Peran Alpha-S2 kasein Susu Kambing PE Terhadap Perbaikan Morfologi dan Histologi Membran Synovial Tikus Rheumatoid Arthritis
Rivqi Rifa Bia1, Aris Soewondo1, Fatchiyah Fatchiyah 1.2
1) Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya Malang 2) Laboratorium Biosains Universitas Brawijaya
ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk menganalisa efek pemberian alpha-S2 kasein susu kambing PE terhadap perubahan morfologi dan histologi membran sinovial tikus Rheumatoid Arthritis (RA). Tahapan penelitian meliputi pembuatan RA menggunakan multidosis CFA (Complete Freud Adjuvant. Kelompok perlakuan dibagi menjadi (C: Kontrol; CM: Kontrol + alpha-S2 kasein; RA: Rheumatois Arthritis; RAM: Rheumatois Arthritis + alpha-S2 kasein). Treatment RA dilakukan selama 2 bulan dengan dosis 2mg/kg. Analisa morfologi dilakukan dengan skoring perubahan bentuk kaki dan histologi menggunakan metode HE yang divisualisasi menggunakan mikroskop BX53. Hasil penelitian menunjukkan adanya perbaikan morfologi yang ditandai dengan penurunan hasil skor klinis (C = 0; RA = 4; CM = 0; RAM = 1.3). Perbaikan histologi terletak pada penurunan jumlah hiperplasia pada kelompok RA + alpha-S2 kasein menuju kondisi normal dimana penurunan level tersebut mengidikasikan alpha-S2 kasein dapat digunakan sebagai alternatif penyembuhan RA.
Kata kunci: alpha-S2 kasein, CFA, HE, Rheumatoid arthritis
ABSTRACT
The aim of this study is to analyze the effect of alpha-S2 casein of goat Ethawah breed milk to prove morphological and histological synovial membrane of Rheumatoid Arthritis rat models. Twelve of rats divided into four groups: 3 normal rats, 3 normal + treatment, 3 rats of RA-induced CFA (multi doses) and 3 rats RA + treatment that induced by 2mg/kg BW alpha-S2 casein every day during two months. Inflammation leg of all rats was scored by change leg morphology. And histological slide stained by HE and measured using BX-53 microscope. The result shows the alpha-S2 casein of goat Ethawah breed milk can prove to be normally of the inflammation leg and histological synovial membrane leg. That indicate that goat Ethawah breed milk can use as rheumatoid arthritis healing.
Keywords: alpha-S2 kasein, CFA, HE, Rheumatoid arthritis
* corresponding author: Prof. Fatchiyah, PhD. e-mail: fatchiya@ub.ac.id; fatchiya@gmail.com
Jurusan Biologi, FMIPA-UB, Jl Veteran, Malang 65145, Indonesia
PENDAHULUAN
Rheumatoid arthritis (RA) merupakan penyakit autoimun yang ditandai dengan adanya peradangan, gejala nyeri, kekakuan, dan pembengkakan (inflamasi) sendi yang berakibat pada kerusakan kartilago, erosi tulang, hingga berdampak lanjut pada kelainan bentuk tulang [1]. Inflamasi terjadi karena adanya over produksi sitokin proinflamasi seperti interleukin (IL-1, IL-6, IL17), tumor necrosis factor (TNFα) dan lainnya yang meningkat sehingga
oleh TNF-α yang menghambat pematangan dan fungsi osteoblast[5], meskipun dalam kondisi tertentu ikatan antara Il-17 dengan Il-13, TGF-β, DAN Igf-1 berperan dalam pembentukan kartilago tulang [6].
Pengobatan RA selama ini bersifat sintetik dan mahal serta berdampak pada jangka yang lama, hal ini dapat ditekan dengan pola hidup sehat dengan asupan nutrisi yang cukup. Nutrisi merupakan bahan penting untuk tubuh, salah satu nutrisi yang penting dalam tubuh adalah susu kambing PE, selain itu olahan susu baik susu segar maupun yogurt mengandung biopeptida aktif alpha-S2 kasein yang berada pada 36kDa [7] dan [8]. Berdasarkan hal tersebut, penelitian ini dilakukan untuk mengetahui efek pemberian protein alpha-S2 kasein terhadap perubahan bentuk morfologi dan histologi.
METODE
Penelitian ini mendapatkan sertifikat Kelaikan Etik No.90-KEP-UB tertanggal 29 Maret 2012, dari KEP UB.
Hewan coba. Hewan coba dalam penelitian ini menggunakan tikus jantan strain wistar dengan umur 3 bulan dengan berat badan 300 ± 30, hewan coba diperolehdari Universitas Gajah Mada Jogjakarta yang diaklimatimatisasi selama 1 minggu.
Model dan kelompok perlakuan. Model perlakuan RA menggunakan CFA. Injeksi yang digunakan secara subkutan dan intraperitonial. Kelompok perlakuan terbagi menjadi 4 kelompok yaitu (C: Kontrol; CM: Kontrol + alpha-S2 kasein; RA: Rheumatois Arthritis; RAM: Rheumatois Arthritis + alpha-S2 kasein).
Isolasi casein. Isolasi casein dilakukan dengan pengambilan sampel susu diambil 250 mL dipanaskan hingga suhu 400C dan diteteskan asam asetat glasial sampai terjadi gumpalan, setiap 5 tetes dilakukan pengadukan. Setelah terjadi gumpalan ditambahkan 1 gram kalsium karbonat untuk menetralisir pH, kemudian dilakukan penyaringan dengan kain nilon dan endapan dimasukkan dalam mikrotube 1,5 mL. Setelah dimasukkan dalam tube ditambahkan Tris HCL pH 6,8 dan dilakukan pengukuran kadar protein dengan nanodrop dan disimpan dalam suhu -200C jika tidak langsung digunakan [modifikasi 9].
Analisa inflamasi. Analisa inflamasi dilakukan dengan cara skoring perubahan morfologi dan histologi jaringan synovial.
Dosis sonde. Sonde dilakukan untuk memberikan protein alpha-S2 kasein dengan dosis 2 mg/kg BB [modifikasi 10].
Pengambilan organ sendi. Pengambilan organ sendi dilakukan pembedahan dengan dislokasi ekor dan disimpan pada suhu 40 C dalam PFA (PBS dengan pelarut PFA) .
Histologi paraffin. Pembuatan sediaan paraffin diambil dari organ yang telah disimpan dalam 4% PFA dan dicuci dengan PBS dua kali sebelum dilakukan rangkaian histologi sampai pada pemotongan dengan mikrotom.
Pewarnaa HE (hematoksilin eosin). Pembuatan sediaan HE dimulai dengan deparafinasi dengan cara perendaman organ dalam xylol dengan lama perendaman 10 menit, dan dilanjutkan dengan perendaman kedua selama 5 menit. Ketika organ selesai direndam dalam xylol dilanjutkan dengan perendaman pada etanol absolut, 90%, 80%, 70% dengan lama perendaman 5 menit. Pencucian dengan PBS dilakukan tiga kali masing-masing 5 menit dan dilanjutkan dengan dikering anginkan. Setelah organ kering dimasukkan kedalam hematoksilin selama 2 menit untuk memberi warna ungu pada organ, dilanjutkandengan pencucian menggunakan air mengalir selama 5 menit atau secukupnya dan dikering anginkan. Organ yang telah dikering anginkan dilanjutkan dengan pemberian eosin selama 5 sampai 10 menit atau secukupnya, lalu dilakukan dehidrasi dengan etanol bertingkat dari 70 % dilanjutkan dengan etanol absolut 2 kali masing-masing 2 menit dan dilanjutkan dengan pemberian enthelan jika langsung diamati atau dengan penyimpanan pada kotak preparat [11].
HASIL DAN PEMBAHASAN
RA = 4; CM = 0; RAM = 1.3) dimana 0: Normal; 1: Inflamasi dengan ruam merah pada kaki, sendi, dan sedikit pembengkakan kaki; 2: Pembegkakan bagian punggung kaki; 3: Pembengkakan bagian punggung kaki dan beberapa jari; 4: Pembengkakan bagian punggung kaki dan semua jari berdasarkan kriteria Hongxiang [12]. Perubahan tersebut menandakan perbaikan morfologi bentuk kaki (Gambar1).
Gambar1. Perubahan morfologi kaki (a).kontrol (b). RA; (C):Kontrol + S2 kasein; (d).RA + alpha-S2 kasein). Perubahan ditunjukkan dengan anak panah. Panah kuning menunjukkan kondisi normal, panah merah menunjukkan adanya inflamasi pada kelompok RA.
Rheumatoid Arthritis (RA) tidak lepas dari faktor imunitas tubuh selain lingkungan yang mendukung dan kesempatan seperti merokok yang dapat meningkatkan resiko rheumatoid arthritis dengan adanya trigger terjadinya mutasi atau modifikaasi genetic, melalui peptil arginil deimiinase tipe IV (PADI4) yang menghasilkan perubahan hilangnya toleransi pada protein mukosa maupun kontaminasi dengan mikroba [13] sehingga permodelan RA mengunakan CFA yang mengandung bakteri 0,5 mg/ml sehingga memberikan efek peradangan yang dapat mengakibatkan inflamasi kronis serta terjadinya autoimun terutama rheumatoid arthritis dengan dosis tertentu [14][15].
Over produksi sitokin seperti Tumor Necrosis Factor alpha (TNF α) dan proinflamasi lain seperti IL-1, IL-6, dan IL-17 yang menginduksi peradangan pada sendi dan
meningkatan proliferasi synoviocyte inflamasi serta kehancuran sel. Rheumatoid arthritis berlanjut pada peradangan sendi, degradasi tulang dan adanya inflamasi yang bisa menjadikan kondisi yang sama dengan osteoporosis, dan berubahnya sisitem metabolism dan imunitas tubuh [1], kondisi ini diawali dengan adanya diferensiasi osteoklas menjadi mature melewati proses migrasi, invasi, dan homing precursor osteoklas menuju tulang dari sirkulasi perifer, sel ini terbentuk karena adanya diferensiasi dan fusi dari monosit makrofag mononuclear melalui stimulasi RANKL dan Macrophage Colony Stimulating Factor (M-CSF) [16].
Induksi alpha-S2 kasein susu kambing segar PE dalam terapi RA menunjukkan adanya penurunan sel yang mengalami hyperplasia pada histologi dengan pewarnaan HE, dimana sel yang mengalami hipertropi dan berlanjut hyperplasia tersebut dalam keadaan hipoksia mengalami pertumbuhan abnormal yang menjadikan lapisan sinovium menebal dan membengkak yang ditunjukkan dengan banyaknya inti sel pada kelompok RA dan mengalami penurunan pada kelompok RA+ alpha-S2 kasein seperti pada kelompok kontrol dan kontrol + alpha-S2 kasein (Gambar2) sehingga dalam keadaan normal susu segar kambing PE aman untuk dikonsumsi dikonsusmsi.
Jaringan synovial normal mengandung mesenchymal, fibroblast-like synoviocytes (FLSs) dan makrofag dalam jumlah yang seimbang, namun dalam kondisi RA sinovium mengalami hyperplasia dimana komponen tersebut meningkat menjadikan over produksi baik pada sitokin, kemokin, molekul adhesi, matriks metalloproteinase (MMPs), dan jaringan inhibitor dari metalloproteinase (TIMPs) dan FLSs. Hyperplasia sel terjadi karena peningkatan FLSs, mutasi gen p53, stress protein (misalnya, heat-shock protein 70), modulasi Fungsi retikulum endoplasmatic oleh synoviolin yang merupakan ligase ubiquitin E3 yang mengatur keseimbangan proliferasi sel dan apoptosis, sintesis Matrix metalloproteinase (MMPs). MMPs disekresikan oleh sel sebagai inaktif zymogen dan diaktifkan oleh proMMP-3, pengaktifan tersebut menyebabkan komponen matrix ekstraselluler terdegradasi dan menyebabkan kerusakan tulang [1]. Selain komponen matrix karena adanya over produksi sitokin seperti Tumor Necrosis Factor alpha (TNF α) dan proinflamasi lain seperti IL-1, IL-6, dan IL-17. Fungsi dari sel Th17 adalah menghilangkan patogen sedangkan IL-17 merupakan inducer poten peradangan [17]. Peningkatan IL-17 dalam cairan sinovial merangsang osteoklastogenesis yang bergantung pada osteoblast [18] hal ini didukung dengan peran pro - osteoklastogenik dari IL-17 secara in vitro dan in vivo [19]. IL-17 menstimulasi osteoklastogenesis dalam co-kultur osteoklas dan makrofag sumsum tulang (prekursor osteoklas), namun tidak berpengaruh terhadap diferensiasi makrofag, hal ini menunjukkan bahwa IL-17 menginduksi ekspresi RANKL (osteoklas faktor diferensiasi) pada osteoklas serta adanya induksi osteoblas [20]. Membran sinovial pada rheumatoid terkait dengan peningkatan ekspresi miR-155 dan Src homologi 2 yang mengandung inositol fosfatase-1 (SHIP-1) menjadikan tingginya produksi sitokin proinflamasi [21].
KESIMPULAN
Kesimpulan dari penelitian ini adalah pemberian protein kasein pada terapi RA dapat menurunkan inflamasi berdasarkan skor RA yang ditandai dengan perubahan morfologi bentuk kaki menuju pada konsdisi normal dan penurunan sel yang mengalami hiperthropi dan
hyperplasia, sehingga terapi dengan kasein susu kambing PE dapat dijadikan alternative penyembuhan Rheumatoid Artritis.
UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan Terima Kasih disampaikan kepada Laboratorium Biosains UB, dan Pak Bambang Setiawan atas bimbingannya. Penelitian ini didanai oleh sebagian dana riset Program Ristek Unggulan Perguruan Tinggi 2012-2014, Program Desentralisasi UB, DIKTI Kementerian Pendidikan dan Kebudayaan,.
DAFTR PUSTAKA
[1]. Scheett, G and Ian B.M. 2011. The Pathgenesis of Rheumathoid Arthritis. The New England. Journal of Medicine. 365:2205-19.
[2]. Breenan, F. M. and I. B. Mc Innes. 2008. Evidence that Cytokines Play a Role in Rheumathoid Arthritis. Journal of Clinical Investigation. 118, 11.
[3]. Walsh NC, Reinwald S, Manning CA, Condon KW, Iwata K, Burr DB, Gravallese EM. 2009. Osteoblast function is compromised at sites of focal bone erosion in inflammatory arthritis. J Bone Miner Res.24:1572–1585
[4]. Hein G. E. 2006. Glication end product in Osteoporosis is there a pathophisyologic importance?. Clinica Cimic Acta. 371: 32-36.
[5]. Diarra D, Stolina M, Polzer K, Zwerina J, Ominsky MS, Dwyer D, Korb A, Smolen J, Hoffmann M, Scheinecker C, Heide D van Interleukin 17 Induces Cartilage Collagen Breakdown: Novel Synergistic Effects in Combination with Proinflammatory Cytokines. Ann Rheum Dis 61: 704-713. doi: 10.1136/ard.61.8.704.
[8]. Budiarti, I. K., Masdiana P. D., Fatchiyah. 2013. Nutritional Composition and Protein Profile of Goat Yogurt PE with Double Culture between Streptococcus thermophiles and Lactobacillus species. Cukorova Medical Journal. 38(4): 681-686.
[9]. Pavia, Lampman, Kriz & Engel, Saunders. 2000. Isolation of Casein, Lactose, and Albumin from Milk. Adapted by R. Minard (Penn State Univ.) from Introduction to Organic Laboratory Techniques: A Microscale Approach. [10]. Nyborg, N C B, Anders Fuglsang, Dan N.
Applied and Enviromental Microbiology. 2002. p. 3566–3569 Vol. 68, No. 7
2240/02/$04.00 0 DOI:
10.1128/AEM.68.7.3566–3569.
[11]. John D, Bancroft, Marilyn Gamble. 2008. Theory and Practice of Histological Techniques”.6th edition. Churchill Livingstone, Elsevier, b. p 171.
[12]. Hongxiang, B. Zheng S, Wang K, Fan L, Shi Zhibin, Chen J. 2013. The pain-related behavior changes correlate with the bone damage in a rat model of rheumatoid arthritis. Journal of Medical Colleges of PLA 28. 160-173.
[13]. Wegner N, Wait R, Sroka A. 2010. . Peptidylarginine deiminase from Porphyromonas gingivalis citrullinates human fibrinogen and α-enolase: implications for autoimmunity in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 62:2662-72.
[14]. Biliau, A. and P. Matthys. 2001. Modes of action of Freud’s Adjuvant in Experimental Models of Autoimmune Diseases. Journal of Lymphosite Biology. 70(6) 849-860.
[15]. Shakya A. K, and Nandakumar K. S. 2012. Applications of polymeric adjuvants in studying autoimmune responses and vaccination against infectious diseases. J R Soc Interface. 10: 20120536.
[16]. Saltel F, Chabadel a, Zhao Y, Lafage Proust M, Clezardin P, Jurdic P, Bonnelye E. 2006. Transmigration a New Property of Mature Multinucleated Osteoclast. Journal of Bone and Mineral Reseach. 21 (12): 1913-1923.
[17]. Kotake, S., Udagawa, N., Takahashi, N., Matsuzaki, K., Itoh, K., Ishiyama, S., Saito, S., Inoue, K., Kamatani, N., Gillespie, M. T., Martin, T. J. and Suda, T. 1999. IL-17 in synovial fluids from patients with rheumatoid arthritis is a potent stimulator of osteoclastogenesis. J. Clin. Invest. 103, 1345-1352.
[18]. Van Bezooijen, R. L., Farih-Sips, H. C., Papapoulos, S. E. and Lowik, C. W. 1999. Interleukin-17: A new bone acting cytokine in vitro. J. Bone Miner. Res. 14, 1513-1521.
[19]. Sato, K., Suematsu, A., Okamoto, K., Yamaguchi, A., Morishita, Y., Kadono, Y., Tanaka, S., Kodama, T., Akira, S., Iwakura, Y., Cua, D. J. and Takayanagi, H. 2006. Th17 functions as an osteoclastogenic helper T cell subset that links T cell activation and bone destruction. J. Exp. Med. 203, 2673-2682. [20]. Bush, K., Farmer, K., Walker, J. and
Kirkham, B. 2002. Reduction of joint inflammation and bone erosion in rat adjuvant arthritis by treatment with interleukin-17 receptor IgG1 Fc fusion protein. Arthritis Rheum 46: 802–805. [21]. Kurowska-Stolarska M, Alivernini S,
