BAB 4 METODE PENELITIAN. Penelitian ini merupakan penelitian jenis True Experimental Research yang

(1)

30 BAB 4

METODE PENELITIAN

4.1 Jenis Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian jenis True Experimental Research yang menggunakan desain penelitian Post Test Control Group Design.

4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian

Lokasi Penelitian : Laboratorium Biomedik dan Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang.

Waktu Penelitian : 17 hari, dengan rincian 7 hari adaptasi dan 10 hari percobaan.

4.3 Populasi dan Sampel Penelitian

4.3.1 Populasi

Populasi dalam penelitian ini adalah tikus putih (Rattus novergicus strain wistar)

4.3.2 Sampel Penelitian

Sampel dalam penelitian ini adalah tikus putih jantan (Rattus novergicus strain wistar) sebanyak 24 ekor terbagi dalam 4 kelompok.

4.3.3 Replikasi

(2)

Kelompok ini terdapat 4 kelompok perlakuan yaitu satu kelompok kontrol (tikus yang diberikan luka eksisi dan diberikan gel tanpa ekstrak daun melati gambir) dan tiga kelompok perlakuan (tikus yang diberikan luka eksisi dan gel ekstrak daun melati gambir dalam tiga dosis yang berbeda). Seluruh kelompok baik kelompok kontrol maupun kelompok perlakuan akan dieksplorasi selama 10 hari.

Replikasi yang digunakan berdasarkan rumus Federer (Rokhima, et al., 2018) : (t-1) (p-1) ≥ 15

(t-1)(4-1) ≥ 15 (t-1) (3) ≥ 15 3t – 3 ≥ 15 3t ≥ 18

t ≥ 6

Keterangan :

t = jumlah replikasi untuk setiap intervensi p = jumlah intervensi

Penelitian ini menggunakan metode nilai E yang didasarkan pada derajat kebebasan analisis varians (ANOVA), besar sampel ditentukan oleh nilai E.

E = Jumlah total hewan - Jumlah total kelompok (Jaykaran & N. D, 2013) E = (6 x 4) – 4

E = 20

Berdasarkan perhitungan di atas, maka besar sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah 20 ekor dan untuk setiap kelompok terdiri dari 5 ekor tikus.

(3)

Untuk mengantisipasi kemungkinan terjadi drop out pada sampel, maka besar sampel akhir harus disesuaikan dengan perkiraan atrisi atau kematian hewan (Jaykaran & N.

D, 2013).

Besar sampel koreksi = Jumlah sampel / (1- [f/100%])

= 6 / (1-[10/100%])

= 6 / (1-0,1)

= 6 / (0,9)

= 6,667

= 7 Keterangan :

f = perkiraan atrisi atau kematian hewan 10%

Jumlah cadangan tiap kelompok = besar sampel koreksi – pengulangan

= 7 – 6

= 1

Jumlah sampel cadangan = Jumlah cadangan tiap kelompok x kelompok intervensi = 1 x 4

= 4

Jumlah total sampel = Besar sampel + Jumlah sampel cadangan = 20 + 4

= 24

(4)

Berdasarkan perhitungan rumus di atas, maka jumlah sampel yang digunakan keseluruhan pada penelitian ini adalah 24 ekor tikus yang akan dibagi menjadi 4 kelompok dengan setiap kelompok terdiri dari 5 ekor tikus dan 1 ekor tikus cadangan.

4.3.4 Teknik Pengambilan Sampel

Teknik pengambilan sampel menggunakan simple random sampling, yaitu sampel diambil secara acak dari populasi menggunakan metode lotere atau menggunakan daftar acak yang dibuat komputer (Mohamed & Ahmed, 2017).

4.3.5 Karakteristik Sampel Penelitian

4.3.5.1 Kriteria Inklusi

a. Tikus putih (Rattus novergicus strain wistar) b. Umur 2-3 bulan

c. Berat badan 180 – 200 gram d. Jenis kelamin jantan

e. Sehat, ditandai dengan gerakannya yang aktif, bulu tebal, dan matanya jernih 4.3.5.2 Kriteria Eksklusi

a. Tikus yang tidak memenuhi syarat kriteria inklusi 4.3.5.3 Kriteria Drop Out

a. Tikus yang sakit, mati, atau hilang selama penelitian 4.3.6 Variabel Penelitian

(5)

4.3.6.1 Variabel Bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah gel ekstrak daun melati gambir (Jasminum Officinale).

4.3.6.2 Variabel Terikat

Variabel terikat dalam penelitian ini adalah luas area luka eksisi yang sembuh pada tikus putih (Rattus norvegicus strain wistar).

4.3.7 Definisi Operasional

a. Variabel bebas 1. Definisi variabel

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah pemberian gel ekstrak daun melati gambir (Jasminum Officinale) pada tikus putih (Rattus

norvegicus strain wistar).

2. Hasil ukur :

Dosis 1 = 3% x 10 g gel = 0,3 g ekstrak daun melati gambir Dosis 2 = 6% x 10 g gel = 0,6 g ekstrak daun melati gambir Dosis 3 = 12% x 10 g gel = 1,2 g ekstrak daun melati gambir Kelompok kontrol diberi gel tanpa ekstrak daun melati gambir 3. Cara mengukur

(6)

Gel dioleskan dengan cottonbud sebanyak kurang lebih 1 FTU (fingertip unit) = 0,5 g sesuai dengan kelompoknya dengan frekuensi sekali sehari selama 10 hari.

4. Alat ukur

Finger tip unit (FTU) 5. Skala ukur variabel

Kategorik ordinal b. Variabel terikat

1. Definisi variabel

Variabel terikat dalam penelitian ini adalah luas area luka pada tikus putih jantan (Rattus norvegicus strain wistar).

2. Hasil ukur

Hasil pengukuran luas area luka eksisi dalam bentuk data yang disajikan setiap kelompok, kemudian dicari rata-rata dan standar deviasi masing- masing kelompok.

3. Cara mengukur

Area luka diukur menggunakan penggaris, mika transparan, dan spidol setiap lima hari kemudian diolah dengan perangkat lunak imageJ di komputer. Luas permukaan luka dihitung dengan satuan mm².

Kontraksi luka dihitung sebagai persen penurunan area luka berdasarkan rumus %Wound contraction (Tuhin, et al., 2017)

(7)

4. Alat ukur

Penggaris, mika transparan, spidol 5. Skala ukur variabel

Numerikrasio

4.4 Alat dan Bahan Penelitian 4.4.1 Alat

a. Timbangan untuk menimbang berat badan tikus b. Alat pemeliharaan tikus:

 Bak tikus

 Penutup kandang dari anyaman kawat

 Botol air

 Sekam

c. Alat pembuatan dan penyimpanan ekstrak daun melati gambir:

 Timbangan

 Penangas air (waterbath)

 Lemari pengering

 Lemari pendingin

 Blender

 Kertas saring

 Erlenmeyer

 rotary vacuum evaporator

 Liofilizer

 Alat refluks (pemanas listrik, labu leher tiga, kondensor) d. Alat untuk memberikan perlakuan:

(8)

 Handscoon

e. Alat untuk anastesi:

 Kurungan kaca dan tissue

f. Alat untuk membuat gel:

 Wadah Gel

 Mortar dan penggerusnya

 Pengaduk

g. Alat untuk memberi perlukaan:

 Silet

 Pinset Anatomis

 Pisau bedah

 Sarung Tangan

h. Alat untuk memberi gel:

 Cottonbud

i. Label 4.4.2 Bahan

a. Bahan pemeliharaan tikus:

 Bahan pakan

 Aquadest

b. Bahan pembuatan ekstrak daun melati gambir:

 Daun melati gambir

 Etanol 70%

(9)

c. Bahan untuk anastesi dan perlukaan:

 Povidone iodine

 Kloroform

 Alkohol 70%

 Kasa steril

d. Bahan untuk pembuatan basis gel:

 HPMC

 Propilen glikol

 Metil paraben

 Propil paraben

 Aquadest ad

e. Alat untuk menutup luka:

 Perban

 Kasa steril

f. Bahan untuk perlakuan setelah pengamatan:

 Toples

 polybag

4.5 Prosedur Penelitian 4.5.1 Aklimatisasi

Proses aklimatisasi atau adaptasi hewan coba dalam kandang selama 7 hari dengan tujuan agar tikus menyesuaikan diri terhadap lingkungan yang baru. Selama adaptasi tikus ditempatkan di bawah kondisi suhu standar, (25 ± 2 °) dan terang, (sekitar

(10)

12/12 jam siklus terang-gelap), diberi pakan dengan diet standar dan diberi air ad libitum (P. F, et al., 2013).

4.5.2 Pengelompokkan Tikus

Tikus yang sudah diaklimatisasi selama 7 hari dikelompokkan untuk dilakukan perlakuan, dimana pengelompokkan dilakukan secara random, dengan cara mengambil tikus secara acak lalu menaruh pada 4 kandang yang sudah disediakan. Setelah itu memberi label pada masing-masing kandang sesuai perlakuan yaitu: kelompok 1, kelompok 2 , kelompok 3 dan kelompok 4.

4.5.3 Pembuatan Ekstrak Daun Melati gambir (Jasminum Officinale).

Pembuatan ekstrak daun melati gambir dilakukan di Materia Medica Batu.

Sampel daun melati gambir yang telah terkumpul dicuci dan dikeringkan dengan cara diangin-anginkan. Daun melati gambir yang telah kering kemudian digiling hingga didapatkan serbuk. Sebanyak 200 gram serbuk daun melati gambir ditimbang kemudian dimaserasi dengan 1,5 L etanol 70% pada suhu kamar selama 5 hari, lalu disaring. Kemudian ampas diremaserasi dengan 500 mL etanol 70% pada suhu kamar selama 2 hari, lalu disaring dan filtrat dikumpulkan. Filtrat dipekatkan dengan rotary evaporator pada suhu 50o C hingga diperoleh ekstrak yang masih mengandung pelarut dalam volume yang kecil. Penguapan pelarut ekstraksi dilanjutkan dengan menggunakan oven pada suhu 40˚C hingga diperoleh ekstrak kental (Padmasari, et al., 2013).

(11)

4.5.4 Penentuan Dosis Ekstrak Daun Melati Gambir (Jasminum Officinale).

Dasar dosis ekstrak daun melati gambir adalah penelitian terdahulu oleh Bulders et al (2013), yaitu penelitiannya mengenai efek total flavonoid pada luka eksisi pada tikus Rattus novergicus strain wistar. Penelitian tersebut menunjukkan bahwa kandungan total flavonoid setiap 1 mg ekstrak kelopak bunga rosela adalah 12,30 mg/g quercetin equivalent, sedangkan pada penelitian Prachee et al (2016), menunjukkan kandungan total flavonoid setiap 0,5 mg ekstrak daun melati gambir adalah 10,76 mg/g quercetin equivalent. Oleh karena itu, diperlukan 0,6 mg ekstrak daun melati gambir agar

menghasilkan total flavonoid yang setara dengan 1 mg ekstrak kelopak bunga rosela sehingga didapatkan perbandingan (3:5)

Peneliti memakai dosis ekstrak daun melati gambir konsentrasi 6% yang setara dengan ekstrak kelopak bunga rosela konsentrasi 10% yang terbukti pada penelitian Bulders et al (2013) dapat mempercepat penyembuhan luka. Untuk penelitian ini, peneliti akan menggunakan dosis 1/2n, n, dan 2n dengan dasar n adalah 6% sehingga didapatkan 3 dosis gel dengan 3 konsentrasi ekstrak daun melati gambir yang berbeda, yaitu 3%, 6%, dan 12% dan mengasumsikan jumlah gel yang dipakai 10 g.

Tabel 4.1 Formulasi Gel Ekstrak Daun Melati Gambir

Nama Bahan Formula m/a

F1 F2 F3

Ekstrak daun melati gambir

3% 6% 12%

Basis gel 10 g 10 g 10 g

Keterangan :

(12)

F1 : Formula 1 dengan konsentrasi ekstrak 3%

Dari perhitungan tersebut, maka dapat dirumuskan dosis ekstrak daun melati gambir yang dibutuhkan adalah sebagai berikut:

F1 = 3% x 10 g = 0,3 g = 300 mg ekstrak daun melati gambir F2 = 6% x 10 g = 0,6 g = 600 mg ekstrak daun melati gambir F3 = 12% x 10 g = 1,2 g = 1200 mg ekstrak daun melati gambir

Dengan dasar fomula diatas, maka akan dihitung jumlah total flavonoid yang terkandung dalam ekstrak daun melati gambir, yang mana tiap 1 mg ekstrak daun melati gambir mengandung total flavonoid sebesar 21,52 mg/g quercetin equivalent.

Sehingga didapatkan perhitungan sebagai berikut :

F1 = 300 mg ekstrak daun melati gambir = 6456 mg/g quercetin equivalent F2 = 600 mg ekstrak daun melati gambir = 12912 mg/g quercetin equivalent F3 = 1200 mg ekstrak daun melati gambir = 25824 mg/g quercetin equivalent

Sehingga, jumlah ekstrak daun melati gambir (g) dikali jumlah tikus tiap kelompok : ekstrak daun melati gambir (g) X 6 (jumlah tikus tiap kelompok)

F1 = 0,3 g x 6 = 1,8 g

(13)

F2 = 0,6 g x 6 = 3,6 g F3 = 1,2 g x 6 = 7,2 g

Kebutuhan total ekstrak daun melati gambir = 1,8 g + 3,6 g + 7,2 g = 12,6 g ekstrak daun melati gambir

Dari data tersebut maka akan masih perlu dihitung dengan rendemen ekstrak daun melati gambir, yang mana menurut Prachee et al (2016) yaitu 15,5%.

Rendemen (%) = Ekstrak yang dibutuhkan x 100%

Serbuk simplisia daun melati gambir 15,5% = 12,6 g x 100%

X X = 82 g

X = simplisia melati gambir

Dengan didapatkan hasil tersebut maka simplisia yang dibutuhkan adalah 82 g simplisia melati gambir.

4.5.5 Pembuatan Basis Gel Ekstrak Daun Melati Gambir

Pembuatan basis gel dilakukan sesuai dengan komposisi formula yang tertera pada tabel 4.2 dengan cara mendispersikan ekstrak daun melati gambir, metil paraben, dan propil paraben ke dalam propilen glikol dengan pengadukan menggunakan stirrer kecepatan 20 rpm pada suhu 30˚C selama 5 menit. Lalu dimasukkan HPMC yang sudah dikembangkan dalam akuades. Campuran diaduk secara konstan dengan menggunakan

(14)

stirrer pada kecepatan dan suhu yang sama selama 10 menit hingga homogen.

Campuran didiamkan selama 24 jam pada suhu ruang agar gel mengembang (Inas, et al., 2019).

Tabel 4.2 Formulasi Basis Gel

Nama bahan Formula

HPMC 7%

Propilen glikol 15%

Metil paraben 0,18%

Propil paraben 0,02%

Akuades ad 100%

Sumber: (Inas et al., 2019; Mirhansyah, et al., 2015)

Jumlah basis gel yang dibutuhkan adalah = F1 + F2 + F3 + F4 F1 = (10 g – 0,3 g ekstrak daun melati gambir) x 6 tikus = 58,2 g F2 = (10 g – 0,6 g ekstrak daun melati gambir) x 6 tikus = 56,4 g F3 = (10 g – 1,2 g ekstrak daun melati gambir) x 6 tikus = 52,8 g F4 = (10 g – 0 g ekstrak daun melati gambir) x 6 tikus = 60 g

Maka jumlah seluruh basis gel yang dibutuhkan = F1 + F2 + F3 + F4

= 58,2 g + 56,4 g + 52,8 g + 60 g = 227,4 g basis gel

Sehingga perhitungan untuk bahan pembuatan basis gelnya adalah HPMC = 7% x 227,4 g = 15,91 g

(15)

Propilen glikol = 15% x 227,4 g = 34,11 g Metil paraben = 0,18% x 227,4 g = 0,41 g Propil paraben = 0,02% x 227,4 g = 0,04 g

Akuades ad = 227,4 g – 15,91 g – 34,11 g – 0,41 g – 0,04 g = 176,93 g 4.5.6 Perlakuan

Tikus-tikus yang telah diaklimatisasi selanjutnya ditimbang untuk mengetahui beratnya. Tikus-tikus tersebut lalu dianastesi secara inhalasi dengan kloroform hingga efek anastesinya muncul. Tikus dicukur terlebih dahulu di daerah posterior, dilakukan sehari sebelum pembuatan luka (Elly & Rizky A., 2017). Setelahnya, daerah yang sudah dicukur diberikan tindakan asepsis dengan cara mengoleskan kasa yang telah dicelupkan pada larutan povidone iodine dilanjutkan dengan mengoleskan alkohol 70%. Setelah asepsis, dibuat eksisi berbentuk lingkaran diameter seluas 1 cm² menggunakan pisau bedah di bagian kulit posterior (Maryam, et al., 2017).

Kemudian pada masing-masing kelompok hewan uji yang telah dibuat luka langsung diberikan perlakuan berupa dioleskan gel menggunakan cottonbud sebanyak kurang lebih 1 FTU (fingertip unit) = 0,5 g sesuai dengan kelompoknya dengan frekuensi sekali sehari selama 10 hari. Setelah itu luka ditutup kasa steril serta dibalut perban (Dinda Dwi, et al., 2020).

(16)

4.5.7 Pengukuran area permukaan luka

Pengukuran area luka eksisi dilakukan pada hari ke-5 dan ke-10 (Chundran, et al., 2015). Area luka diukur menggunakan penggaris, mika transparan, dan spidol kemudian diolah dengan perangkat lunak imageJ di komputer. Luas permukaan luka dihitung dengan satuan mm². Kontraksi luka dihitung sebagai persen penurunan area luka berdasarkan rumus di bawah ini (P. F, et al., 2013).

%Kontraksi luka = area sembuh x 100 (Tuhin, et al., 2017) total area luka

Keterangan:

area sembuh = area luka awal – area luka saat ini Contoh:

area luka awal = 1 cm², area luka saat ini = 0,5 cm², area sembuh = 1-0,5 = 0,5 cm²

%kontraksi luka = 0,5 cm² x 100 = 50% kontraksi luka 1 cm ²

4.5.8 Perlakuan Setelah Tindakan

Setiap kelompok tikus dianastesi dalam toples menggunakan kloroform per- inhalasi hingga mati, kemudian tikus dibungkus dengan polybag dan dikuburkan.

(17)

4.6 Alur Penelitian

Aklimatisasi 24 tikus baik pakan dan lingkungan selama 7 hari

Penimbangan berat tikus

Anastesi secara inhalasi dengan kloroform, lalu rambut bagian posterior tikus dicukur

Asepsis dengan povidone iodine dan alkohol 70%, lalu eksisi secara melingkar dengan diameter 1 cm dengan pisau bedah

Pemberian gel setiap hari dan penggantian perban dua kali sehari selama 10 hari

Kel. 1 (Kontrol) Pemberian basis gel tanpa ekstrak

daun melati gambir (F4)

Kel. 2 (perlakuan 1) Pemberian gel ekstrak daun melati gambir

3% (F1)

6% (F2)

12% (F3)

Pengukuran area luka menggunakan spidol, mika transparan, dan penggaris

Perlakuan setelah Tindakan

Perhitungan Data

Analisis Data

(18)

Keterangan:

 Kelompok 1: 6 tikus dengan pemberian gel tanpa ekstrak daun melati gambir

 Kelompok 2: 6 tikus untuk perlakuan 1 (gel ekstrak daun melati gambir 3%)

4.7 Analisis Data

Dikarenakan besar sampel ≤50, maka data-data yang telah diperoleh dianalisis dengan uji normalitas menggunakan uji Shapiro – Wilk. Uji normalitas digunakan untuk mengetahui apakah distribusi data normal. Sebaran data dinilai normal apabila p>0,05. Jika p<0,05 maka data tersebut dapat ditransformasi. Kemudian dilanjutkan uji homogenitas menggunakan uji varian Levene’s test untuk mengetahui bahwa dua atau lebih kelompok data sampel berasal dari populasi yang memiliki varians sama (homogen). Varian dinilai homogen bila p>0,05. Jika data masing-masing kelompok terdistribusi normal dan varian antar kelompok homogen, maka dilakukan uji Repeated ANOVA. Hipotesis diterima bila perbedaan dianggap signifikan untuk nilai p<0,05.

Bila hasil uji Repeated ANOVA menunjukkan adanya perbedaan signifikan, maka uji selanjutnya adalah melihat kelompok mana saja yang berbeda. bila varian sama, maka uji lanjut yang digunakan adalah uji Post Hoc Bonferroni (P. F, et al., 2013).