Biseibutsuso kaiseki oyobi metaboromu kaiseki kara saguru takuanzuke no hakko katei no kaimei

Title Sub Title Author Publisher Publication year Jtitle Abstract. Notes Genre URL. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org). 微生物叢解析及びメ夕ボローム解析から探る沢庵漬けの発酵過程の解明 梅田, 栄美 慶應義塾大学湘南藤沢学会 2013 生命と情報 No.20 (2013. ) ,p.158- 165 沢庵漬けは大根を干して米糖と塩で漬け, 乳酸菌や酵母などの微生物による発酵させることによっ て作られる日本の伝統的な漬物である。本研究では微生物発酵の仕組みを理解することを目的に, 沢庵漬けの本漬けの過程における糠床中の細菌叢の変化及び沢庵漬け内のメタボライトの変化を, 16S rRNAクローンライブラリー解析, RT-PCRにより細菌数の定量及びCE-TOFMSによるメ夕ボロー ム解析を行った。解析対象は本漬け開始から12ヶ月までのぬか床を1ヶ月おきにサンプリングした ものである。本漬け開始から2-3ヶ月で既に乳酸菌群が優占種となっていたが, その後発酵8ヶ月か ら9ヶ月目までは急激に細菌数も上昇する事が明らかになった。一方で発酵開始直後から3ヶ月目 まではLactobacillus sakeiが増殖しているものの, 8ヶ月では既にLactobacillus malefermentasやPediococcus inopinatusなどが増殖している事がわかった。乳酸菌の菌種の入れ 替わりによって生じる違いを考察するため, これらの菌を単離し培養を行った。また発酵開11ヶ月以降ではMarinomonas属, Halomonas属など, Oceanospirillales目の細菌がサンプル中20%-70%を占める程に増殖していた。 これらの好塩菌はキムチ漬けからの報告はあるが, 日本の漬物からは分離されておらず, 沢庵漬け の発酵におけるこれらの菌の役割が注目される。近縁の細菌では抗菌作用を持つ例もあるので, 糠からこれらの菌を分離し, 種同定と抗菌活性等についての解析も行ってメタボローム解析の結果と共に議論したい。 慶應義塾大学湘南藤沢キャンパス先端生命科学研究会 2013年度学生論文集 卒業論文ダイジェスト Technical Report http://koara.lib.keio.ac.jp/xoonips/modules/xoonips/detail.php?koara_id=KO92001004-00000020 -0158.

卒業論文ダイジヱスト. 微生物叢解析及びメ夕ボローム解析から探る沢庵漬けの発酵過程の解明. 環境情報学部4年 71041406 梅 田 栄 美. 11Q14Qeu@sfc.keio.ac.jp. 要旨 沢庵漬けは 大 根を干して米糖と塩で漬け，乳酸菌や酵母などの微生物による発酵させることによって作 ら れる日本の伝統的な漬物である . 本 研 究 で は 微 生 物 発 酵 の 仕 組 み を 理 解 す る こ と を 目 的 に ，沢庵漬 け の 本 漬 け の 過程に お け る 槺 床 中 の 細 菌 叢 の 変 化 及 び 沢 庵 漬 け 内 の メ タ ボ ラ イ ト の 変 化 を ， 1 6 S r R N A クローンライブラリー解析， R T - P C R により細菌数の定量及び C E - T O F M S によるメ夕ボローム解析を行 った . 解 析 対 象 は 本 漬 け 開 始 か ら 1 2 ヶ月までの ぬ か 床 を 1 ヶ 月 お き に サ ン プ リ ン グ し た も の で あ る .本 漬 け 開 始 か ら 2 - 3 ヶ月で既に乳酸菌群が優占種となっていたが、 その後発酵 8 ヶ月から 9 ヶ月目までは急 激 に 細 菌 数 も 上 昇 す る 事 が 明 ら か に な っ た . 一方で 発 酵 開 始 直 後 か ら 3 ヶ月目までは Locto わadZ/ws•soto' が増殖しているものの， 8 ヶ月では既に Ldぬ. m a/e/ermento や尸etftococcws. などが増殖し. て い る 事 が わ かった . 乳酸菌の菌種 の 入 れ 替 わ り に よ っ て 生 じ る 違 い を 考 察 す る た め ， これらの菌を 単 離 し 培 養 を 行 っ た . ま た 発 酵 開 1 1 ヶ月以降では M arinom onos ： 属 ， //a/omonas属など、 目の細菌がサンプル中 2 0 % ~ 7 0 % を 占 め る 程 に 増 殖 し て い た .こ れ ら の 好 塩 菌 は キ ム チ 漬 け か ら の 報 告 はあるが， 日本の漬物からは分離されておらず、沢庵漬けの発酵に お け る こ れ ら の 菌 の 役 割 が 注 目 さ れ る. 近 縁 の 細 菌 で は 抗 菌 作 用 を 持 つ 例 も あ る の で 、糠 か ら こ れ ら の 菌 を 分 離 し ，種同定と抗菌活性等. についての解 析 も 行 っ て メ タ ボ ローム解 析 の 結 果 と 共 に 議 論 し た い .. 158.

1 . 背景 1 .1 発 酵 食品と微生物. 漬 物 は 日本の伝 統 的 な 発 酵 食 品 で あ り ，米糖に含まれる麹や乳酸菌が主にデンプンやタンパク 質 を分解し，糖分や乳酸が生成されていると考えられているが，野菜の種類や地域の違いによって様々 な製法が存在し， 味 の 違いも大きい . 昔は各家庭で日常的に漬物をっけて食しており， それだけ古くか ら 日 本 人 に 親 し ま れ た 発 酵 食 品 で あ る と 言 え る .し か し 漬 物 に お い て は そ の 発 酵 の 詳 し い 仕 組 み は 明 らかになっていない . J u n g らによって行われたキムチのメタゲノム解析では，発酵が進むにつれてシー クエンスされた配列のコピー数は増え， それとともに乳酸， 酢酸， マニトールの濃度が上昇しているこ とが報告されている [ 1】 . こ の 時 優 位 な 細 菌 は ム ^ 〇 6 〇〇7/奶， 肠 如 e//a な ど で あ っ た . こ のことから， 乳 酸 菌 が 漬 物 の 発 酵 に お い て 主 な 働 き を に な っ て い る こ と は 間 違 い な い を 言 え る.漬 物 以 外 の 日 本 の 伝 統的な発酵技術では， 味噌， 醤油， など様々な発酵食品の研究がなされているが [2 ]， 日 本 酒 の 発 酵 の 研究も多くなされている [ 3 ] . 味 噌 や 醤 油などは大豆の発酵であるのに対し， 日本酒は米 の発酵であるが， その日本酒の発酵過程においては乳酸菌が製造の暖気入れと呼ばれる工程で増殖 し，発酵 が 進 むと作られた乳酸菌によって産生が強くなり， 乳 酸 の 増 殖 が 弱 り 始 め る .そ こ で 酵 母 を 添 加 し ， その生成するアルコールによってさらに乳酸菌は減っていく， という発酵のメカニズムが知ら れている .. このように発酵が進むに連れて細菌叢が変化しており， その影響で食品の成分も大きく変化. し て い る.こ の ことから発 酵 食 品 の 味 や 香 り に も 微 生 物 細 菌 叢 が 重 要 な 役 割 を に な っ て い る 事 が わ か る.. 1.216S rRNAクローンライブラリー解析 1 6 S r R N A クローンライブラリ一法は次世代シーケンサーを用いて行う微生物叢解析において主. 流 の 手 法 で あ る .本 手 法 の 最 大 の 利 点 は 培 養 を 介 さ ず に サ ン プ ル に 含 ま れ る 微 生 物 を 推 定 す る こ と が 出来るという点である .. この手法により， 非常に多くの難培養性微生物についても解析対象とするこ. とができる . 1 6 S r R N A ク ロ ー ン ラ イ ブ ラ リ 一 法 で は サ ン プ ル か ら D N A を抽出後， D N A の 1 6 S r R N A 遺 伝 子 （1 6 S r D N A ) の 一 部 を P C R によって増幅し， それをクローニングしたあと配列を解読すること でサンプル 中 の微生物群衆の解析し推定を 行う [ 4 ] . 1 6S s R N A の配列は非常に保存性が高く，難培養 性 の 微 生 物 も 含めた広範囲 の 生 物 に お い て 共 通 の プ ラ イ マ ー の 作 成 が 可 能 で あ る [ 1 0 ] . そ の た め 16S r D N A は生物種の同定や進化系統分析にも頻繁に使われているが， こ の 16S r D N A クローンラーブラ. リ ー 法 に よ り 難 培 養 性 の 微 生 物 も 含 め た 環 境 サ ン プ ル 中 の 微 生 物 叢 を 正 確 に 知 る 事 が 可 能 に な る.本 研 究 で は 他 機 種 に 比 べ て 長 い リ ー ド を 得 る こ と が 出 来 る と い う 理 由 か ら R o c h e 社製 4 5 4 G S J r を用いて シーク エ ン シングが行われている . こ の 手 法 で は サンプル中に含まれる細菌を網羅的に推定することができ， その細菌叢を観察するのに 適している . そ の 一 方 で サ ン プ ル に 含 ま れ る 細 菌 の 絶 対 数 は わ か ら な い と い う 問 題 点 が あ る.し か し 発 酵過程の観察においては細菌数がどのように変化しているのかという点は非常に重要であり，細菌数の 変 化 を 考 慮 し な い で 発 酵 過 程 に っ い て 考 察 す る こ と は 難 し い.そ こ で 本 研 究 で は 沢 庵 漬 け の 発 酵 過 程 において細菌数がどのように変化していくのかを R e a l T i m e P C R (R T -P C R )を用いて定量的に観察するこ とで，実際 に 発酵がどのように進んでいる のかを考察した .. 2 . 対象と手法 2 .1 対象 159.

山 形 県 鶴岡市の月山パイロットファームでは沢庵など漬物を中心に野菜の発酵食品を製造して いる . 本 研 究 で 発 酵 さ せ る 時 間 ま た は 空 間 的 違 い に よ り 生 じ る 細 菌 叢 の 特 徴 を 探 る こ と を 目 的 に ，野 菜 の 発 酵 食 品 の 16S r R N A ク ロ ー ン ラ イ ブ ラ リ ー 解 析 を 行 っ た .解 析 対 象 と し た の は 大 根 沢 庵 の 本 漬 けから 0 , 1 ， 2 ,3 , 8 , 9 , 1 0 ， 11， 1 2 ヶ月間経過した沢庵である . T a b l e 1 . 本解析に用いた各サンプルの詳細. ■ 、. Position. I v r m e m a n o n 〇〇： <^1. 純. 供. 0M. IM. Simple 0.25. B i ». 0.25 2011.12 J 2-2012.2.2S. 2M. 一. ハ.1. ^. 乂 ：. 一. 201 U. —. 2011,12.12^2012,9.19. ^ i ! !.!.： .；?. 0,25 ■. 0.2 5 0J. 2 J 2 » 2 0 1 2 . 6 .25. 沾 ！ 9M. ilill： ! !I M ：. 2 .3. 2J 2-2012J 0J 0. _1_ 丨 !1|1:3丨議議_ _ _ _ _ _ _ 画. ^. 201U. 一. 2 0 1 1 . 1 2 J 2 - 2 0 I2 J I .2?. 0J. 一. 2 0 1 1 . 1 2 J 2 - 2 0 1 2 J 2.21. 0J. シークェンスデータの系統解析 シ ー ク ェンスデ一夕のクオリティ値の評価などの配列選択や， O T U 作 成 ， アラインメント，及. び 配 列 の 分 類 には，配 列 解 析 の 統 合 ソ フ ト で あ る Q ii m e ( h ttp ;// q iim _e_， o r g ) を用いた [6 ]. F i g 1 に示す の は 行 っ た 配 列 処 理 の フ ロ ー チ ャ ー ト で あ る • まず始めに， プライマー及び各サンプルごとに付けら れ た タ グ 配 列 の 認 識 ， す べ て の シ ー ク ェ ン ス デ ー タ の ク オ リ ティチヱック及び短い配列を行う•ク オ リ ティー値は最低スコアを 2 5 とし， また長さが 2 0 0 b p 以 下 の 配 列はすべて取り除いた . O T U 作成におい ては， U C L U S T のアルゴリズムを用いて [7 ] ，配列類似性 の ス レ ッ シ ュ ホ ー ル ド は 0 . 9 7 とした.アラ イ ンメントにはアラインメントツールである P y N A S T を用いた [8 ].こ れ は テ ン プ レ ー ト と な る 配 列 を デ 一 夕セットから選び， そのテンプレート配列に対してすベての配列でペアワイズアラインメントをとって い く 手法である . テンプレートのデ一夕セットには g r e e n g e n e s (h ttp :/ / g r e e n g e n e s .lb l,g o v ) を用 V ゝ [9 ]， ペアワイズアラインメントには u c lu s t のアル ゴ リ ズ ム を 用 い た . O T U の系統分類には， R D P の C la s s ifie r を 用 い た [ 1 0 ] . なおこの時，配 列 の 類 似 性 が 9 7 % 以上の も の を 分 類 で き た と し た .. F i g 1 •バクテリアの系統解析 のフローチャート. 160.

3 •結果と 考察 3 .1 バクテリアの系統. _. F ig 2 は作成した O T U を 門 レ ベ ル で 分 類 し た 結 果示している .既存のデータベースとの類似 性 が 9 7 % 以上のも ののみを分類できたとみなし， それ未満のものは ” O t h e r 」’ の後に門以上のレベルで分類. できて い る 結 果を示した . 分 類 で き た も の の 内 ，割 合 の 多 い 1 5 門を色分けし， その他の全体に占める 割 合 が 少 な い ものは O T H E R としてまとめた . 没 の 存 在 が 多 く 確 認 さ れ た .. バクテリアの系統解析において， 0 -3 ヶ月のサンプルで. これはバクテリアではなく，広 義の緑色植物の分類群である .. バクテリアのシークェンスをしているにも関わらず； 植物の D N A が検出された理由としては，発酵初期 段階においてはまだバクテリアが増殖しておらず； その D N A 量 が 少ないために，米ぬかの D N A が混入. X L まっナこのではないかh 考 え ら れ る .. し. るが分類されている .. Cyanobacteria, Chlorvplast，Chroococcales も 少 量 で は あ. まナこ. これらに関しても同様に米ぬか D N A の混入により観察されたのではないかと考. えられる • そのためこの図から，. Straptophyta，Cyanobacteria ，Chloroplast， Chroococcales <0べ つ の 分 摄. 卷. を 取 り 除 い て 同様に積み上げグラフを作成した . グラフから， すべてのサンプルにおいて全体の 9 0 % 以 上 を 分 類 で き ている事がわかる .. この結果から 0 M か ら 1 2 M までの最初の 1 年 間 の 発 酵 で は ，細菌叢の. 変 化 が 多 く 見 ら れ ， 2 年や 3 年 の長期発酵ではあまり大きな細菌叢の変化が見られないという結果を 得 た.. ム妨〇んぬ7/a/が は 0 M 時点ではほとんど存在していないが， 1 ヶ月たった 1 M のサンプルでは急激に. そ の 割 合 が 増 えており既に優占している .このこと か ら 乳 酸 菌 は 沢 庵 漬 け の 発 酵 に お い て 重 要 な 役 割 を 担 っ て いることが予想される . 発 酵 の 後 半 段 階 で あ る 1 1 M 以降ではまたその割合は減少しており，逆 に が の 割 合 が 増 加 し て い る .. は海洋性の好塩菌であり，通常食品から. 検 出 は さ れ な い .以 上 の こ と か ら. Lactobacilkdesと OseanosDirillalesの 2 点 に 注 百 'L X 解 析 を 行 っ ナ こ. 100%. i. '.W. 90%. SjMinlsj^aerates. 欲 OTHER. ::. ¥ BuHdK>ldef1a!es ^ Pseudomonadaies ^ Acttnomycetates ^ Flavobaderiates ：s Rhfeoblales. I 30%. f. I I I* f l f. ■. ■. ■. l. l. ^. I. l. l. ^ Sphingomonada)e$. ^ Atterom<mddates ^ Ent*M*obacleriales. 1. 20%. 10%". 1. 1. 1. 1. 1. ^ Other^Sacterta 嫌 BaciHales. to%. 和. 0%私. 1. tx% 2. 3. 8. 9. XQ. ax. 12. 0. 月数. A. 1. 1. 1 2. 1 3. 1 8. 月数. 1. 1. 9. 10. ^Oceanospirilbles 嫌. u. 12. Uctobadliates. 雠 Other-Unclassified. B. Fig 2 . 各サンプルごとにバクテリアの OTU を門 レ ベ ル で 分類した推定結果から. Straptophyta，Cyanobacteria，Chloroplaist， Chroococcales を 取 ^)餘 い ナ こ も の. 割合の多い上位 15 の分類群を色分けし， その他の分類群は OTHER としてまとめた.. 161.

3 . 2 発酵過程 に おける乳酸菌の変化 F ig 2 か ら わかるように， 乳 酸 菌 ( ム妨0 み a d / t o M は 発 酵 開 始 か ら 1 ヶ月で既に優占種となってい. る が 実 際にその細菌数が増加しているかは確かめられない . そのため R T - P C R を用いて細菌数の定量を 行 い ， さらにム妨〇6 奶 7ゎ/がを属レベルで分類した ( F i g 3 ) . グラフから乳酸菌の細菌数は発酵開始か ら 8 ヶ， 9 月目まで に 急激に増えており，逆 に そ れ以降は減少していることがわかる .. また発酵開始から 3 ヶ. 月目までは Zewcowo伽 cge/zWwwや な ど が 優 占 種 と な っ て い る の に 対 し ， 8 ヶ月目以降で は. JPediococcus inopinatusや Lactobacillus melefermentansが 優 占 種 と な り ， 細 菌 種 の 入 れ 替 わ り が 起 き X い. る.. ma/ が r m e n to r a は へ テ ロ 発 酵 を 行 う 乳 酸 菌 で あ り ， ビールのから 単 離されている. [ 1 3 ] . ム 加 ftadZ/ws伯たd. も へ テ ロ. 発 酵 を 行 う乳酸菌であり， ヨーロッパでは古くからソーセージの製. 造 や 精 肉 の 保 存 に 利 用 さ れ て い る [1 4 】 .. Je/ft rwecた /z•はヨーグルトなどの発酵に頻繁に使わ. れ る 乳 酸 菌 で あ り ， ホ モ 乳 酸 発 酵 を 行 う [ 1 5 】. ま た i^cto6ac///w1sか. /以 /vonm s ヘ テ ロ 発 酵 を 行 い ， アル. コール強いことで知られている.そのため日本酒などに入り込むと酸イ匕を起こし濁りや臭みを生じさせ る[1 6 】 . ま た 味噌やケチャップにもコン夕ミすることで腐敗を起こすとされている [1 7 】 . また と同様に尸汉 /iococcw s も8 ヶ月経過以降のサンプルでは安定して多く観察されされている . Pe ぷ0 ⑶ は グ ラ ム 陽 性 の 四 連 球 菌 で あ り ， 乳 酸 の 他に C 0 2 ， アルコール，酢酸などの副産物を多量. に つ く る へ テ ロ 発酵を行う細菌属である . ま た 複 数 の 属 の 細 菌 種 が 乳 酸 の ラ セ ミ 体 （ D L 体) を発酵することでも知られている [ 1 8 ] [ 1 9 ] . 乳 酸 菌 の ラ セ ミ 体 は 融 点 が 低 く ，常温でも粘り気があるの が 特 徴 で あ る . 今 回 発 見 さ れ た /W/OCOCCMS /«0/W>2<3加 は ビ ー ル か ら 単 離 さ れ て お り [2 0 】 ， この細菌が発 酵途中のビールにコンタミするとジアセチルの濃度が高くなり，香りが損なわれることが知られている [ 2 1 ] . ジアセルはバターやチーズの匂いの元になっている物質であり， これがキユウリの漬物では感じ. ないような沢 庵独特の香りを作っていると考えられる . れているのが^. さらに 8 ヶ月以降のサンプルで次に多く観察さ. で あ る .は 海 洋 中 や 夕 イ 料 涅 の カ ピ と 呼 ば れ る 小 ェ ビ の 塩. 漬 け か ら 見 つ か っ て い る 耐 塩 性 の 乳 酸 菌 で あ る .こ の よ う に 乳 酸 菌 の 種 類 や 増 減 が 沢 庵 漬 け の 発 酵 過 程 ，及 び 味 を 決 定 づ け る の に 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る 可 能 性 が 高 い こ と が 示 さ れ た .. 162.

350. obadHaceae. は. 300 250. 200 150. 100 1111. 50. 0. 月数 A. 1. 2. 3. 8. 9 101112. 月数. Leuconostocaceae lactococcos WeisseHd Leuconostoc ' f_leuconostocaceae 凝 Pediococcus ■ Lactobacillus 纖 Otheし Lactobacil丨 aceae ^Tetragenococcus 雜 Enterococcus ^ Other^Enterocoaaceae Carnobacteiium arinitactibaciltus ^Alkaiibaaerium ■ o— laaobaciilales ^ Other_laa 〇bacillales. B. F ig 3 . 各 サ ン プ ル ごとに ム actofeaczY/a/esのO T U を属 レ ベ ル で 分類した推定結果に R T - P C R によって得られた細菌数を反映させた .. 3 .3. Oseanospinllales 先 程 も 述 べ た よ う に ， O 從 門 の 細 菌 は 海 洋 性 の 好 塩 菌 で あ り ，通 常 は 食 品からは検. 出されない . そ こ で 啊. >/此 /烈門の細菌がサンプル中で増えている生物学的意味を探るため， 乳. 酸菌と同様に 1 0 ^ € 1 1 を 用 い て 細 菌 数 の 定 量 を 行 っ た 奶 8 4 ) . その結果， ひ^ « 〇^> 7 7 仏/以門の細菌は 11 ヶ月目， もしくは 1 2 ヶ月目以降に急激にその細菌数を増やしていることがわかった . （ 91sea« 〇 1s'/?z>///a/e1s 門の細菌のほとんどが MaWwomowos 属 で あ る こ と が わ か っ た . M aW wom om s 属 の 細 菌 に は ，抗菌作用を 持 つ も の も 知られており [20 ]，沢庵漬けの後期の発酵において他の細菌の増殖を抑える役割を果たして いる可能性がある .. 1 .0 0 E + 0 9. y g-JViarinwnonas ^ Other 8 .0 0 E + 0 8. g— Kushneria Halomonas. ^. 6 .0 0 E + 0 8. ^ gHaererehalobacter. ^g«jCc^>etia. 観 P. 級. 4 .0 0 E + 0 8. g一 Chromohalobacter. 鑛 級. 2 .0 0 E + 0 8. Other. 纖. g一. 鑛. Other. 和. canivorax. 0.00E+00. 月数. 月数. ///a fe s の O T U を属 レ ベ ル で 分類した推定結果に. F ig 3 . 各 サ ン プ ル ご と に Creams/? か. R T - P C R によって得られた細菌数を反映させた .. 163.

Acknowledgements 本 研 究 に お い てデ一夕を取るための実験を行ってくださり、 また解析においても多くの適切な アドバイスを下さった中東憲治氏に厚く御礼申し上げます。 またこのような研究の場を与えてくださつ た冨田勝教授に深く感謝いたします。 あ り が と う ございました。. 参考文献. et al (2 0 1 1 ) M eta g e n o m ic A n a ly s is o f K i m c h i,a Tra d itio n a l K o re a n Ferm ented Fo o d . Appl. Environ. Microbiol. 7 7 (7 ),2 2 6 4 .. 1 . Ju n g ,Y ,J., L e e ,H ?S .,. 2. C io u ,Y ,Y ,R o b in ., and C h e n g ,L ,S . (2 0 0 1 ) iso fla vo n e Tra n sfo rm atio n d u rin g Soybean K o ji Preparation and Subsequent M is o Ferm entation Supplem ented w ith Eth a n o l and N a C l .. J. Agric. Food Chem. 49,. 3 6 5 6 -3 6 6 0 3. L e ro y , Fred e ric, and V u y s t,D ,L u c . (2 0 0 4 ) L a c tic acid bacteria as functional starter cultures fo r the food ferm entation industry.. Trends in Food Science & Technology 1 5 ,6 7 -7 8 .. 4 . F u jim o to J . and F u k u ji JVI., (2 0 0 5 ) A n a ly s is if H u m a n Intestinal R o r a -1 6 S r D N A -C l o n e L ib ra ry. Intestinal Microbiology, 1 9 ,4 7 -5 2 .. 5. M u y z e r ,G ., D e W a a l,C ,E ., ef a/ (1 9 9 2 ) P ro filin g o f C o m p le x M ic ro b ia l Populations b y D e n a tu rin g G ra d ie n t G e l Electrophoresis A n a ly s is o f Polym erase C h a in R e a c tio n -A m p lifie d G enes C o d in g fo r 16S. Appl. Environ. Microbiol. 5 0 (3 ), 6 9 5 -7 0 0 . et al (2 0 1 0 ) Q I I M E a llo w s analysis o f h ig h - throughput c o m m u n ity sequencing data. Nature Methods. 7 (5 ),3 3 5 -3 3 6 . 7. E d g a r,C ,R . (2 0 1 0 ) Search and clustering orders o f m agnitude faster than B L A S T . Bioinformatics. 2 6 (1 9 ), rR N A .. 6. C a p o ra s o ,G ,J., K u c z y n s k i,J.,. 2 4 6 0 -2 4 6 1 .. et al (2 0 1 0 ) P y N A S T : a flexible to ol fo r a lig n in g sequences to a tem plate Bioinformatics. 2 6 (2 ), 2 6 6 -2 6 7 . 9. D e S a n tis ,Z ,T ., H u g e n h o ltz,P ., eta l (2 0 0 6 ) Greengenes, a C h im e ra -C h e c k e d 16S r R N A G e n e Database and W o rk b e n ch C o m p a tib le w ith A R B . ^4/?/?/. Environ. Microbiol. 7 2 (6 ),5 0 6 9 -5 0 7 2 . 10. W a n g ,Q ., G a r r ity ,M ,G ., et al (2 0 0 7 ) N a ive B a yesia n C lassifie r fo r R a p id A s s ig n m e n t o f r R N A Sequences into the N e w B acterial Ta x o n o m y . Appl Environ. Microbiol. 7 3 (1 6 ), 5 2 6 1 -5 2 6 7 . 11. R o m a n e n k o ,A ,L ., Ta n a k a ,N . and F r o lo v a ,M ,G . (2 0 09 J Marinomonas arenicola sp. n o v., isolated fro m m arine sedim ent. International Journal o f Systematic and Evolutionary Microbiology. 59, 2 8 3 4 -2 8 3 8 . 12. L u c a s -E l io,P., G o m e z ,D ., et al (2 0 0 6 ) T h e A n tim ic ro b ia l A c t iv it y o f M a rin o c in e , Synthesized by Marinomonas mediterranean Is D u e to H y d ro g e n P eroxide Generated b y Its L y s in e O xid ase A c tiv ity . American Society fo r Microbiology. 1 1 8(7 ), 2 4 9 3 -2 5 0 1 . 13. R u s s e ll,C . and W a lk e r,K ,T . (1 9 5 3 ) La cto b a cillu s m aleferm entans n.sp., Isolated fro m Beer. Journal o f the Society fo r General Microbiology. 8 ,1 6 0 -1 6 2 . 14. Jo n e s ,J,R ., H u s s e in ,M ,H ., et al (2 0 0 8 ) Isolation o f lactic acid bacteria w ith in h ib ito ry a c tiv ity against pathogens and spoilage organism s associated w ith fresh m eat. Food Microbiology. 25, 2 2 8 -2 3 4 . 8. C a p o ra s o ,G ,J., B ittin g e r,K ., alignm ent.. 15. Jo h n ,P ,R ” N a m p o o th iri,M . and P a n d e y,A . (2 0 0 6 ) Solid-state ferm entation fo r L -la c tic a d d p roduction fro m agro wastes u sin g La cto b a cillu s d e lb ru eckn .. Process Biochemistry. 4, 7 5 9 -7 6 3 . Journal o f the Institute o f. 16.S u z u k i,K ., A s a n o ,S ., et al (2 0 0 8 ) Sake and B e e r Spoilage L a c tic A c id Bacteria.. Brewing.. 1 1 4 (3 ), 2 0 9 -2 2 3 .. Lactobacillus Jructivorans Spoilage o f To m a to Journal o f Food Protection. 6 0 (5 ), 5 0 5 -5 0 9 .. 17. B jo rk ro th ,K ., Johanna; K o rk e ala, H a n n u J. (1 9 9 7 ) K e tc h u p .. 18. G o r d o n ,L ,G . and D o e lle ,W ,H . (1 9 7 5 ) P ro d u ctio n o f R a c e m ic L a c tic A c id in Pediococcus cerevisiae C ulture s b y T w o Lactate D ehydrogenases. Jo u rn a l o f B a cte rio lo g y. 1 2 1 (2 ), 6 0 0 -6 0 7 .. et al (1 9 8 2 ) P ro d u ctio n o f L - A N D D -la cta te b y Pediococcuspentosaceus in batch and steady-state continuous culture. Appl. Environ. Microbiol. 5 2 (1 ), 119-123.. 19. H a g g s tro m ,H ,M ., A n d e rs o n ,E -,. 164.

2 0 .L u c a s -E l io,P., G o m e z ,D .,. et al (2 0 0 6 ) T h e A n tim ic ro b ia l A c tiv it y o f M a rin o c in e , Synthesized b y. Marzwo/wcwas m editerranea, Is D u e to H y d ro g e n Peroxide Generated b y Its L y s in e O xidase A c tiv ity . Journ a l o f B acteriology. 118(7), 2 4 9 3 -2 5 0 1 .. 165.