17
3. BAHAN DAN METODE
3.1. Bahan dan Piranti 3.1.1. Bahan
Sampel yang digunakan adalah ampas teh hijau yang diperoleh dari kedai teh ‘T’ Salatiga.
Bahan kimia yang digunakan antara lain etil asetat (derajat teknis), metanol (derajat teknis), etanol (derajat teknis), petroleum eter (J.T. Baker), kloroform (Merck), NaCl (Oxoid LP 0005), Nutrient Broth (Merck), Mueller Hinton Agar
(Oxoid CM 0337), tetrasiklin 30 μg (Oxoid CT0054B), paper disc 6 mm (Whatman), plat KLT silika gel 60 F254 (Merck), iodonitrotetrazolium chloride (Fluka), HCl
(E-Merck), reagen Mayer, reagen Dragendorff, CH3COOH glasial (Merck), FeCl3
(E-Merck), H2SO4 (Merck), logam Mg (E-Merck) dan akuades.
Bakteri uji yang digunakan adalah Bacillus subtilis ATCC 6051, Escherichia coli IFO 0091 dan Staphylococcus aureus ID 784.
3.1.2. Piranti
Piranti yang digunakan adalah neraca 2 digit (Acis AD 300), neraca analitis (Mettler H 80), oven (WTB Binder 7200), shaker (Ika Labortechnik KS 501 digital),
rotary evaporator (Buchi R-114), waterbath (Memmert), spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu UV Mini 1240), lampu UV, mikropipet 10 μL (Eppendorf 3130), jangka sorong (Vernier Calipers 150 x 0,05 mm), enkas dan piranti gelas (erlenmeyer, gelas ukur, gelas kimia, corong, labu takar, cawan petri, botol sampel dan pipet).
3.2. Metode
3.2.1. Pengukuran Kadar Air (Anonim, 2000)
18
3.2.2. Ekstraksi dan Fraksinasi Ekstrak Ampas Teh Hijau (Erol dkk., 2009 yang dimodifikasi)
Sejumlah 200 gram ampas teh hijau diekstrak menggunakan 550 mL metanol 80 % dengan shaker selama 24 jam. Filtrat hasil penyaringan disimpan, sedangkan ampas teh dimaserasi lagi sebanyak 3x dengan volume metanol 80 % masing-masing 150 mL selama 1 jam. Semua filtrat yang diperoleh kemudian digabung dan dipekatkan menggunakan rotary evaporator pada suhu 40 OC hingga volumenya ±220 mL.
Fraksinasi ekstrak ampas teh dilakukan menggunakan petroleum eter dan etil asetat secara berurutan. Senyawa non polar diekstrak menggunakan corong pisah dengan pelarut petroleum eter (4x120 mL) dan disebut fraksi petroleum eter. Kemudian fraksi air dilakukan ekstraksi lagi dengan pelarut etil asetat (4x120 mL), ditambah Na2SO4 anhidrat lalu disaring sehingga diperoleh fraksi etil asetat yang
nantinya digunakan untuk uji selanjutnya. Skema metode dapat dilihat pada Lampiran 2.
3.2.3. Uji Antibakteri
3.2.3.1. Uji Antibakteri Fraksi Etil Asetat Ekstrak Ampas Teh Hijau dengan Metode Difusi Agar
Satu ose bakteri diinokulasikan ke dalam Nutrient Broth (NB) lalu diinkubasi selama 24 jam dengan shaker. Larutan Nutrient Broth yang mengandung bakteri dimasukkan ke dalam larutan NaCl 0,9 % sampai diperoleh kerapatan optik / optical density (OD) antara 0,4-0,5 pada panjang gelombang 550 nm (Collins dkk., 1998).
19
3.2.3.2. Uji Antibakteri Fraksi Etil Asetat Ekstrak Ampas Teh Hijau dengan Metode Bioautografi
Fraksi etil asetat ekstrak ampas teh hijau ditotolkan pada plat silika lalu dielusi dengan fase gerak kloroform : metanol : akuades (6,5 : 3,5 : 1 v/v/v) (Amarowicz dkk., 2003). Setelah plat dikeringkan kemudian disemprot dengan suspensi bakteri dalam medium NB (OD550nm = 0,5). Plat diinkubasi pada suhu 37 OC selama 24 jam
dalam cawan petri atau bejana tertutup yang dasarnya telah diberi kapas basah. Visualisasi dilakukan dengan bantuan pewarna iodonitrotetrazolium (INT) 5 mg/mL yang disemprotkan pada kromatogram. Permukaan kromatogram yang ditumbuhi bakteri akan berwarna merah-ungu, sedangkan senyawa yang bersifat sebagai antibakteri akan menghasilkan spot putih. Spot senyawa antibakteri dihitung nilai Rf-nya (Nostro dkk., 2000).
3.2.4. Skrining Fitokimia Fraksi Etil Asetat Ekstrak Ampas Teh Hijau (Ciulei dalam Siregar dkk., 2001)
a. Identifikasi Alkaloid
Fraksi etil asetat pekat dilarutkan dalam HCl 1,5-2% kemudian larutan dibagi dalam 3 tabung. Tabung A ditambah 0,5 mL asam encer, tabung B ditambah 2-3 tetes reagen Mayer dan tabung C ditambah 2-3 tetes reagen Dragendorff. Endapan kekuningan pada tabung B dan jingga tua pada tabung C menunjukkan adanya alkaloid.
b. Identifikasi Kumarin
Fraksi etil asetat pekat dilarutkan dalam air panas, setelah dingin larutan dibagi dalam 2 tabung. Tabung A sebagai kontrol sedangkan tabung B ditambah 0,5 mL NH3 10 %. Timbulnya pijaran yang kuat dibawah sinar UV
menunjukkan adanya senyawa kumarin dan turunannya.
c. Identifikasi Flavonoid
20 d. Identifikasi Tanin
Fraksi etil asetat sejumlah 0,5-1 mL ditambah 1-2 mL akuades lalu dibagi dalam 2 tabung reaksi. Tabung A sebagai kontrol, sedangkan tabung B ditambah 2-3 tetes larutan FeCl3. Larutan berwarna biru kehitaman atau hijau
kehitaman menunjukkan adanya tanin.
e. Identifikasi Minyak Atsiri
Fraksi etil asetat diuapkan hingga kering, jika berbau harum maka residu dilarutkan dalam etanol. Larutan etanol tersebut dikeringkan. Jika residu berbau harum menunjukkan adanya minyak atsiri.
f. Identifikasi Saponin
Fraksi etil asetat ditambah dengan akuades (1:1) lalu dikocok selama 5 menit. Adanya gumpalan busa minimum 1 cm tingginya yang bertahan minimum 15 menit menunjukkan adanya saponin.
g. Identifikasi Sterol dan Triterpen
Fraksi etil asetat kering dilarutkan dalam 0,5 mL asetat anhidrida lalu ditambah 0,5 mL kloroform kemudian dibagi dalam 2 tabung. Tabung A sebagai kontrol, sedangkan tabung B ditambah 1-2 mL H2SO4 pekat pada
dasar tabung. Adanya cincin berwarna merah kecoklatan atau ungu kecoklatan dan lapisan atas berwarna hijau kebiruan atau ungu menunjukkan adanya sterol dan triterpen.
