk meningkatkan
4 kereaktifannya menjadi nukleofilik OH- yang kemudian menyerang atom C1 yang berada pada keadaan transisi dari arah untuk melengkapi reaksi. Pada mekanisme ini dibutuhkan 2 karboksilat yang disediakan oleh kitinase. Tersedianya 2 karboksilat memungkinkan reaksi terjadi hampir bersamaan, maka mekanisme ini disebut pergantian satu tahap. Dari simulasi dinamik molekular diketahui asam glutamat 89 tidak hanya mengaktifkan molekul air, tetapi juga berperan sebagai penstabil senyawa transisi ion oksokarbonium. Produk hidrolisis yang dihasilkan memiliki konfigurasi berlawanan terhadap konfigurasi senyawa awal. (Gambar 1.2) (Fukamizo, 2000).
(a) (b)
Gambar 1.2 Mekanisme hidrolisis glukosa hidrolase (a) keluarga 18 dan (b) keluarga 19 (Fukamizo, 2000)
5 1.2.3 Sumber kitinase dan Pemanfaatannya
a. Kitinase dari organisme prokariot
Dua kitinase yang dipelajari sebagai kitinase ekstrasel dari Psedomonas aeroginosa K-187 (FI dan FII) telah diisolasi. Kitinase tersebut memiliki aktivitas sebagai antibakteri dan stabil pada pH basa, suhu 40-60°C (Wang et. al., 1997). Gen pengkode kitinase dari dua bakteri Vibrio anguillarum KV 9001 (vac) dan V. Parahaemolyticus ATCC17802 (vpc) telah dikloning, kemudian ditentukan urutan nukleotidanya. Distribusi gen kitinase tersebut pada genus Vibrio lainnya pun telah dipelajari (Hirono et. al., 1998). Empat gen pengkode kitinase dari bakteri laut Altermonas sp Strain 0-7 yaitu Chi A, B, C, dan D telah dikloning dan dipelajari. Chi B berperan dalam hidrolisis kitin yang tidak larut, bekerja optimal pada pH 6 dan suhu 30°C, namun masih dapat bekerja hingga suhu ekstrim rendah 0°C. Chi B ini diduga sebagai cold adapted enzyme yang dihasilkan oleh bakteri – bakteri yang mengambil sumber nutrisi dari kitin untuk bertahan pada lingkungan dingin (Orikoshi et. al., 2003). Gen pengkode kitinase dari Pyrococcus furiosus telah dikloning, menghasilkan kitinase
rekombinan yang dapat mendegredasi kitin kristalin pada suhu tinggi (Oku et. al., 2006). Gen pengkode kitinase dari Bacillus thuringiensis telah dikloning
(Zhong et. al., 2005). Parasit malaria (ookinet) dapat mencerna membran peritrofik pada saluran cerna nyamuk sebagai mekanisme penetrasi, karena membran perotropik mengandung kitin dan adanya perusakan membran peritropik selama masa invasi (Huber et. al., 1990).
b. Kitinase dari organisme Eukaryot
Kitinase yang berasal dari tumbuhan diketahui memiliki berbagai fungsi bagi tumbuhan penghasilnya, antara lain sebagai bagian dari mekanisme pertahanan diri terhadap patogen, dan meregulasi proses pertumbuhan dan perkembangan dengan cara mensintesis dan mendegradasi molekul sinyal selama proses nodulasi (Kasprzewska, 2003). Hevamine, kitinase yang diisolasi dari pohon Hevea barsiliensis, diketahui struktur kristalnya dan gen pengkodenya telah berhasil dikloning (Bokma et. al., 2002). Dua jenis kitinase, yaitu kitinase mamalia asam (AMCase) dan chitotriosidase telah ditemukan pada paru – paru dan saluran pencernaan manusia (Rolf et. al., 2005).
6 1.3 N-asetil-D-glukosamin
Proses hidrolisis kitin dengan asam atau enzim dalam keadaaan yang terkendali dapat menghasilkan N-asetil-D-glukosamin (Whistler, 1953), serbuk putih kristalin, titik leleh 195-205°C, larut dalam air, stabil, namun dapat bereaksi dengan agen pengoksidasi kuat. Kartilago terdiri dari proteoglikan dan kolagen. Proteoglikan terdiri dari struktur berfilamen lurus dan panjang yang tersusun dari asam hyaluronat dengan monomer penyusun asam hyaluronat adalah N-asetil-D-glukosamin. Protein akan terikat secara non kovalen pada asam hyaluronat tersebut. Kompleks proteoglikan ini akan mengikat kolagen dan membantu serat –serat kolagen tetap berada pada jaring – jaring yang kuat pada kartilago serta menjerap air sebagai nutrisi dan lubrikasi kolagen (Mathews et. al., 2000).
Osteoarthritis dikenal juga sebagai penyakit sendi degeneratif, pada umumnya terjadi pada manusia yang berumur 60 tahun ke atas. Osteoarthritis dapat terjadi akibat akumulasi luka gesekan pada permukaan sendi, kemampuan tubuh untuk menghasilkan proteoglikan yang semakin lama semakin berkurang atau faktor genetik yang mempengaruhi pembentukan kolagen (Martini et. al., 2001). Mekanisme glukosamin dalam pengobatan osteoarthritis belum diketahui dengan pasti, namun penelitan menunjukkan glukosamin dapat berperan dalam proses penyembuhan osteoarthritis2.
2
