25
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Populasi dan Sampel 1. Populasi
Tikus putih betina umur ±2 bulan, berat 150-200 gr dan belum pernah bunting.
2. Sampel
16 ekor tikus putih betina yang diberi perlakuan ekstrak daun tanaman kenari.
B. Waktu dan tempat Penelitian
1. Penelitian ini ini dilakasanakan pada bulan Oktober2016-November 2016
2. Tempat penelitian
a. Pembuatan ekstrak daun tanaman kenari (Canarium indicum L.) dilakukan di Laboratorium Farmasi Unit II UGM.
b. Pemeliharaan tikus dilakukan di Unit Pengelolaan Hewan Laboratorium Biologi FMIPA UNY.
c. Pembedahan tikus putih dilakukan di Unit Pengelolaan Hewan Laboratorium Biologi FMIPA UNY.
d. Pembuatan preparat histologik organ dilakukan di Laboratorium Patologi FKH UGM.
26
e. Pengamatan preparat histologik endometrium dilakukan di Laboratorium Mikroskopik Jurdik Biologi FMIPA UNY.
C. Variabel
1. Variabel bebas
Ekstrak tanaman daun kenari dengan dosis perlakuan : P0 : 0 mg (kontrol)
P1 : 200 mg/ekor/hari P2 : 300 mg/ekor/hari P3 : 400 mg/ekor/hari 2. Variabel tergayut
a. Jumlah kelenjar endometrium tikus putih betina b. Ketebalan lapisan endometrium tikus putih D. Rancangan Penelitian
Penelitian ini adalah penelitian eksperimen dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL). Terdiri atas 3 kelompok perlakuan dan 1 kelompoksebagai kontrol dengan masing-masing kelompok terdiri 4 ekor tikus putihsebagai ulangan. Pemberian esktrak dauntanaman kenari dengan volume 4 ml perhari (2 ml di pagi hari dan 2 ml di sore hari) untuk 1 ekor tikus sesuai dengan dosis masing-masing perlakuan selama 21 hari secara oral, yaitu sebagai berikut :
27
1. Kontrol =Kelompok tanpa perlakuan ekstrak daun tanaman kenari (Canarium indicum, L.) 0 mg/ekor/hari dan diberi
perlakuan aquadesh 4 ml/ekor/hari.
2. Perlakuan 1 = Kelompok dengan perlakuan ekstrak daun tanaman kenari (Canarium indicum, L) 200 mg/ekor/hari
3. Perlakuan 2 = Kelompok dengan perlakuan ekstrak daun tanaman kenari (Canarium indicum, L) 300 mg/ekor/hari.
4. Perlakuan 3 = Kelompok dengan perlakuan ekstrak daun tanaman kenari (Canarium indicum, L) 400 mg/ekor/hari.
E. Alat dan Bahan Penelitian 1. Alat
Alat yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah a. Kadang tikus n. cover glass
b.Tempat pakan dan minum m. Sarung tangan c. Alat suntik 5 ml n. Okuler mikrometer
d. Oven o. Cotton buds
e. Botol jam p. Objektif micrometer f. Kertas label q. Alat ekstraksi
g. Mikroskop r. Nampan
h.Bak paraffin s. Gunting i. Cotton buds t. Gelas benda j. Botol flakon u. Pinset k. Alat bedah v. alat bedah
28
l. Timbangan makro w. Alat-alat pembuatan preparat histologik organ
2. Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah
a. Tikus putih betina l. Air
b. Daun tanaman kenari m. Xylol
c. Alkohol(70%, 80%, 90% absolute) n. Toluol
d. Pakan tikus o. Haematoxylin
e. Formalin 4 % p. Glyserin
f. Chloroform q. Etanol 96 %,
g. Aquadesh r.Canada balsem
h. Pewarna eosin s.Serbuk gergaji
i. Paraffin
j. Sabun antiseptic k. Garam fisiologis
F. Langkah penelitian 1. Tahap persiapan
a. Menyiapkan tikus sebanyak 16 ekor dengan umur (±2 bulan) dan berat150-200 gr yang belum pernah mengalami kebuntingan.
29
c. Menyiapkan daun tanaman kenari
d. Melakukan ekstraksi daun tanaman kenari di Laboratorium penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT) UGM.
2. Tahap pembuatan ekstrak daun tanaman kenari dengan teknik ekstraksi maserasi
Daun tanaman kenari yang telah dikeringkan, kemudian serbuk yang telah halus dimasukkan kedalam maserator dan dituangi dengan etanol 96%. Proses maserasi yang dilakukan dengan cara perendaman dibiarkan selama 24 jam sampai terdapat selapis cairan hasil rendaman di atas rendaman serbuk daun kenari. Cairan hasil ditampung dan sisa ampas daun tanaman kenari direndam kembali dengan etanol 96% dan dibiarkan 24 jam.Cairan hasil maserasi ditampung kembali dilakukan maserasi kembali pada sisa ampas daun tanaman kenari.Seluruh hasil maserasi tersebut di evaporasi menggunakan alat evaporator sehingga di dapat ekstrak kental yang terpisah dari pelarut etanolnya.
3. Aklimasi
a. Menyiapkan 16 ekor tikus galur Wistar dengan umur 2 bulan dan berat 150-200 gram.
b. Menyiapkan 4 kandang tikus, dan mengambil tikus secara acak sehingga masing-masing kandang terisi 4 ekor tikus.
30
d. Setiap 3 hari sekali dilakukan penggantian alas dengan mengganti serbuk gergaji lama dengan yang baru.
e. Proses aklimatisasi dilakukan selama 7 hari di Unit Pengelolaan Hewan Biologi
4. Perhitungan dosis
Penentuan dosis perlakuan pada penelitian didasarkan pada hasil uji pendahuluan, dimana pada uji pendahuluan terdiri dari 4 kelompok perlakuan. Satu kelompok kontrol (0 mg ekstrak daun kenari) dan tiga kelompok perlakuan, masing-masing 100 mg, 200 mg, 300 mg ekstrak daun kenari.
Berdasarkan hasil uji pendahuluan, dosis yang berpengaruh terhadap jumlah kelenjar dan ketebalan endometrium tikus putih adalah pada dosis perlakuan P2 (200 mg). Berdasarkan besar dosis tersebut, pada penelitian ini ditentukan 4 kelompok perlakuan, yaitu 1 kelompok kontrol (0 mg ekstrak daun kenari) dan 3 kelompok perlakuan P1(200 mg), P2 (300 mg) dan P3 (400 mg) ekstrak daun kenari dengan selisih dosis perlakuan adalah 100 mg.
Dari 1000 gram daun kenari dihasilkan 17,17 gram ekstrak daun kenari. 1 gram berat kering =17,17𝑔𝑟1000𝑔𝑟= 0,017 gram.Dalam 1 gram mengandung 0,017 gr ekstrak. Dalam 15 gr ekstrak daun kenari mengandung flavonoid 2,624 gr Quersetin/ekuivalen.
a. Perlakuan 200mg/ekor/hari
31 b. Perlakuan 300mg/ekor/hari 0,3 gr X 4 Tikus X 21 hari = 25,2 gr c. Perlakuan 400 mg/ekor/hari 0,4 gr X 4 Tikus X 21 hari = 33,6 gr 5. Tahap pelaksanaan
a. Pemberian ekstrak daun tanaman kenari
Ekstrak daun tanaman kenari diberikan secara oral pada tikus perlakuan sesuai dosisnya masing-masing dan diberikan setiap 1 hari 2 kali selama 3 kali estrus (21 hari).
b. Pemeliharaan dengan pemberian pakan pellet AD 2 secara rutin.
c. Pengambilan apus vagina dilakukan pada awal sebelum pemberian ekstrak dan setelah selesai pemberian ekstrak pada hari ke-22 untuk mengetahui tikus estrusnya. Salah satu cara untuk mengetahui siklus estrus tikus putih betina dengan cara apus vagina, adapun prosedur pembuatan apus vagina adalah gelas benda dibersihkan dengan alkohol 70%. Kapas dililitkan pada kayu lidi lalu dicelupkan ke dalam 1 cc NaCl fisiologis, kemudian dimasukkan ke dalam vagina tikus sedalam 1 cm kemudian diputar secara merata dan perlahan-lahan sehingga diperoleh jaringan mukosa vagina. Kapas yang mengandung mukosa vagina selanjutnya dioleskan gelas obyek kemudian dikeringkan di udara kemudian difiksasi dengan methanol 70%
32
selama 15 menit. Kemudian ditetesi dengan pewarna gimsa selama 20 menit. Kemudian sediaan dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan pada suhu kamar. Sediaan apus vagina kemudian diamati dibawah mikroskop.
d. Organ di bedah dan di buat preparat organ uterus yang didalamnya mencakup kelenjar endometrium dan lapisan endomerium uterus.
e. Pembuatan preparat histologi
Pembedahan dilakukan terhadap tikus pada hari ke 21 pada saat fase estrus kemudian dilakukan pembedahan dan pengambilan organ uterus.Pembuatan preparat dilakukan di Laboratorium Patologi FKH UGM dengan cara kerja sebagai berikut :
1) Melakukan pembiusan terhadap tikus dengan menggunakan kloroform.
2) Section (Pembedahan)
Pembedahan bertujuan untuk mengambil organ tikus putih yang akan dibuat preparat dan diamati jumlah kelenjar dan ketebalan lapisan endomeriumnya.
3) Labelling (Pemberian label)
Uterus dimasukkan kedalam botol flakon dan ditempeli label.
33 4) Fixation
Uterus yang telah dilabeli dimasukkan ke dalam botol flakon yang berisi cairan fixative, yaitu formalin 10%. 5) Dehydration (Pengeringan)
Dehidrasi jaringan dimaksudkan untuk mengeluarkan air yang terkandung dalam jaringan, dengan menggunakan cairan dehidran yaitu alkohol secara bertingkat dengan waktu yang tertentu yaitu
a) Alkohol 70%,3xperendamanselama 30menit b) Alkohol 80%, 3x perendamanselama 30 menit c) Alkohol 90%, 3x perendamanselama 30menit d) Akohol absolute, direndam selama 30 menit 6) Clearing (Penjernihan)
Proses ini bertujuan untuk menghilangkan alkohol, agar parafin dapat masuk ke dalam jaringan. Reagen penjernihan yang dipakai dalam pembuatan preparat uterus adalah toluol, reagen pembersih ini akan diganti dengan cara penetreasi ke dalam jaringan.
7) Paraffination
Proses infiltrasi dilakukan didalam oven (incubator) dengan perbandingan toluol : paraffin = 1 : 1 paraffin murni 1,2 dan 3 masing-masing selama selama 30 menit pada suhu 70-80ºC suhu tersebut bertujuan supaya
34
temperaturnya sesuai untuk penetrasi paraffin selama proses berlangsung agar jaringan tidak rusak. Paraffin yang dipilih untuk membuat preparat adalah paraffin dengan titik leleh yang tidak merubah keadaan sitologik dan sitokimia organ. Penetrasi paraffin tergantung dari tebal tipisnya pemotongan preparat yang dipakai. Paraffin kemudian dibiarkan memadat dan diberi petunjuk arah pemotongan dan nama dari jaringan tersebut.
8) Sectioning (Pemotongan menggunakan mikrotom)
a) Blok paraffin yang telah berisi jaringan, diiris menggunakan scalpel yang sudah dipanasi dengan api bunsen sehingga pemotongan lebih mudah dan bagian yang akan diiris dengan pisau mikrotomberbentuk segiempat teratur. Preparat diletakan ditengah, kira-kira 3-5 mm dari tepinya.
b) Meletakkan blok paraffin pada holder kayu
c) Kemudian memasang holder dengan blok paraffin pada rotary mikrotom yang direkatkan.
d) Selanjutnya menyiapkan tempat coupes atau pita dan kuas kecil untuk mengambil coupes dari pisau mikrotom.
e) Mengatur tebal tipisnya coupes dengan mengatur pada pengaturan di mikrotom setebal 4 µm.
35
f) Setelah diiris segera memasukkan preparat kedalam nampan yang berisi air hangat. Hal tersebut dilakukan agar coupes dapat merentang dan jaringan tidak melipat.
g) Menempelkan coupes pada gelas benda (pada proses affixing) yang sebelumnya telah diolesi olehputih telur atau albumin.
9) Affixing
a) Meletakkan sejumlah coupes (irisan tengah pada preparat) pada kaca benda yang telah diberi perekat dengan gliserin dan albumin.
b) Memindahkann kaca-kaca gelas benda yang berisi coupes tersebut keatas hotplate dengan suhu (40-45̊C), adanya kelebihan air dihisap dengan menggunakan pipet/keras saring dan mengatur letak coupes dengan paraffinnya direntangkan.
10)Pewarnaan menggunakan Hematoxylin-Eosin
a) Mencelupkan kaca benda yang telah ditempeli coupes ke dalam Xylolselama 30 menit.
b)Kemudian melakukan dehidrasi berulang dengan mencelupkan ke dalam alkohol absolut, alkohol 96%, 90%, 80%, 70% kemudian memasukkan Eosin selama 2 menit, mencelupkan ke dalam alkohol 60%, 50%, 40%, 30%, 20%
36
kemudian dicelupkan ke dalam hematoxylyn selama 10 menit dan mencucinya menggunakan air mengalir.
c) Melakukan rehidrasi dengan mencelupkan berurutan mulai alkohol 2%, 30%,4 0%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96% dan alkohol absolut beberapa kali celupan kemudian mengeringkannya dengan kertas filter atau tissue.
d) Menetesi slide dengan Canada balsam 10) Penutup
Setelah ditetesi menggunkan Canada Balsam kemudian objek gelas ditutup dengan gelas penutup dan diusahakan tidak muncul gelembung, karena adanya gelembung akan mengganggu pengamatan.
11) Pengamatan sruktur histologis
Preparat yang sudah jadi diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 100X. Melakukan perbandingan antara preparat perlakuan dan preparat kontrol. Preparat diamati secara sampling dan diamati seluruh bidang pandangnya.
a) Cara menghitung jumlah kelenjar endometrium adalah dengan menghitung seluruh kelenjar yang tampak melalui cara sampling, yaitu kelenjar dihitung per satuan lapang pandang dengan perbesaran 100X.
37
b) Cara mengukur ketebalan lapisan endometrium diukur dimulai lapisan yang berbatasan langsung dengan lumen uterus sampai batas antara lapisan endometrium dengan lapisan miometrium menggunakan bantuan mikrometer okuler yang telah dikalibrasi dengan mikrometer obyektif. Ketebalan diukur menggunakan skala pada mikrometer okuler, kemudian hasil yang diperoleh dikalikan dengan nilai kalibrasi 10, sehingga diperoleh nilai ketebalan lapisan. Ketebalan lapisan endometrium diperoleh dari rerata empat kali pengukuran sampling yaitu bagian atas, bawah, kanann dan kiri endometrium.
G. Teknik Pengumpulan Data
Pengumpulan data melalui pengamatan preparat uterus dan diambil gambarnya.Dilakukan perhitungan jumlah kelenjar (buah) serta diukur ketebalan lapisan endometrium uterus pada preparat irisan melintang utuh uterus dengan mikrometer okuler.Kelompok yang diamati adalah kelompok kontrol dan kelompok perlakuan ekstrak daun kenari.Setelah perhitungan masing-masing jumlah kelenjar dan tebal lapisan endometrium kemudian dilakukan analisis terhadap hasil perhitungan tersebut.
38 H. Analisis Data
Data jumlah kelenjar endometrium pada tikus putih pada kelompok kontrol dan tiga kelompok perlakuan, kemudian dianalisis dengan analisis non parametrik kruskal-Wallis untuk mengetahui ada tidaknya pengaruh pemberian ekstrak daun kenari terhadap jumlah kelenjar tikus putih padakelompok kontrol dan tiga kelompok perlakuan. Data ketebalam lapisan endometruim pada tikus putih dianalisis menggunakan analisis kontrol One Way Anova.Analisis tersebut dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya pengaruh ekstrak daun kenari terhadap ketebalan lapisan endometrium tikus putihkelompok kontrol dan tiga kelompok perlakuan. Apabila terdapat pengaruh yang nyata, maka dilanjutkan dengan uji Duncan’s Multiple Range Test (DMRT) untuk membandingkan antara kelompok kontrol dengan masing-masing perlakuan.
