37
BAB 4
METODE PENELITIAN
4.1 Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian jenis True Experimental Research yang menggunakan desain penelitian Post Test Control Group Design.
4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian
Lokasi Penelitian : Laboratorium Biomedik dan Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang Waktu Penelitian : 2 minggu
4.3 Populasi dan Sampel Penelitian 4.3.1 Populasi
Populasi dalam penelitian ini adalah tikus putih (Rattus novergicus strain wistar).
4.3.2 Sampel
Sampel dalam penelitian ini adalah tikus putih jantan (Rattus novergicus strain wistar) sebanyak 24 ekor terbagi dalam 4 kelompok.
4.3.3 Replikasi
Pada penelitian ini terdapat 3 kelompok perlakuan dan satu kelompok kontrol (tikus yang diberikan luka eksisi dan diberikan gel tanpa ekstrak daun melati gambir) dan tiga kelompok perlakuan (tikus yang diberikan luka eksisi dan gel ekstrak daun melati
gambir dalam tiga dosis yang berbeda). Seluruh kelompok baik kelompok kontrol maupun kelompok perlakuan akan dieksplorasi selama 2 minggu (14 hari). Replikasi yang digunakan pada penelitian ini adalah dengan rumus Federer berikut (Dahlan, 2016). (t-1) (p-1) ≥ 15 (t-1) (4-1) ≥ 15 3t – 3 ≥ 15 3t ≥ 18 t ≥ 6 Keterangan: p = perlakuan
t = jumlah replikasi per perlakuan
Penggunaan hewan coba pada eksperimen menggunakan analisis varian (Annova), besar sampel ditentukan dengan nilai E.
E = total jumlah hewan coba – total kelompok perlakuan (Douglasa, 2011) ∑ sampel = (hasil rumus Federer x kelompok perlakuan) – kelompok perlakuan = (6 x 4) - 4
= 20
Jadi, berdasarkan perhitungan diatas, maka besar sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah 20 ekor dan masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor tikus.
Rumus besar sampel untuk mengantisipasi kemungkinan sampel terpilih mengalami drop out sebagai berikut (Madiyono, B, Moeslichan Mz, S, & Purwanto 2014).
n’ = [n/1-f] n’ = n / (1-f) n’ = 6 / ( 1-0,1) n’ = 6 / (0,9) n’ = 6,667 n’ = 7 Keterangan:
n’ = jumlah sampel penelitian n = besar sampel yang dihitung
f = perkiraan proporsi drop out, kira-kira 10% (f = 0,1) ∑ cadangan tiap kelompok
= n’-pengulangan = 7 – 6 = 1
∑ sampel cadangan
= cadangan tiap kelompok x kelompok pelakuan = 1 x 4 = 4
∑ Total sampel
= ∑sampel + ∑sampel cadangan = 20 + 4 = 24
Berdasarkan perhitungan dari rumus diatas, maka jumlah sampel keseluruhan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 24 ekor tikus dibagi menjadi 4 kelompok dan tiap kelompok terdiri dari 5 ekor tikus dan ditambah 1 ekor tikus cadangan.
Teknik pengambilan sampel menggunakan simple random sampling, yaitu pengambilan sampel secara acak sederhana bahwa setiap anggota atau unit dari populasi mempunyai kesempatan yang sama untuk diseleksi sebagai sampel (Notoatmodjo s, 2012).
4.3.5 Karakteristik sampel penelitian a. Kriteria inklusi
1. Tikus putih 2. Umur 2-3 bulan
3. Berat badan 150-200 gram 4. Jenis kelamin jantan
5. Sehat, ditandai dengan gerakannya yang aktif, bulu tebal, dan matanya jernih
b. Kriteria eksklusi
- Pernah digunakan untuk penelitian
4.3.6 Variabel penelitian 4.3.6.1 Variabel bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah dosis gel ekstrak daun melati gambir (Jasminum officinale).
4.3.6.2 Variabel tergantung
Variabel terikat dalam penelitian ini adalah jumlah sel fibroblast pada luka eksisi tikus putih (Rattus norvegicus strain wistar).
Tabel 4.1 Definisi Operasional No. Variabel Definisi
operasional variable Hasil ukur (indikator ) variabel Cara ukur variabel
Alat ukur Skala ukur variabel 1 Gel ekstrak daun melati gambir (Jasminum officinale) Daun melati gambir (Jasminum officinale) diperoleh Toko bibit di Batu, Jawa timur. Daun melati gambir yang sudah ditimbang dikeringkan di lemari pengering selama 1-2 hari. Setelah itu, , direfluks berulang kali tiga kali dengan etanol suling ganda, selama 2 jam setiap kali dan filtrat dikumpulkan, digabungkan dan dipekatkan dalam rotatory evaporator pada suhu 45°C ± 5°C di bawah tekanan tereduksi, untuk mendapatkan bahan semipadat, yang mana kemudian diliofilisasi untuk mendapatkan bubuk coklat tua (Dubey P, Tiwari A, 2016) Gel formula 1: ekstrak daun melati gambir, dosis 1 = 3% x 10 g gel = 0,3 g ekstrak daun melati gambir. Dosis 2 = 6% x 10 g gel = 0,6 g ekstrak daun melati gambir. Dosis 3 = 12% x 10 g gel = 1,2 g ekstrak daun melati gambir. Gel dioleskan dengan cotton bud sebanyak kurang lebih 1 FTU (fingertip unit) = 0,5 g sesuai dengan kelompoknya dengan frekuensi sekali sehari selama 7 hari (Albaayit, S. F. A., Abba, & Abdullah, 2015) Fingertipunit (FTU) Kategorik →ordinal
2. Sel fibroblast Sel-sel fibroblast yang dihitung yaitu sel gepeng dengan juluran sitoplasma, inti lonjong dengan sedikit kromatin, dan satu atau dua nukleus (Mescher, 2012)
Jumlah sel Preparat sediaan histologi diambil pada hari ke-7 pemberian gel ekstrak daun melati gambir Setiap preparat dilihat dalam 6 lapang pandang dengan pembesaran 400x (Schultz, 2007) Penghitungan sel fibroblast men ggunakan mikroskop cahaya di bawah supervisi ahli patologi anatomi. Numerik → rasio
4.5 Alat dan Bahan Penelitian 4.5.1 Alat
a. Timbangan untuk menimbang berat badan tikus b. Alat pemeliharaan tikus
1. Bak tikus
2. Penutup kandang dari anyaman kawat 3. Botol air
4. Sekam
c. Alat pembuatan dan penyimpanan ekstrak daun melati gambir 1. Timbangan
2. Penangas air 3. Lemari pengering 4. Lemari pendingin 5. Blender
- Handscoon e. Alat untuk anastesi
- Spuit 1cc
f. Alat untuk membuat gel 1. Wadah gel
2. Mortar dan penggerusnya 3. Pengaduk
g. Alat untuk memberi perlukaan 1. Pencukur listrik
2. Biopsy Punch 3. Sarung Tangan h. Alat untuk memberi gel
1. Cotton bud 2. Label 4.5.2 Bahan
a. Bahan pemeliharaan tikus 1. Bahan pakan
2. Aquadest
b. Bahan pembuatan ekstrak daun melati gambir 1. Daun melati gambir
2. Metanol
c. Bahan untuk anastesi dan perlukaan 1. Povidone iodine
2. Kloroform 100mg/mL 3. Alkohol 70%
4. Kasa steril
d. Bahan untuk pembuatan basis gel 1. HPMC
2. Nipagin 3. Aquadest
e. Alat untuk menutup luka 1. Perban
2. Kasa steril
f. Bahan untuk perlakuan setelah pengamatan 1. Kloroform
2. Toples 3. Polybag
4.6 Prosedur Penelitian 4.6.1 Aklimatisasi
Proses aklimatisasi atau adaptasi hewan coba dalam kandang selama 7 hari dengan tujuan agar tikus menyesuaikan diri terhadap lingkungan yang baru. Selama adaptasi tikus diberikan pakan standar BR-1 dan SP yang mengandung air 12%, protein kasar 20-22%, lemak kasar ≥5%, abu≤7,5%, Ca 0,9-1,2%, P 0,6-0,8%, dan coccidiostat positif, antibiotika positif secara sonde lambung sebanyak 15g/hari serta minum adlibitum (Alexandru I, 2011).
1.6.2 Pengelompokkan tikus
Tikus yang sudah diaklimatisasi selama 7 hari dikelompokkan untuk dilakukan perlakuan, dimana pengelompokkan dilakukan secara random, dengan cara mengambil tikus secara acak lalu menaruh pada 4 kandang yang sudah disediakan. Setelah itu memberi label pada masing-masing kandang sesuai perlakuan yaitu: kelompok 1, kelompok 2, kelompok 3, dan kelompok 4.
1.6.3 Pembuatan ekstrak daun melati gambir (Jasminum officinale)
Pembuatan ekstrak daun melati gambir dilakukan di Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang. Proses ekstraksi diawali dengan menimbang daun melati gambir terlebih dahulu. Daun melati gambir yang sudah ditimbang dikeringkan di lemari pengering selama 1-2 hari. Setelah itu, direfluks berulang kali tiga kali dengan etanol suling ganda, selama 2 jam setiap kali dan filtrat dikumpulkan, digabungkan dan dipekatkan dalam rotatory evaporator pada suhu 45°C ± 5°C di bawah tekanan tereduksi, untuk mendapatkan bahan semipadat, yang mana kemudian diliofilisasi untuk mendapatkan bubuk coklat tua (Dubey P, Tiwari A, 2016). 1.6.4 Penentuan dosis ekstrak daun melati gambir (Jasminum officinale)
Dasar dosis ekstrak daun melati gambir adalah penelitian terdahulu oleh Bulders (2013), yaitu penelitiannya mengenai efek flavonoid total pada luka eksisi pada tikus Rattus novergicus strain wistar. Penelitian tersebut menunjukkan bahwa kandungan flavonoid total setiap 1 mg ekstrak kelopak bunga rosela adalah 12,30 mg/g quercetin equivalent, sedangkan pada penelitian Prachee (2015), menunjukkan kandungan flavonoid total setiap 0,5 mg ekstrak daun melati gambir adalah 10,76 mg/g quercetin
menghasilkan total flavonoid yang setara dengan 1 mg ekstrak kelopak bunga rosela sehingga didapatkan perbandingan (3:5).
Peneliti memakai dosis ekstrak daun melati gambir konsentrasi 6% yang setara dengan ekstrak kelopak bunga rosela konsentrasi 10% yang terbukti pada penelitian Bulders et al (2013) dapat mempercepat waktu penutupan luka.
Penelitian sebelumnya yang telah dilakukan oleh Mar’ah (2017) menggunakan dosis 1/2n, n, dan 2n dengan dasar n pada penelitian ini adalah 6% sehingga didapatkan 3 dosis gel dengan 3 konsentrasi ekstrak daun melati gambir yang berbeda, yaitu 3%, 6%, dan 12%. mengasumsikan jumlah gel yang dipakai 10 g.
Tabel 4.2 Formulasi Gel Ekstrak Daun Melati Gambir
Nama Bahan Formula m/a
F1 F2 F3
Ekstrak daun melati gambir 3% 6% 12%
Basis gel 10 g 10 g 10 g
Keterangan:
F1: Formula 1 dengan konsentrasi ekstrak 3% F2: Formula 2 dengan konsentrasi ekstrak 6% F3: Formula 3 dengan konsentrasi ekstrak 12%
Dari perhitungan tersebut, maka dapat dirumuskan dosis ekstrak daun melati gambir yang dibutuhkan adalah sebagai berikut:
F1 = 3% x 10 g = 0,3 g = 300 mg ekstrak daun melati gambir F2 = 6% x 10 g = 0,6 g = 600 mg ekstrak daun melati gambir F3 = 12% x 10 g = 1,2 g = 1200 mg ekstrak daun melati gambir
Dengan dasar fomula diatas, maka akan dihitung jumlah flavonoid total yang terkandung dalam ekstrak daun melati gambir, yang mana tiap 1 mg ekstrak daun melati
gambir mengandung flavonoid total sebesar 21,52 mg/g quercetin equivalent. Sehingga didapatkan perhitungan sebagai berikut:
F1 = 300 mg ekstrak daun melati gambir = 6456 mg/g quercetin equivalent
F2 = 600 mg ekstrak daun melati gambir = 12912 mg/g quercetin equivalent
F3 = 1200 mg ekstrak daun melati gambir = 25824 mg/g quercetin equivalent
Sehingga, jumlah ekstrak daun melati gambir (g) dikali jumlah tikus tiap kelompok: ekstrak daun melati gambir (g) X 6 (jumlah tikus tiap kelompok)
F1 = 0,3 g x 6 = 1,8 g F2 = 0,6 g x 6 = 3,6 g F3 = 1,2 g x 6 = 7,2 g
Kebutuhan total ekstrak daun melati gambir = 1,8 g + 3,6 g + 7,2 g = 12,6 g ekstrak daun melati gambir
Dari data tersebut maka akan masih perlu dihitung dengan rendemen ekstrak daun melati gambir, yang mana menurut Prachee (2015) yaitu 15,5%.
Rendemen (%) = Ekstrak yang dibutuhkan x 100% Serbuk simplisia daun melati gambir 15,5% = 12,6 g x 100%
X X = 82 g
X = simplisia melati gambir
Dengan didapatkan hasil tersebut maka simplisia yang dibutuhkan adalah 82 g simplisia melati gambir.
4.6.5 Pembuatan basis gel ekstrak daun melati gambir
Pembuatan basis gel dilakukan sesuai dengan komposisi formula yang tertera pada tabel 4.2 dengan cara mendispersikan ekstrak daun melati gambir, metil paraben, dan propil paraben ke dalam propilen glikol dengan pengadukan menggunakan stirrer kecepatan 20 rpm pada suhu 30°C selama 5 menit. Lalu dimasukkan HPMC yang sudah dikembangkan dalam aquades. Campuran diaduk secara konstan dengan menggunakan stirrer pada kecepatan dan suhu yang sama selama 10 menit hingga homogen. Campuran didiamkan selama 24 jam pada suhu ruang agar gel mengembang (Inas, K. 2019).
Tabel 4.3 Formulasi Basis Gel
Nama bahan Formula
HPMC 7%
Propilen glikol 15%
Metil paraben 0,18%
Propil paraben 0,02%
Akuades ad 100%
(Inas, K., 2019; Ardana, Aeyni and Ibrahim, 2015)
Jumlah basis gel yang dibutuhkan adalah = F1 + F2 + F3 + F4 F1 = (10 g – 0,3 g ekstrak daun melati gambir) x 6 tikus = 58,2 g F2 = (10 g – 0,6 g ekstrak daun melati gambir) x 6 tikus = 56,4 g F3 = (10 g – 1,2 g ekstrak daun melati gambir) x 6 tikus = 52,8 g F4 = (10 g – 0 g ekstrak daun melati gambir) x 6 tikus = 60 g
Maka jumlah seluruh basis gel yang dibutuhkan = F1 + F2 + F3 + F4 = 58,2 g + 56,4 g + 52,8 g + 60 g = 227,4 g basis gel
Sehingga perhitungan untuk bahan pembuatan basis gelnya adalah: HPMC = 7% x 227,4 g = 15,91 g
Propilen glikol = 15% x 227,4 g = 34,11 g Metil paraben = 0,18% x 227,4 g = 0,41 g Propil paraben = 0,02% x 227,4 g = 0,04 g
Aquades = 227,4 g – 15,91 g – 34,11 g – 0,41 g – 0,04 g = 176,3 g 4.6.6 Proses anastesi
Tikus-tikus yang telah diaklimatisasi selanjutnya ditimbang untuk mengetahui beratnya. Tikus-tikus tersebut lalu dianastesi dengan kloroform. Tikus di masukan kedalam wadah yang sudah diberikan kloroform sebelumnya dan ditunggu hingga efek anastesinya muncul (Manoj & Murugan, 2012).
4.6.7 Pembuatan luka eksisi
Daerah yang akan dilakukan eksisi yaitu rambut bagian dorsal tikus dicukur dahulu rambutnya dengan pencukur elektrik Setelahnya, daerah yang sudah dicukur diberikan tindakan asepsis dengan cara mengoleskan kasa yang telah dicelupkan pada larutan povidone iodine dilanjutkan dengan mengoleskan alkohol 70%. Secara asepsis dibuat eksisi berbentuk lingkaran diameter 5 mm dengan cara melipat kedua kulit tikus di bagian dorsal dari garis tengah badan dengan jari, kemudian melakukan tekanan dengan biopsy punch pada bagian kulit yang terlipat sehingga didapatkan 2 lubang luka yang simetris (Wang, 2013).
4.6.8 Perlakuan
Pada masing-masing kelompok hewan uji yang telah dibuat luka langsung diberikan perlakuan yaitu dioleskan gel dengan cottonbud sebanyak kurang lebih 1 FTU (fingertip unit) = 0,5 g sesuai dengan kelompoknya dengan frekuensi satu kali sehari selama 7 hari.
4.6.9 Perawatan luka
Setiap tikus diperban dengan kasa dan selotip agar luka menjadi sehingga dapat mengurangi paparan bakteri dari dunia luar (Prastika, Dinda Dwi, 2020). Perban diganti setiap sehari sekali selama 7 hari.
4.6.10 Pengambilan Sediaan Jaringan
Pada hari ke-7, semua tikus yang diberi perlakuan dianastesi seperti yang telah dijelaskan diatas. Lepaskan transparent dressing perlahan, lalu ambil jaringan dengan menggunakan biopsy punch seperti yang dijelaskan diatas. Jaringan yang diambil adalah semua jaringan luka eksisi bersama dengan 1-2mm jaringan sehat disekitar luka (Wang, 2013). Selanjutnya jaringan diawetkan dalam larutan formalin 10%, diproses dan diblok dalam parafin dan dipotong dengan ketebalan 5µm dan diberi warna dengan hematoksilin eosin (HE) untuk dilihat hasilnya dibawah mikroskop (Manoj & Murugan, 2012).
4.6.11 Perlakuan setelah tindakan
Setiap kelompok tikus dianastesi dalam toples menggunakan kloroform per-inhalasi hingga mati, kemudian tikus dibungkus dengan polybag dan dikuburkan. 4.6.12 Pengamatan hasil
Jumlah sel fibroblast pada luka eksisi melalui pembuatan sediaan preparat histopatologi dengan pewarnaan hematoksilin eosin yang kemudian diamati di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400x dan dihitung jumlah sel fibroblast yang nampak pada enam lapangan pandang (Albaayit, S. F. A., Abba, Y., & Abdullah 2015).
1.7 Alur Penelitian
Anastesi dengan kloroform, lalu rambut bagian posterior tikus dicukur
Desinfeksi dengan povidone iodine dan alkohol 70%, lalu eksisi dengan luas 1 cm² dengan biopsy punch
Pemberian gel dan penggantian perban sehari sekali selama hari 7
Kel. 1 (Kontrol +)
Pemberian basis gel tanpa
ekstrak daun melati gambir (F4) Kel. 2 (perlakuan 1) Pemberian gel ekstrak daun melati gambir 3% (F1) Kel. 3 (perlakuan 2) Pemberian gel ekstrak daun melati gambir 6% (F2) Kel. 4 (perlakuan 3) Pemberian gel ekstrak daun melati gambir 12% (F3)
Pengambilan sediaan jaringan dengan menggunakan biopsy punch
Perlakuan setelah tindakan
Pengumpulan data
Aklimatisasi 24 tikus baik pakan dan lingkungan selama 7 hari
Penimbangan berat tikus untuk menghitung dosis kloroform
Analisis data
Gambar 4.1 Alur penelitian
Keterangan:
• Kelompok 1: 6 tikus (terhitung dengan jumlah tikus drop out) dengan pemberian basis gel tanpa ekstrak daun melati gambir sebagai kontrol • Kelompok 2: 6 tikus (terhitung dengan jumlah tikus drop out) untuk perlakuan 1
(pemberian gel ekstrak daun melati gambir 3%)
• Kelompok 3: 6 tikus (terhitung dengan jumlah tikus drop out) untuk perlakuan 2 (pemberian gel ekstrak daun melati gambir 6%)
• Kelompok 4: 6 tikus (terhitung dengan jumlah tikus drop out) untuk perlakuan 3 (pemberian gel ekstrak daun melati gambir 12%)
4.8 Analisis Data
Dikarenakan besar sampel ≤50, maka data-data yang telah diperoleh dianalisis dengan uji normalitas menggunakan uji Shapiro -Wilk. Uji normalitas digunakan untuk mengetahui apakah distribusi data normal. Sebaran data dinilai normal apabila p>0,05. Jika p<0,05 maka data tersebut dapat ditransformasi. Kemudian dilanjutkan uji homogenitas menggunakan uji varian Levene’s test untuk mengetahui bahwa dua atau lebih kelompok data sampel berasal dari populasi yang memiliki varians sama (homogen). Varian dinilai homogen bila p>0,05. Apabila uji normalitas didapatkan sebaran data tidak normal, maka dilakukan transformasi data dan jika sebaran data normal dapat lanjutkan uji non parametrik dengan uji Kruskal-Wallis dan dilanjutkan uji Post hoc Mann-Whitney. Jika data masing-masing kelompok terdistribusi normal dan varian antar kelompok homogen, maka dilakukan uji One-Way ANOVA. Hipotesis diterima bila perbedaan dianggap signifikan untuk nilai p<0,05. Bila hasil uji One-Way ANOVA menunjukkan adanya perbedaan signifikan, maka uji selanjutnya adalah melihat kelompok mana saja yang berbeda. bila varian sama, maka uji lanjut yang digunakan adalah uji Post Hoc Bonferroni (P. F, 2013).
