22 BAB 4
METODE PENELITIAN
4.1 Jenis Penelitian
Jenis penelitian yangidigunakan adalah eksperimenimurni (True experimental design) denganimetode Post Test ControliGroup Design denganipengukuran kadar TNFα dilakukanisetelah perlakuan.
4.2 Lokasi dan WaktuiPenelitianx
Penelitian ini dilakukan1di Laboratorium Biomedik1Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah1Malang dan akan dilanjutkan1dengan Uji Elisa1di Laboratorium Faal UniversitasiBrawijaya pada 17 November – 17iDesember 2018. 4.3 Populasi daniSampel Penelitiani
4.3.1 Populasix
Populasi yang digunakan1pada penelitian ini adalahitikus putih (Rattus novergicus strain wistar)ijantan.
4.3.2 Sampel
Tikus putihi (Rattus novergicusistrain wistar) jantaniyang sesuaiikriteria inklusi.
4.3.3 Besar sampelx
Terdapat 5 kelompok perlakuan1yaitu kontrol (+), kontrol1 (-) dan tiga kelompok1perlakuan yang masing-masing akan1diteliti selama 41minggu. Pada penelitian ini, ditentukanijumlah sampel menggunakan rumusiSteel & Torrie (1993 dalam Setiawan 2017) yaitu :
n = (Z1- α + Z𝛽)2 x 𝜎2 d2
Keterangan:
n = besar sampelimasing-masing kelompok
Z1- α = nilai pada kurvaidistribusi normal bakuxpada α tertentu Z𝛽 = nilai padapkurva distribusi normal bakuxpada 𝛽 tertentu 𝜎 = varianivariabel yang diteliti
d = selisih rerataxvariabel yang diteliti 𝛽 = power/kekuatan = 80% Z𝛽 = 0,851 α = 0,05 nilai Zα = 1,961
Menurut penelitianiyang dilakukan (Rospia, 2017), standartideviasi jahe merah 3,40. Maka: n = (1,96 + 0,85)2 x 𝜎2 d2 = (1,96 + 0,85)2 x 22 (3,4)2 = 2,73
Jadi sampel yang akan1digunakan tiap kelompok1percobaan sebanyak 3 ekori(n = 2,73 yang dibulatkan menjadi 3) dengan11 tikus sebagai cadanganidan jumlah kelompok yangiakan digunakan adalah 5ikelompok sehingga totalisampel penelitian ini adalahi20 ekor tikus.
4.3.4 Teknik pengambilan sampeli
Teknik pengambilan sampelimenggunakan Simple RandomiSampling. Sampel berasal dariitikus putih jantan (Ratuss norvegicus1strain wistar) yang telah dikelompokkan menjadi15 kelompok.
4.3.5 Karakteristik sampel penelitianx 4.3.5.1. Kriteria inklusid
a. Umur tikusi2-3 bulan b. Berat badani150-250 gram
c. Tikus jantani(Rattus norvegicus strain wistar)
d. Sehat, ditandai denganigerakan yang aktif, mata jernih danibulu yang tebal.
4.3.5.2. Kriteria eksklusit
a. Tikus yang cacatisebelum proses penelitian b. Tkus yang sakitisebelum proses penelitian c. Tikus yang matiisebelum proses penelitian 4.3.5.3. Kriteria drop outx
a. Tikus yang sakitiselama penelitian b. Tikus yang matiiselama penelitian
4.3.6 Variabel penelitianx 4.3.6.1 Variabel bebas
Variabel bebas dalamipenelitian ini adalah berbagaiidosis ekstrak jaheimerah (Zingiber officinale var. rubrumiTheilade).
4.3.6.2 Variabeliterikat
Variabel terikat dalamipenelitian ini adalahikadar TNF-α padaitikus putih jantani(Rattus norvegicusistrain wistar)
4.3.7 Definisidoperasional Tabel 4.1 DefinisibOperasional
No. Variabel Definisi
Operasional Hasil Ukur
Cara Ukur
Variabel Alat Ukur
Skala Ukur Variabel Variabel bebas 1. Dosis jahe merah Ekstrak jahe merah didapat dari UPT Materia Medika Dinas Kesehatan, Kota Batu, Provinsi Jawa Timur Dosis jahe merah (100 mg/kgBB, 200 mg/kgBB, dan 400 mg/kgBB) dan diberikan selama 28 hari Diberikan ekstrak sesuai dois Neraca elektrik Kategorik (Ordinal) Variabel terikat 2. Kadar TNF-α TNF-α merupakan salah satu sitokin pro-inflamasi Penurunan kadar TNF-α dalam satuan pg/ml
Tes ELISA Human TNF-α Immuno-assay Quantikin e Elisa kit Numerik (Rasio)
4.4 Alat dan Bahan Penelitian 4.4.1 Alat penelitian
1. Alat perlakuanitikus: kandang tikus ukurani25 cm X 25icm X 25icm, botol air, timbanganielectric scale, spuit 3icc, handscoon, scalpel, sonde
2. Alat pembuataniekstrak: Oven, incubator, rotaryievaporator, kertas saring whatmaninomor 2, blender, pisau, danipengaduk
3. Alat pengukuran kadariTNF-α : Microplate Reader, ELISAikit 4.4.2 Bahan penelitianf
1. Bahan perlakuanitikus: Tikus putih jantanigalur wistar usia 2-3ibulan dengan berat 150 – 250 gr, pakanistandart, aquades, alkoholi50%, chloroform 2. Bahan pembuatan ekstrakijahe merah: etanol 95i%, aquades, dan jaheimerah
masak denganiberat 2 kg .
3. Bahan pengukuraniTNF-α : serum darahihewan coba 4.5 ProsedurxPenelitian
4.5.1 Prosesfadaptasi
Tikus diadaptasikan selama17 hari, kemudian dilakukan1pengelompokan secara random menjadi15 kelompok. Tiap kelompok1terdiri atas 4 ekor1tikus. Adaptasi bertujuan agar1tikus menyesuaikan dulu dengan1lingkungan baru.
4.5.2 Pembagiangkelompok tikus
Tikus yang digunakan1sebanyak 20 ekor yang1terbagi menjadi 51kelompok yaitu kelompok kontrol1positif, kontrol negatif dan1tiga kelompok perlakuan. Kelompok1kontrol negatif digunakan untukimengetahui kadar normal dariiTNF-α.
4.5.3 Pembuatan ekstrakijahe merah
Ekstrak jahe merah diperoleh1dengan menggunakan metode1maserasi. Rimpang jahe merah1sebanyak 1 kg dibersihkan1dan dipotong setebal 1-21mm kemudian dikeringkan. Rimpang1jahe yang telah keringiditumbuk hingga halus untukimendapatkan serbuk (simplisia) sebanyaki300 g. Serbuk jahe merahisebanyak 300 g ditimbangidan dimasukkan dalam toplesikaca, ditambahkan pelarut etanoli96% sebanyak 1,5 liter. Diamkanmselama 24 jam padamtemperatur kamar dengan pengadukan1setiap 2 jam. Kemudian1ekstrak jahe merah disaring1hingga didapatkan ekstrak jahe1merah yang sempurna (Qoyyimah, 2012 dalam Putri, 2014).
4.5.4 Penentuan dosisgekstrak jahe merahx
Berdasarkan penelitian Elrokh1et al. (2010), melaporkan1bahwa dosis jahe merah1200 mg/kgBB per oral1terbukti mempunyai mekanisme melalui1efek antioksidan dan anti-inflamasi. Pemilihan1dua dosis lainnya didapatkan dari1setengah dosis dan dua1kali dosis 200 mg/kgBB, dikarenakaniuntuk mengetahui apakah dosisijahe merah tersebut tetapimemiliki efek. Sehingga didapatkanidosis yang digunakan dalamipenelitian ini adalah 100img/kgBB, 200 mg/kgBB, dani400 mg/kgBB. Hal ini berartiisebagai berikut :
a. Dosis untuk kelompokiperlakuan 1
Pada tikus berat rata-ratai200 gr, maka dosis per ekoritikus sebesar : 200 gr = 0,20 kg, maka 100 mg/kgBB x 0,20 kg = 20 mg
b. Dosis untukikelompok perlakuan 2 200 mg/kgBB x 0,20 kg = 40 mg c. Dosis untuk kelompokiperlakuan 3
400 mg/kgBB x 0,20 kg = 80 mg 4.5.5 Penentuan dosis obat anti tuberkulosis
Tabel 4.2 Penentuan Dosis Obat Anti Tuberkulosis berdasarkan Kelompok Berat Badan Pasien
OAT Berat Badan (BB)
< 33 kg 33–50 kg 51–70 kg >70 kg Pirazinamid (Z) 20–30 mg/kg/hari 750–1.500 mg 1.500–1.750 mg 1.750–2.000 mg Etambutol (E) 20–30 mg/kg/hari 800–1.200 mg 1.200–1.600 mg 1.600–2.000 mg Levofloksasin (Lfx) 7,5–10 mg/kg/hari 750 mg 750 mg 750–1.000 mg (Reviono,2014)
Tabel 4.3 Konversi Dosis Mencit 20 g Tikus 200 g Marmut 400 g Kelinci 1,5 kg Kucing 1,5 kg Kera 4 kg Anjng 12 kg Manusia 70 kg Mencit 20 g 1.0 2,0 12,23 27,8 29,7 64,1 124,2 387,9 Tikus 200 g 0,14 1,0 1,74 3,9 4,2 9,2 17,8 56,0 Marmut 400 g 0,0 8 0,57 1,0 2,25 2,4 5,2 10,2 31,5 Kelinci 1,5 kg 0,04 0,25 0,44 1,0 1,08 2,4 4,5 14,2 Kucing 1,5 kg 0,03 0,23 0,41 0,92 1,0 2,2 4,1 13,0 Kera 4 kg 0,016 0,11 0,19 0,42 0,43 0,1 1,9 6,1 Anjng 12 kg 0,008 0,06 0,1 0,22 1,24 0,52 1,0 3,1 Manusia 70 kg 0,0026 0,018 0,031 0,07 0,076 0,16 0.32 1,0 (Laurence, 2008)
Konversi dosis obat anti tuberkulosisipada manusia ke tikus wistar : a. Etambutol
Dosis pada manusia = 1600-2000 mg/kg/hari
Dosis pada tikus = Dosis pada manusia X berat badan tikus (kg) = 0,018 X 2000 mg = 36 mg/kgBB tikus
b. Pirazinamid
Dosis pada manusia = 1750 - 2000 mg/kg/hari
Dosis pada tikus = 0,018 X 2000 mg = 36 mg/kgBB tikus c. Levofloksasin
Dosis pada manusia = 750 – 1000 mg/kg/hari
Dosis pada tikus = 0,018 X 1000 mg = 18 mg/kgBB tikus
Perlakuan dengan memberiiobat anti tuberkulosis secara oral, ietambutol : 36 mg/hari, pirazinamid : 36 mg/hari,ilevofloksasin : 18 mg/hari
4.5.6 Proses anastesig
Proses anastesi dilakukan satuipersatu terhadap hewan cobaidengan cara memasukkan hewanike toples yang berisi kapasiyang sudah dicampuridengan kloroform. Kloroformiadalah bahan yang mudah didapat. Anastesiidilakukan secara inhalasi padaihewan coba dengan dosisi10 ml per 10 hewanicoba, anastesi dilakukan sampaiitikus pingsan, lalu diangkatidari toples pembiusan untukidilakukan pembedahan.
4.5.7 Prosedur pengukuran kadariTNF-α menggunakan ELISA kit
Untuk mengukur kadariTNF-α, maka akan dilakukan denganimetode Enzim Linked ImmunosorbentiAssay (ELISA), langkah-langkahnyaisebagai berikut:
1. Pengambilan sampelidarah dengan spuit 2. Masukkan dalam venojectiplain ukuran 5 ml
3. Dilakukan sentrifuse pada 3000irpm selama 15 menit untuk memisahkan serumidari endapan dalam 30 menitisesudah pengambilan
4. Serum yang didapat disimpan1dalam suhu -20 derajat1C, jika tidak langsung dianalisis
5. Diserahkan ke Laboratorium FaaliUniversitas Brawijaya untuk dilakukanites ELISA yang bertujuanimenentukan tingkat TNF-α menggunakaniHuman TNF-α ImmunoassayiQuantikine ELISA kit
4.5.8 Penanganan hewan cobaisetelah pengambilan specimen
Setelah hewan coba1dibedah, harus dipastikan bahwa1hewan coba tidak mengalami1recovery. Selanjutnya hewan coba1yang sudah dipastikan1mati, dikumpulkan menjadi satu laluidikubur (Alexandru, 2011)
4.6 Alur Penelitian
Sampel 20 hewan coba memenuhi kriteria inklusi. Adaptasi selama 7 hari dengan diberi pakan standart dan minum
Setiap tikus dianastesi dengan 0,67 ml kloroform pekat secara inhalasi Kelompok kontrol negatif pemberian pakan standart selama 28 hari Kelompok dosis 1 pemberian Etambutol, Pirazinamid, Levofloksasin + ekstrak jahe merah dosis 100 mg/kgBB selama 28 hari Kelompok dosis 3 Pemberian Etambutol, Pirazinamid, Levofloksasin + ekstrak jahe merah dosis 400 mg/kgBB selama 28 hari Kelompok dosis 2 pemberian Etambutol, Pirazinamid, Levofloksasin +ekstrak jahe merah dosis 200 mg/kgBB selama 28 hari
Pengambilan sediaan darah hewan coba :
a. Abdomen dan thorak hewan coba dibedah
b. Mengambil darah dari ventrikel kiri jantung hewan coba sebanyak 3 ml menggunakan spuit 5 cc
c. Setelah tikus dibedah dikumpulkan menjadi satu lalu dikubur
Pengukuran kadar TNF-α menggunakan tes ELISA
Analisis data menggunakan uji saphiro wilk, levene test, one way annova, uji bonferroni dan regresi
Kelompok kontrol positif pemberian OAT selama 28 hari
Gambar 4.1 Alur Penelitian
Hari ke 36 Hari ke 1-7 Hari ke 8-35
4.7 AnalisiskData
Data dari hasil percobaanidianalisis menggunakan:
1. Uji Normalitas dengan menggunakaniUji Shaphiro Wilk untukimengetahui kenormalan data (dataibersifat normal jika sig > 0,05). Jikaidata normal maka dilakukaniUji One Way Annova. Jikaidata tidak normal makaidilakukan uji Kruskal Wallisidan uji Post hociMann Whitney.
2. Uji Homogenitas menggunakan LeveneiTest untuk mengetahui kehomogenan varianidari data-data yang diperoleh (data bersifat homogenijika sig > 0,05). Jika data homogenimaka dilanjutkan uji Post HociBonferroni. Jika data tidak homogenimaka dilakukan uji PostiHoc Tamhane’s
3. One Way ANOVA untukimengetahui perbedaan antar kelompokiperlakuan, berbeda secara signifikaniatau tidak dengan kadariTNFα plasma bilaisyarat terpenuhi, dengan tingkatikepercayaan p = 0,05, dimanaiapabila diperoleh p> 0,05 artinyaitidak ada perbedaan yangibermakna, sebaliknya bila p < 0,05 menunjukkaniadanya perbedaan yangibermakna.
4. Uji Post Hoc merupakaniuji kelanjutan dari ujiiANOVA, digunakan untuk mengetahuiiperbedaan yang bermakna antarikelompok perlakuan dalam penelitian.
5. Uji Regresi Linier Sederhanaidigunakan untuk memprediksi penggunaanidosis (dalam 1 mg) terhadapikadar TNFα.
4.8 JadwalxPenelitian Tabel 4.4 JadwalsPenelitian
No Jenis Kegiatan Bulan
10 11 12 1
1. Pengurusan Izin x x 2. Persiapan bahan
dan hewan coba
x x x
3. Adaptasi hewan pakan hewan coba
x 4. Pemberian perlakuan x x x x 5. Pengukuran kadar TNF-α x x x 6. Analisa data x 7. Konsultasi dan revisi akhir x x
