Lampiran1. Bagan Alir Penelitian
Pengambilan sampel spons dari perairan Pulau
Ngge Sibolga
Isolasi dan pemurnian bakteri simbion spons
Uji antibakteri isolat terhadap bakteri patogen
secara in-vitro
Ekstraksi metabolit sekunder isolat bakteri potensial secara bertingkat (n- heksana, etil asetat dan
metanol)
Skrining aktifitas ekstrak n-heksana, etil asetat dan
metanol.
Skrining komponen senyawa ekstrak potensial
Pemisahan golongan senyawa metabolit sekunder
ekstrak isolat potensial dengan KLT
Lampiran 2a. Isolasi dan Pemurnian Bakteri Simbion
Sampel dihaluskan
Sampel yang telah halus diambil 1 gr
Dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 9 ml air laut
steril
Dilakukan pengenceran bertingkat
Diambil 1 ml
Diinokulasi pada media nutrien agar
Inkubasi selama 2x24 jam
Diinokulasi kembali pada media nutrien agar
A1 A3
A4 A5
A6 A7
A8
Lampiran 3a . Bagan Alir Uji aktifitas Antibakteri
Terhadap bakteri patogen
secara in-vitro heksana, etil asetat dan Terhadap ekstrak n-metanol.
Terhadap fraksi ekstrak n-heksana, etil asetat dan
metanol. Uji Aktivitas Antibakteri
Isolat bakteri disubkultur pada media
NA
Hasil subkultur diambil dengan ose dan dilarutkan dalam
air laut steril
10 μl suspensi bakteri simbion diteteskan pada cakram oxoid
Cakram oxoid diletakkan pada media
NA yang diinokulasi dengan bakteri uji
Inkubasi 24-48 jam
Pengukuran zona hambat (mm)
Inokulasi 200 µl suspensi bakteri uji ke
dalam media nutrien agar
Cakram oxoid yang telah ditetesi 10 µl dari masing-masing ekstrak n-Heksana, Etil asetat
dan Metanol diletakkan pada media
NA yang telah diinokulasi suspensi
bakteri uji
Inkubasi selama 24 jam
Pengukuran zona hambat (mm)
Inokulasi 200 µl suspensi bakteri uji ke
dalam media nutrien agar
Cakram oxoid yang telah ditetesi 10 µl dari
masing-masing fraksi ekstrak n-Heksana, Etil
asetat dan Metanol diletakkan pada media
NA yang telah diinokulasi suspensi
bakteri uji
Inkubasi selama 24 jam
Lampiran 3b. Pengujian Isolat Bakteri Terhadap Bakteri Uji
1.
Pengujian Isolat Bakteri Terhadap
S.aureus
2. Pengujian Isolat Bakteri Terhadap
E. coli
3. Pengujian Isolat Bakteri Terhadap
P. Aeruginosa
A3
A9 A8
H2 H3
H1
A1
A4 A2
A3
A9 A8
Lampiran 3c.
Pengujian Ekstrak N-Heksana, Etil Asetat dan Metanol dari Isolat
HH2, A9 dan A10 Terhadap Bakteri Uji
S.aureus, E.coli
dan
P.
aeruginosa
1.
Ekstrak Isolat H2 Terhadap
S.aureus
2
.
Ekstrak Isolat H2 Terhadap
E. coli
Ekstrak Isolat H2 Terhadap
P. aeruginosa
Ekstrak Isolat A1 terhadap
S.aureus
Ekstrak Isolat A1 terhadap
E. coli
Ekstrak isolat A1 terhadap
P. Aeruginosa
MH2HH2 EH2
EH2
MH2
HH2
MH2
EH2 HH2
MA1
HA1 EA1
EA1 EA1
MA1 MA1
Ekstrak Isolat A2 Terhadap
S.aureus
Ekstrak Isolat A2 Terhadap
E. coli
Ekstrak Isolat A2 Terhadap
P. Aeruginosa
MA2
HA2 HA2 EA2
HA2 EA2
MA2
MA2
Lampiran 4a. Bagan Alir Ekstraksi Metabolit Sekunder dari Isolat Bakteri
Dipotong kecil- kecil
Maserasi selama 3 x 24 jam dengan n-Heksana
Penyaringan
Ekstrak etil asetat
Ekstrak metanol
Penyaringan
Maserasi selama 3 x 24 jam dengan etil asetat asetat
Maserasi selama 24 jam dengan metanol
Penyaringan Kultur isolat bakteri
Lampiran 4b. Ekstraksi Metabolit Sekunder dari Isolat Bakteri Potensial
1.
Kultur bakteri H2 yang dimaserasi pada pelarut ekstrak n-heksana, etil
asetat dan metanol
2.
Kultur bakteri A1 yang dimaserasi pada pelarut ekstrak n-heksana, etil
asetat dan metanol
3.
Kultur bakteri A2 yang dimaserasi pada pelarut ekstrak n-heksana, etil
asetat dan metanol
Lampiran 5a. Bagan Alir Uji Senyawa Metabolit Sekunder Ekstrak
n-Heksana, Etil asetat dan Metanol Isolat Potensial
- Ditambahkan 5 ml aquades dan kloroform lalu dikocok dan biarkan beberapa saat sampai terbentuk dua lapisan (Lapisan air untuk uji flavonoid, fenolik dan saponin sedangkan lapisan kloroform untuk uji terpenoid dan steroid)
Ekstrak
Lapisan air Lapisan kloroform
Uji flavonoid
Uji fenolik
Uji saponin
Uji terpenoid
Uji steroid
Lapisan air
Terbentuk warna jingga, merah muda sampai merah
Bagan Alir Uji Flavonoid
-
Ditambahkan 1-2 butir logam magnesium dan
beberapa tetes asam klorida pekat
1.
Bagan Alir Uji Fenolik
-
Ditambahkan 1-2 larutan FeCl
31%
2.
Bagan Alir Uji Saponin
-
Dimasukkan ke dalam tabung reaksi
lalu dikocok
Lapisan air
Terbentuk warna biru/ungu
Lapisan air
3.
Bagan Alir Uji Terpenoid dan Steroid
-
Dilakukan penyaringan terhadap lapisan kloroform melalui
pipet yang ujungnya diberi kapas
-
Dipipet sebanyak 2-3 tetes dan biarkan mengering pada plat
tetes
-
Ditambahkan pereaksi Lieberman-Burchard (2 tetes asam
asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat)
4.
Bagan Alir Uji Alkaloid
-
Ditambahkan 10 ml larutan kloroform beramoniak 0,05 M
-
Diaduk kemudian disaring dan dimasukkan ke dalam tabung
reaksi.
-
Ke dalam tabung reaksi tersebut ditambahkan 1 ml asam sulfat
2 N, dikocok selama 2 menit dan dibiarkan hingga terbentuk
dua lapisan dan terjadi pemisahan.
-
Lapisan asam (bagian atas) diambil dan ditambahkan 1-2 tetes
pereaksi Mayer atau pereaksi
Dragendorff
Lapisan kloroform
- Terbentuk warna merah (terpenoid) - Terbentuk warna hijau-biru (steroid)
Ekstrak
Lampiran 5b. Hasil Uji Senyawa Metabolit Sekunder Ekstrak n-Heksana,
Etil asetat dan Metanol Isolat Potensial
Gambar: Uji alkaloid Ekstrak isolat EA1 dan EH2
Gambar: Uji Alkaloid Fraksi MA2F3, MA2F2, MA1F3 dan EH2F3
Gambar: Uji saponin ekstrak isolat Uji saponin MA2F2 dan MA2F3
EA1F3 EA2F3
EA2F3 MA1F33
MA2F2 MA2F3
MA2F2 MA2F3
Lampiran 6. Bagan Alir Proses Identifikasi Golongan Senyawa Metabolit
Sekunder Ekstrak Isolat Potensial dengan Kromatografi
Lapis Tipis (KLT) Preparatif
1.
Pembuatan Kromatografi Lapis Tipis
2.
Pemisahan Senyawa dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Bahan
- Disiapkan plat kaca ukuran 20x20 cm
- Diletakkan plat kaca tersebut diatas alat pencetak plat KLT sekaligus alat pengukur ketebalan plat (ukuran 1mm)
- Disiapkan bubur silica, lalu tuangkan pada plat kaca sampai merata sambil terus diaduk
- Setelah bubur silica rata, dibiarkan pada suhu ruang selama ±12 jam - Diaktivasi plat dengan cara memanaskan pada suhu 100 oC dalam oven
selama ± 30 menit.
KLT Preparatif
KLT Preparatif
- Chamber dijenuhkan dengan pelarut pengembang (EtOAc:MeOH, 3:2 v/v) yang dilapisi dengan kertas saring
- Di masukkan pelarut pengembang kedalam chamber sampai kertas saring basah oleh pelarut.
- Larutan ekstrak metabolit sekunder isolat bakteri ditotolkan pada garis bawah batas bawah plat
- Plat dibiarkan kering selama ± 15 menit
- Dimasukkan plat kedalam chamber yang sudah jenuh dan dielusi sampai pelarut mencapai bagian atas plat
- Noda yang terbentuk diamati dibawah sinar UV, lalu digambar pola pemisahan dengan menggunakan pensil
- Dikerok pola noda yang telah digambar lalu dimasukkan ke dalam vial lalu dicuci dan dipisahkan dari silikanya.
- Masing-masing senyawa yang dihasilkan diuapkan.
