KULTUR JARINGAN PADA WORTEL
DI
S
U
S
U
N
OLEH:
▸ Baca selengkapnya: contoh soal kultur jaringan
(2)BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Perbanyakan tanaman dalam jumlah besar dan dalam waktu yang singkat dan tempat terbatas sangat dibutuhkan dalam upaya peningkatan kualitas pertanian. Kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara vegetatif. Dengan metode kultur jaringan dapat dihasilkan tanaman baru secara in vitro dengan jumlah yang tidak terbatas, yang menjadi dasar dari teknik kultur jaringan ini adalah kemampuan sel suatu tanaman yang dapat tumbuh menjadi tanaman sempurna apabila ditempatkan di lingkungan yang tepat. Kemampuan sel tanaman yang seperti ini disebut dengan totipotensi sel, yaitu kemampuan sel untuk beregenerasi menjadi tanaman lengkap kembali.
Bagian dari tanaman yang dapat dikulturkan (diperbanyak) adalah daun muda, mata tunas, ujung akar, keping biji dan bagian lainnya yang bersifat meristematik, yaitu mudah tumbuh dan berkembang. Bagian-bagian tubuh tanaman tersebut dikulturkan dan ditumbuhkan kembali dalam kondisi aseptik (steril) yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman lengkap. Beberapa jenis tanaman yang belakangan ini dilakukan perbanyakan secara kultur jaringan adalah anggrek, daun dewa, krisan dan manggis.
Melalui kultur jaringan tanaman dapat diperbanyak setiap waktu sesuai kebutuhan karena faktor perbanyakannya yang tinggi. Bibit dari varietas unggul yang jumlahnya sangat sedikit dapat segera dikembangkan melalui kultur jaringan. Pada tanaman perbanyakan melalui kultur jaringan, bila berhasil dapat lebih menguntungkan karena sifatnya akan sama dengan induknya (seragam) dan dalam waktu yang singkat bibit dapat diproduksi dalam jumlah banyak dan bebas penyakit. Kultur jaringan adalah metode perbanyakan vegetatif dengan menumbuhkan sel, organ atau bagian tanaman dalam media buatan secara steril dengan lingkungan yang terkendali.
Oleh karena itu, penulisan makalah ini sangatlah diperlukan guna untuk memberikan informasi kepada masyarakat tentang aspek-aspek mengenai kultur jaringan.
1.2. Rumusan Masalah
Adapun rumusan masalah dalam penulisan makalah ini adalah: 1. Bagaimana pengertian dan prinsip dasar dalam kultur jaringan ? 2. Bagaimana tipe-tipe dari kultur jaringan?
3. Bagaimana keterkaitan antara totipotensi dan kultur jaringan, serta perbedaan perbanyakaan alami dalam kultur jaringan?
4. Apa saja peralatan dan fasilitas dalam kultur jaringan?
5. Bagaimana metode-metode pelaksanaan dan tahapan dalam kultur jaringan?
6. Apa saja yang mempengaruhi regenerasi pada kultur jaringan,, serta apa saja kendala dan masalah yang terjadi didalam kultur jaringan?
7. Apa saja kelebihan dan kekurangan didalam kultur jaringan?
1.3. Tujuan Makalah
Adapun tujuan yang ingin dicapai dalam penulisan makalah ini adalah: 1. Mengetahui pengertian dan prinsip dasar dalam kultur jaringan ? 2. Mengetahui tipe-tipe dari kultur jaringan?
3. Mengetahui keterkaitan antara totipotensi dan kultur jaringan, serta perbedaan perbanyakaan alami dalam kultur jaringan?
4. Mengetahui peralatan dan fasilitas dalam kultur jaringan?
5. Mengetahui metode-metode pelaksanaan dan tahapan dalam kultur jaringan?
6. Mengetahui apa saja yang mempengaruhi regenerasi pada kultur jaringan dan apa saja kendala dan masalah yang terjadi didalam kultur jaringan?
BAB II
PEMBAHASAN
Kultur jaringan bila diartikan ke dalam bahasa Jerman disebut Gewebe kultur atau tissue culture (Inggris) atau weefsel kweek atau weefsel cultuur (Belanda). Kultur jaringan adalah metode yang sangat diperlukan dalam perbaikan tanaman non-konvensional. Kelebihan lain dari teknik ini yaitu jumlah perolehan tanaman baru hasil kultur jaringan ini banyak, serta lebih aman dari serangan virus dan dalam waktu yang relatif singkat.
Kultur jaringan adalah serangkaian kegiatan yang dilakukan untuk membuat bagian tanaman (akar, tunas, jaringan tumbuh tanaman) tumbuh menjadi tanaman utuh (sempurna) dikondisi invitro (di dalam gelas). Keuntungan dari kultur jaringan lebih hemat tempat, hemat waktu, dan tanaman yang diperbanyak dengan kultur jaringan mempunyai sifat sama atau seragam dengan induknya. Contoh tanaman yang sudah lazim diperbanyak secara kultur jaringan adalah tanaman anggrek.
Perbanyakan tanaman dengan kultur in vitro telah banyak diusahakan secara komersial di negara maju seperti Amerika, Jepang, dan Eropa. Pemanfaatan teknologi tersebut untuk pengadaan bibit pada awalnya berdasarkan hasil percobaan Morel tahun 1960 pada anggrek Cymbidium. Dalam waktu yang singkat dari bahan tanaman yang sangat terbatas dapat dihasilkan bibit dalam jumlah yang banyak. Keberhasilan tersebut mendorong dimanfaatkannya in vitro sebagai teknologi perbanyakan yang banyak memberikan keunggulan daripada teknologi konvensional.
Kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara vegetatif. Menurut George dan Sherrington (1984) dan Yusnita (2003), kultur jaringan tanaman merupakan teknik menumbuh kembangkan bagian tanaman baik berupa sel, jaringan atau organ dalam kondisi aseptik secara in vitro. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman lengkap. Meskipun pada prinsipnya semua sel dapat ditumbuhkan, sebaiknya dipilih bagian tanaman yang masih muda dan mudah tumbuh seperti anakan atau mata tunas.
tempat steril. Penggunaan kultur jaringan untuk pembiakan klonal didasarkan pada anggapan bahwa jaringan secara genetik tetap stabil jika dipisahkan dari tumbuhan induk dan ditempatkan dalam kultur. Pendapat ini sebahagian besar berlaku jika tumbuhan dibiakkan dengan kuncup ketiak atau tunas liar yang secara langsung dipisahkan dari tanaman. Walaupun demikian, apabila tunas terbentuk dari jaringan kalus, sering terjadi penyimpangan (Chaleff, 1984).
Pada prinsipnya kultur jaringan merupakan dua kegiatan utama: yang pertama yaitu mengisolasi atau memisahkan bagian tanaman dari tanaman induk dan yang ke dua yaitu menumbuhkan dan mengembangkan bagian tanaman tersebut di dalam media yang kondisinya steril dan mampu mendorong pertumbuhan bagian tanaman menjadi tanaman yang sempurna. Dasar dari metode tersebut adalah teori Schwan dan Schleiden yang mempunyai konsep “totipotency” (total genetic potential), yang artinya: setiap sel mempunyai potensi genetik yang menurunkan tanaman baru yang sama seperti induknya, atau setiap sel tanaman akan menjadi tanaman lengkap jika ditumbuhkan pada media yang sesuai. Perbanyakan tanaman melalui metode atau teknik kultur jaringan dapat menghasilkan tanaman yang serupa dengan induknya atau tanaman yang mempunyai sifat baru dari tanman induknya. Hal ini tergantung dari tujuan dan teknik yang dilakukan. Bagian yang diisolasi dan ditumbuhkan jika berasal dari bagian vegetatif maka akan menghasilkan tanaman yang serupa dengan induknya, sedangkan jika berasal dari bagian generatif maka akan menghasilkan tanaman yang mempunyai sifat berbeda dengan tanaman induknya.
Metode kultur jaringan dikembangkan untuk membantu memperbanyak tanaman, khususnya untuk tanaman yang sulit dikembangbiakkan secara generatif. Bibit yang dihasilkan dari kultur jaringan mempunyai beberapa keunggulan, antara lain: mempunyai sifat yang identik dengan induknya, dapat diperbanyak dalam jumlah yang besar sehingga tidak terlalu membutuhkan tempat yang luas, mampu menghasilkan bibit dengan jumlah besar dalam waktu yang singkat, kesehatan dan mutu bibit lebih terjamin, kecepatan tumbuh bibit lebih cepat dibandingkan dengan perbanyakan konvensional.
Produksi bibit dalam jumlah terbatas menyebabkan biaya produksi tinggi karena teknik kultur jaringan memerlukan suatu laboratorium dengan segala perlengkapannya yang membutuhkan biaya tinggi. Dengan demikian, metode perbanyakan yang digunakan merupakan salah satu faktor yang dapat menentukan keberhasilan baik ditinjau dari segi biaya, kestabilan genetik, dan faktor multiplikasi yang tinggi.
2.2. Tipe-Tipe Kultur Jaringan seperti: ujung akar, pucuk aksilar, pucuk daun, helaian daun, buah muda, buku batang, akar, dan lain-lain.
C. Kultur Kalus (callus culture)
Kultur kalus merupakan kultur yang menggunakan jaringan (sekumpulan sel), biasanya beberapa jaringan parenkim sebagai bahan eksplannya. Dalam perbanyakan mikro, produksi kalus biasanya dihindari karena dapat menimbulkan variasi dan, terutama pada zona perakaran, mengakibatkan diskontinyuitas dengan sitem berkas pengangkut utama. Kadang – kadang eksplan menghasilkan kalus, bukan tunas baru, khususnya jika diberikan hormon dengan konsentrasi tinggi pada media. Dalam hal lain, kalus sengaja diinduksi karena potensinya untuk produksi massal plantlet baru. Faktor pembatasnya adalah sulitnya menginduksi inisiasi tunas baru, terutama pada tanaman berkayu dan tingginya kejadian mutasi somatik.
Kultur kalus dapat dilakukan pada media cair dan embrio berkembang sebagai individu terpisah, sehingga penanganan kultur relatif mudah.
Berikut secara umum aplikasi kultur kalus :
Dalam beberapa hal, perlu fase pertumbuhan kalus sebelum regenerasi via somatic
embryogenesis atau organogenesis
Untuk menghasilkan varian somaklonal (genetic atau epigenetic)
Sebagai bahan awal kultur protoplast dan kultur suspensi and suspension cultures
Untuk produksi metabolit sekunder
Digunakan untuk seleksi in vitro
D. Kultur Suspensi Sel (suspension culture)
Kultur suspense sel merupakan kultur yang menggu-nakan media cair dengan pengocokan yang terus menerusmenggunakan shaker dan menggunakan sel atau agregat sel sebagai bahan eksplannya, biasanya eksplan yang digunakan berupa kalus atau jaringan meristem.
E. Kultur protoplasma (protoplasm culture)
Kultur protoplasma menggunakan eksplan sel yang telah dilepas bagian dinding selnya mengguanakan batuan enzim. Protoplas diletakkan pada media padat dibiarkan agar membelah diri dan membentuk dinding selnya kembali. Kultur protoplas biasanya untuk keperluan hibridisasi somatik atau fusi sel soma (fusi 2 protoplas baikintraspesifik maupun interspesifik).
F. Kultur haploid
Kultur haploid adalah kultur yang berasal dari bagian reproduktif tanaman, yakni kepala sari/anther (kultur anther/kultur mikospora), tepung sari/pollen (kultur ovule), sehingga dapat dihasilkan tanaman haploid.
G. Kultur Meristem
mikroskop. Prasyarat kultur sama dengan eksplan yang lebih besar, hanya ketidakberhasilan kultur awal mungkin cukup tinggi.
Berikut aplikasi kultur meristem secara umum: Produksi tanaman bebas virus
Produksi massal genotype dengan karakteristik yang diinginkan
Memfasilitasi pertukaran eksplan antar lokasi (produksi bahan tanaman yang bersih)
Cryopreservation (penyimpanan pada suhu -198oC) atau konservasi plasma nutfah
secara in vitro.
2.3. Keterkaitan antara Totipotensi dan Kultur Jaringan, Serta Perbedaan Perbanyakaan Alami dalam Kultur Jaringan
Kultur jaringan sebenarnya memanfaatkan sifat totipotensi yang dimiliki oleh sel tumbuhan. Totipotensi yaitu kemampuan setiap sel tumbuhan untuk menjadi individu yang sempurna.
Landasan kultur jaringan didasarkan atas tiga kemampuan dasar dari tanaman, yaitu:
A. Totipotensi adalah potensi atau kemampuan dari sebuah sel untuk tumbuh dan berkembang menjadi tanaman secara utuh jika distimulasi dengar benar dan sesuai. Implikasi dari totipotensi adalah bahwa semua informasi tentang pertumbuhan dan perkembangan suatu organisme terdapat di dalam sel. Walaupun secara teoritis seluruh sel bersifat totipotensi, tetapi yang mengekspresikan keberhasilan terbaik adalah sel yang meristematik.
B. Rediferensiasi adalah kemampuan sel-sel masak (mature) kembali menjadi ke kondisi meristematik dan dan berkembang dari satu titik pertumbuhan baru yang diikuti oleh rediferensiasi yang mampu melakukan reorganisasi manjadi organ baru.
penuh. Sebaliknya adalah non-kompeten atau morfogenetikali tidak mempunyai kemampuan.
Pada teknik ini hanya dibutuhkan bagian tubuh dari tanaman. Misalnya batang hanya seluas beberapa millimeter persegi saja. Jaringan yang kamu ambil untuk dikultur disebut eksplan. Biasanya, yang dijadikan eksplan adalah jaringan muda yang masih mampu membelah diri. Misalnya ujung batang, ujung daun, dan ujung akar. Kultur jaringan adalah suatu cara memperbanyak tanaman dari sel atau jaringan tanaman dewasa sehingga diperoleh individu baru yang sempurna. Dasar dari kultur jaringan adalah suatu sifat yang dimiliki tumbuhan yang disebut totipotensi.
Sifat totipotensi adalah kemampuan sel yang apabila diletakkan dalam lingkungan yang sesuai dapat tumbuh menjadi individu baru yang sempurna. Untuk itu diperlukan medium yang tepat untuk pertumbuhan sel, yaitu medium yang mengandung nutrisi dan hormon tumbuh. Selain kondisi steril, kedua hal tersebut adalah kunci pokok bagi keberhasilan kultur jaringan. Totipotensi pertama kali dikemukakan oleh G. Haberlandt, seorang ahli fisiologi Jerman, kemudian oleh F.C. Steward berhasil dibuktikan totipotensi dari satu sel wortel yang dikultur pada medium tertentu dan menghasilkan tanaman wortel yang utuh dan lengkap.
Perbedaan perbanyakan alami dengan kultur jaringan Alami :
Perbanyakan alami :
Nutrisi diperoleh secara alami dari dalam tanah
Tanaman dapat membuat makanannya sendiri (autotrof) Sumber tanaman harus cukup umur
Fotosintesis dengan bantuan matahari
2.4. Peralatan dan Fasilitas dalam Kultur Jaringan
Alat-alat yang dipakai dalam penanaman kultur jaringan harus dalam keadaan steril. Alat-alat logam dan gelas dapat disterilkan dalam autoklaf. Alat tanam seperti: pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan dalam bacticinerator khusus untuk scapel, gagangnya dapat disterilkan dengan pemanasan namun pisaunya dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dalam temperatur tinggi. Oleh karena itu untuk bladenya dianjurkan cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit, kemudian kertas saring, petridish, botol-botol kosong, jarum, pipet, dan sebagainya.
Peralatan kultur jaringan juga terdiri atas Laminar Air Flow Cabinet (LAFC), alat ini letaknya di ruang penabur, yaitu ruang yang selalu harus dalam keadaan steril, alat ini digunakan sebagai tahap perlakuan penanaman. Entkas, merupakan bentuk lama dari alat penabur (LAFC), maka fungsinya pun sama seperti (LAFC) Shaker (pengaduk), merupakan alat pengaduk yang putarannya dapat diatur menurut kemauan. Pengaduk ini dapat digunakan untuk keperluan menumbuhkan kalus pada eksplan suatu tanaman atau untuk membentuk protokormusatau sering disebut plb (protocorm like bodies) dari kalus bermacam jaringan tanaman.
- Autoklaf, merupakan alat sterilisasi untuk alat dan medium kultur jaringan tanaman. -Timbangan Analitik, jenis alat ini bermacam-macam, tetapi yang penting adalah timbangan yang dapat dipergunakan untuk menimbang sampai satuan yang sangat kecil. Alat ini berfungsi sebagai alat untuk menimbang bahan-bahan kimia yang digunakan untuk kultur jaringan.
-Stirer, alat ini berfungsi untuk mengaduk dengan pemanas, dengan menggunakan listrik, alat ini berfungsi sebagai kompor disamping sebagai pengaduk.
-Erlenmeyer, alat ini digunakan dalama kultur jaringan tanaman sebagai sarana menuangkan air suling maupun untuk tempat media dan penanaman eksplan.
-Gelas Ukur, digunakan untuk menakar air suling dan bahan kimia yang akan digunakan. -Gelas Piala, digunakan untuk menuangkan atau mempersiapkan bahan kimia dan air suling dalam pembuatan medium.
-Pinset, digunakan untuk memegang atau mengambil irisan eksplan atau untuk menanam eksplan
-Lampu Spiritus, digunakan untuk sterilisasi dissecting kit (skalpel dan pinset) di dalam laminar air flow cabinet atau di dalam enkas pada kita mengerjakan penanaman atau sub-culture.
-Tabung Reaksi, digunakan pada saat mengerjakan isolasi protoplas dan isiolasi khloroplas.
Fasilitas dalam kultur jaringan di Laboratorium, di bagi dalam beberapa bagian yang fungsinya satu sama lainnya berbeda-beda dan persyaratannya pun berbeda-beda pula. Laboratorium kultur jaringan harus dirancang secara khusus, karena ada bagian-bagian atau ruangan-ruangan yang harus dalam suasana steril atau bebas mikroba. Ruang-ruang dalam kultur jaringan di kelompokkan menurut macam kegiatan yang ada di dalamnya, yaitu
sebagai berikut:
A. Ruang Tidak Steril Ruang Tamu
Dalam laborsatorium kultur jaringan sebaiknya di lengkapi dengan ruang tamu, karena biasanya laboratorium kultur jaringan selalu di datangi tamu baik tamu yang ingin melihat sarana dan suasana laboratorium maupun tamu ingin membeli hasil biakan kultur jaringan.
Ruang Administrasi
Segala surat-menyurat tentang pembelian alat-alat laboratorium, pembelian media kultur jringan, penjualan bibit-bibit hasil biakan kultur jaringan, dan transaksi-transaksi ataupun perjanjian-perjanjian kerja sama tentang penelitian dilaksanakan di dalam ruangan administrasi.
Ruang Staf
Laboratorium kultur jaringan membutuhkan staf peneliti dalam jumlah banyak, tujuannya adalah agar dapat di adakan pembagian kerja sesuai dengan spesialisasinya masing-masing. Di dalam ruang staf ini dapat pula di lakasanakan diskusi antar staf pada waktu berkumpul bersama.
Kamar Mandi dan WC
oleh mikroba. Bila pekerja akan memasuki ruangan penabur atau ruang inkubator, tubuh dan pakaiannya harus bersih, tidak berkeringat dan tidak berdebu. Ruang Ganti Pakaian untuk menghindari timbulnya kontaminasi oleh mikroba, maka para karyawan di dalam laboratorium kultur jaringan perlu memakai pakaian yang bersih, dalam arti baru di cuci. Oleh karena itu dalam ruangan kultur jaringan perlu di adakan ruang ganti pakaian.
Ruang Tempat Penyimpanan Bahan Kimia dan Alat-alat dari Gelas Komponen bahan kimia penyusun media kultur jaringan sangat banyak macamna. Oleh karena itu, penyimpanannya memerlukan pengaturn yang khusus supaya mudah mecarinya. Penyimpanan yang tidak teratur akan mempelambat dalam pekerjaan, misalnya dalam mencari salah sau komponen media saja membutuhkan waktu yang lama. Bahan kimia yang mahal harganya seperti hormon tumbuh dan enzim untuk isolasi protoplas harus disimpan dala ruangan yang sejuk. Alat-alat dari gelas seperti erlenmeyer, gelas ukur dan alat gelas lainnya perlu disimpan dalam almari tersendiri.
Ruang Preparasi
Di dalam ruangan ini disediakan peralatan dan tempat untuk mencuci alat-alat laboratorium yang akan digunakan. Peralatan yang ada antara lain keranjang-keranjang plastik untuk tempat peralatan yang baru dicuci.
Ruang Penimbangan dan Sterilisasi
Bermacam-macam media kultur jaringan dijual dalam bentuk kemasan dengan harga yang relatif mahal. Oleh karena itu, staf labolatorium lebih senang meramu sendiri medum tanam yang dibutuhkannya.dengan demikian dibutuhkan lat untuk menimbang semua komponen bahan kimia tersebut. Misalnya menimbang bahan kimia makro dan mikro. Rumah Kaca (Green House) Rumah kaca adalah suatu bangunan yang atap dan sekeliling dinding bagian atasnya terbuat dari kaca. Tujuan penyediaan rumah kaca adalah untuk tempat meletakkan pot-pot bibit tanaman.
B. Ruang Tidak Mutlak Steril Ruang Planlet
planlet jumlahnya dapat mencapai ratusan. Oleh sebab itu, dalam ruangan ini perlu disediakan rak-rak alumuniaum yang dasrnya berlobang-lobang untuk meletakkan botol-botol tersebut secara teratur dan rapi.
Ruang Inkubator
Eksplan yang sudah ditanam dalam media kultur jringan perlu dipantau pertumbuhannya setiap hari. Untuk pemantauan ini perlu ruangan khusus yang keadaannya lebih steril dari ruang planlet, yaitu ruang inkubator. Ruang inkubator harus memiliki suhu kurang lebih 25OC dan harus dilengkapi dengan lampu-lampu neon, karena eksplan yang ditumbuhkan dalam ruangan inkubasi membutuhkan temperatru dan cahaya yang dapat diatur dan disesuaikan dengan jenis eksplannya.
Ruang Shaker dan Enkas.
Eksplan yang baru ditanam dan diinkubasikan dalam ruang inkubator akan menghasilkan kalus. Bila kalus ini cukup umur, maka dapat diperlukan suspensi sel, yaitu menumbuhkan suatu eksplan atau kalus dengan menggunakan media cair (media yang tidak menggunakan zat pemadat atau agar), kemudian digojok di atas shaker. Hasil pertumbuhan kalus ini adalah berupa protokormus atau dalam istilah asing disebut plb (protocorm like bodies). Bentuk protocormus adalah bulat-bulat padat dan berwarna hijau. Bila keadaan protocormus sudah keadaan demikian maka sudah siap dipindahkan kedalam media padat untuk di tumbuhkan menjadi planlet. Enkas juga sering di letakkan dalam satu ruang dengan shaker, kegunaan enkas ini sama dengan Laminar Air Flow Cabinet, yaitu untuk menabur eksplan.
C. Ruang Mutlak Steril Ruang Penabur
menjelang ruang penabur akan digunakan. Bila saat calon penabur akan memasuki ruangan, lampu ultra violet harus dimatkan terlebih dahulu kemudian menyalakan lampu neon biasa dan calon penabur diperbolehkan memasuki ruangan tersebut. Sebaiknya, pada saat akan keluar lampu neon di matikan dan setelah keluar menutup daun pintu kembali lampu ultra violet dinyalakan. Dengan demikian steril ruangan dapat dijamin.
2.5. Metode-Metode Pelaksanaan dan Tahapan dalam Kultur Jaringan A. Metode Pelaksanaan Kultur Jaringan
I. Dilihat dari Macam Media Tanam
Teknik kultur jaringan dapat dilaksanakan dengan dua metode yaitu: a. Metode Padat (solid method)
Metode ini dilakukan dengan tujuan mendapatkan kalus dan medium diferensiasi yang berguna untuk menumbuhkan akar dan tunas, sehingga kalus dapat tumbuh menjadi planlet. Media yang mengandung semua komponen kimia yang dibutuhkan oleh tanaman dan kemudian dipadatkan dengan menambahkan zat pemadat merupakan media padat. Biasanya menggunakan zat pemadat yang berupa agar-agar batangan, agar-agar bubuk, atau agar-agar kemasan kaleng yang khusus digunakan untuk media padat dalam kultur jaringan.
Akar sukar tumbuh jika media terlalau padat, hakar l ini terjadi karena akar akan sulit menembus ke dalam media. Sedangkan media yang terlalu lembek akan menyebabkan kegagalan dalam pekerjaan. Kegagalan ini dapat berupa tenggelamnya eksplan yang ditanam. Eksplan yang tenggelam tidak akan dapat tumbuh menjadi kalus, karena area kalus yaitu pada irisan (jaringan yang luka) akan tertutup oleh medium.
Metode kloning dapat menggunakan metode padat. Hal ini dilakukan untuk menumbuhkan protoplas yang telah diisolasi untuk menumbuhkan planlet dari protokormus. Penumbuhan ini dilakukan setelah dipindahkan dari suspensi sel, dan untuk menumbuhkan planlet dari prtoplas yang sudah difusikan (digabungkan).
b. Metode Cair(Liquid Metho)
kecil tingkat keberhasilannya, pada metode ini hanya tanaman-tanaman tertentu yang dapat tumbuh. Oleh karena itu, penggunaan media cair lebih ditekankan untuk suspensi sel, yaitu untuk menumbuhkan plb (prtocorm like bodies).
Protokormus nantinya dapat tumbuh menjadi planlet apabila dipindahkan kedalam media padat yang sesuai. Pembuatan media cair jauh lebih cepat daripada media padat, karena tidak ada pemanasan untuk melarutkan agar-agar. Media cair juga tidak memerlukan zat pemadat sehingga keadaannya tetap berupa larutan nutrein.
2. Dilihat dari Bahan atau Eksplan yang Dipakai
Bila dilihat dari macam bahan yang digunakan, maka metode kultur jaringan yang
maka metode kultur jaringan yang telah dikenal sekarang antara lain adalah:
1) Kultur Meristem
2) Kultur antera
3) Kultur endosperma
4) Kultur suspensi sel
5) Kultur protoplas
6) Kultur embrio
7) Kultur spora
8) Dan lain-lain
3. Dilihat dari Cara Pemeliharaan
Agar dapat tumbuh, eksplan yang telah ditanam menjadi kalus dan kemudian menjadi planlet, maka dibutuhkan pemeliharaan yang rutin dan tepat. Artinya, eksplan atau kalus yang sudah waktunya untuk dipindahkan ke dalam media tanam yang baru harus segera dilaksanakan, tidak boleh sampai terlambat. Pemindahan yang terlambat dapat menyebabkan pertumbuahn eksplan atau kalus dapat terhenti atau dapat mengalami brownig atau terkontaminasi oleh jamur atau bakteri.
Pelaksanaan teknik ini memerlukan berbagai prasyarat pendukung kehidupan jaringan yang dibiakkan. Yang paling esensial adalah wadah dan media tumbuh yang steril. Media adalah tempat bagi jaringan untuk tumbuh dan mengambil nutrisi yang mendukung kehidupan jaringan. Media tumbuh menyediakan berbagai bahan yang diperlukan jaringan untuk hidup dan memperbanyak dirinya.
Ada dua golongan media tumbuh yaitu: media padat dan media cair. Media padat pada umumnya berupa padatan gel, seperti agar. Nutrisi dicampurkan pada agar. Media cair adalah nutrisi yang dilarutkan di air. Media cair dapat bersifat tenang atau selalu bergerak, tergantung kebutuhan. Pelaksana harus bekerja dengan teliti dan serius, karena setiap tahapan pekerjaan tersebut memerlukan penanganan tersendiri dengan dasar pengetahuan tersendiri.
Tahapan tersebut, yaitu:
a. Inisiasi Kultur
Tujuan utama dari propagasi secara in-vitro tahap ini adalah pembuatan kultur dari eksplan yang bebas mikroorganisme serta inisiasi pertumbuhan baru (Wetherell, 1976). Hal ini untuk mengusahakan kultur yang aseptik atau aksenik. Aseptik berarti bebas dari mikroorganisme, sedangkan aksenik berarti bebas dari mikroorganisme yang tidak diinginkan. Dalam tahap ini juga diharapkan bahwa eksplan yang dikulturkan akan menginisiasi pertumbuhan baru, sehingga akan memungkinkan dilakukannya pemilihan bagian tanaman yang tumbuhnya paling kuat untuk perbanyakan (multiplikasi) pada kultur tahap selanjutnya (Wetherell, 1976).
b. Sterilisasi
Sterilisasi adalah proses pembebasan dari mikroorganisme. Tujuan sterilisasi yaitu untuk menciptakan kondisi kultur yang steril. Beberapa tahapan sterilisasi yaitu: 1. Sterilisasi peralatan gelas dan stainless dalam suhu 121ºC di dalam autoklaf. 2. Sterilisasi bahan tanaman.
Tanaman induk – sterilisasi bahan tanam/eksplan menggunakan detergen, alcohol, kloroks 0,5 % dll – direndam dalam bahan sterilant – sterilisasi dalam laminar – tanaman dipro-kondisi
c. Pembuatan media kultur
Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan cara kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan.
Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca. Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoclave. Pembuatan media kultur :
o Persiapan bahan
o Formulasi
o Pengukuran pH (5,7-5,8)
o penuangan dan penutupan media sterilisasi
Kandungan nutrisi dalam agar-agar : 1. Mineral
Makro nutrient (N, P, K, Ca, Mg) Mikro nutrient (Mn, Zn, Mo, Cu, Co) 2. karbohidrat (gula)
3. vitamin (B dan C) 4. protein
5. Hormon
Komposisi media Murashige dan Skoog (MS) Bahan Kimia Konsentrasi Kimia (mg/l) 1. NH4NO3 1650
2. KNO3 1900 3. CaCL2+2H20 440 4. MgSO4+7H20 370 5. KH2PO4 170 6. FeSO4+7H20 27 7. Na 37,3
8. MnSO4+4H20 22,3 9. ZnSO4.7H2O 8,6 10. H3BO3 6,2 11. KI 0,83
12. Na2MoO4+2H20 0,25 13. CuSO4+5H20 0,025 14. CoCl2+6H20 0.025 15. Myoinositol 100 16. Niasin 0,5
18. Tiamin-HCL 0,1 19. Glisin 2
20. Sukrosa 3000
d. Penanaman eksplan
Melalui sub kultur atau transfer, tanaman ditanam pada media tanam di laminar air flow menggunakan alat-alat yang steril.
Syarat eksplan yang baik :
Berasal dari induk yang sehat dan subur
Berasal dari induk yang diketahui jenisnya
Tempat tumbuh pada lingkungan yang baik
Ukuran tunas optimal sekitar 5 cm tingginya
Tunas langsung diproses sesegera mungkin
Tahapan sub kultur
Induksi tunas
Multiplikasi tunas
Multiplikasi adalah kegiatan memperbanyak calon tanaman dengan menanam eksplan pada media. Ini dilakukan untuk menghindari adanya kontaminasi yang menyebabkan gagalnya pertumbuhan eksplan. Tabung yang telah ditanami eksplan diletakkan pada rak-rak dan ditempatkan di tempat yang steril dengan suhu kamar.
Pengakaran
Pengakaran adalah fase dimana eksplan akan menunjukkan adanya pertumbuhan akar yang menandai bahwa proses kultur jaringan yang dilakukan mulai berjalan dengan baik. Untuk pengakaran digunakan media MS + NAA. Pengamatan dilakukan setiap hari untuk melihat pertumbuhan dan perkembangan akar serta untuk melihat adanya kontaminasi oleh bakteri ataupun jamur. Proses perakaran pada umumnya berlangsung selama 1 bulan. Eksplan yang terkontaminasi akan menunjukkan gejala seperti berwarna putih atau biru (disebabkan jamur) atau busuk (disebabkan bakteri).
Inkubasi
Pada tahap inkubasi, eksplan ditempatkan di ruang/lingkungan yang terkendali (untuk duji keberhasilannya). Suhu yang sesuai untuk pertumbuhan kultur adalah antara 24–28oC. Untuk mengkondisikan ruang inkubasi pada suhu yang diinginkan, maka di dalam ruangan tersebut dipasang Air Conditioner (AC).
Aklitimasi
Setelah bibit mampu beradaptasi dengan lingkungan barunya maka secara bertahap sungkup dilepaskan dan pemeliharaan bibit dilakukan dengan cara yang sama dengan pemeliharaan bibit generatif. Pada saat aklimatisasi ini umumnya 2 minggu dengan sungkup dan 4 minggu tanpa sungkup. Dan pada saat itu planlet sudah mencapai tinggi 20 – 25 cm. Selanjutnya bibit siap ditumbuhkan dalam polibag. Setelah itu tanaman perlu ditumbuhkan di nursery sampai mencapai tinggi 50 – 60 cm kemudian dipindahkan ke lapangan.
2.6. Regenerasi pada Kultur Jaringan, Serta Kendala dan Masalah yang Terjadi dalam Kultur Jaringan
A. Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Regenerasi
1. Bentuk Regenerasi dalam Kultur In Vitro : pucuk aksilar, pucuk adventif, embrio somatik, pembentukan protocorm like bodies, dll
2. Eksplan ,adalah bagian tanaman yang dipergunakan sebagai bahan awal untuk perbanyakan tanaman. Faktor eksplan yang penting adalah genotipe/varietas, umur eksplan, letak pada cabang, dan seks (jantan/betina). Bagian tanaman yang dapat digunakan sebagi eksplan adalah pucuk muda, batang muda, daun muda, kotiledon, hipokotil, endosperm, ovari muda, anther, embrio, dll.
3. Media Tumbuh, Di dalam media tumbuh mengandung komposisi garam anorganik, zat pengatur tumbuh, dan bentuk fisik media. Terdapat 13 komposisi media dalam kultur jaringan, antara lain: Murashige dan Skoog (MS), Woody Plant Medium (WPM), Knop, Knudson-C, Anderson dll. Media yang sering digunakan secara luas adalah MS.
Napthalene Acetic Acid (NAA), 2,4-D, CPA dan Indole Acetic Acid (IBA). Golongan Sitokinin seperti Kinetin, Benziladenin (BA), 2I-P, Zeatin, Thidiazuron, dan PBA. Golongan Gibberelin seperti GA3. Golongan zat penghambat tumbuh seperti Ancymidol, Paclobutrazol, TIBA, dan CCC.
5. Lingkungan tumbuhyang dapat mempengruhi regenerasi tanaman meliputi temperatur, panjang penyinaran, intensitas penyinaran, kualitas sinar, dan ukuran wadah kultur.
B. Kendala dan Masalah yang Terjadi dalam Kultur Jaringan
Teknik kultur jaringan sampai saat ini memang belum biasa dilaksanakan oleh para petani, baru beberapa kalangan pengusaha swasta saja yang sudah mencoba melaksanakannya, karena pelaksanaan teknik kultur jaringan tanaman memerlukan keterampilan khusus dan harus dilatar belakangi dengan ilmu pengetahuan dasar tentang fisiologi tumbuhan, anatomi tumbuhan, biologi, kimia dan pertanian. Dengan demikian jelas akan amat sulit untuk diterima oleh kalangan petani biasa. Di samping itu, pelaksanaan teknik kultur jaringan mutlak memerlukan laboratorium khusus, walaupun dapat di usahakan secara sederhana (dalam ruang yang terbatas), namun tetap memerlukan peralatan yang memadai. Kemungkinan lain petani akan merasa enggan bekerja secara aseptik.
memerlukan kesabaran yang tinggi. Biaya untuk mewujudkan perbanyakan tanaman secara in vitro ini juga sangat mahal, kecuali kita meramu medium sendiri. Bila kita terpaksa harus membeli medium yang sudah jadi (dalam kemasan) jelas akan sangat mahal, sebab medium yang sudah jadi masih harus di impor dari luar negeri. Apalagi kita harus membeli saran untuk perlakuan isolasi dan fusi protoplas, tentu biayanya akan bertambah besar.
Enzim-enzim yang digunakan dalam kultur jaringan juga masih dibeli dari luar negeri seperti Jepang. Lepas semua dari kendala-kendala tersebut diatas, kita harus mengakui bahwa teknik kultur jaringan sangat bermanfaat bagi dunia ilmu pengetahuan, terutama untuk pengembangan bioteknologi.
Masalah-masalah Dalam Kultur Jaringan:
Dalam kegiatan kultur jaringan, tidak sedikit masalah-masalah yang muncul sebagai pengganggu dan bahkan menjadi penyebab tidak tercapainya tujuan kegiatan kultur yang dilakukan. Gangguan kultur secara umum dapat muncul dari bahan yang ditanam, dari lingkungan kultur, maupun dari manusianya.
Permasalahan dalam kultur ada yang dapat diprediksi sebelumnya dan ada pula yang sulit diprediksi kejadiannya. Untuk yang tidak dapat diprediksi, cara mengatasinya tidak dapat secara preventif tetapi diselesaikan setelah kasus itu muncul.
Adapun masalah-masalah yang terjadi dalam kultur jaringan yaitu:
1. Kontaminasi
Upaya mencegah terjadinya kontaminsi:
Biasakan membersihkan berbagai sarana yang diperlukan dalam kultur jaringan.
Yakinkan bahwa proses sterilisasi media secara baik dan benar.
Lakukan proses penanaman bahan pada keadaan anda nyaman dan cari waktu yang
longgar.
2. Pencoklatan/browning
Pencoklatan adalah suatu karakter munculnya warna coklat atau hitam yang sering membuat tidak terjadinya pertumbuhan dan perkembangan eksplan. Peristiwa pencoklatan sesunggguhnya merupakan peristiwa alamiah yang biasa sering terjadi. Pencoklatan umumnya merupakan suatu tanda-tanda kemunduran fisiologi eksplan dan tidak jarang berakhir pada kematian eksplan.
3. Vitrifikasi
Vitrifikasi adalah suatu istilah problem pada kultur yang ditandai dengan:
Munculnya pertumbuhan yang tidak normal
Tanaman yang dihasilkan kerdil
Pertumbuhan batang cenderung ke arah penambhan diameter
Tanaman utuhnya menjadi sangat turgescent
4. Variabilitas Genetik
Bila kultur jaringan digunakan untuk upaya perbanyakan tanaman yang seragam dalam jumlah yang banyak, dan bukan sebagai upaya pemuliaan tanaman maka variasi genetik adalah kendala. Variasi genetik dapat terjadi pada kultur in vitro karena, laju multifikasi yang tinggi, variasi terjadi karena terjadinya sub kultur berulang yang tidak terkontrol. Penggunaan teknik yang tidak sesuai. Variasi genetik yang paling umum terjadi pada kultur kalus dan kultur suspensi sel, hal tersebut terjadi karena munculnya sifat instabilitas kromosom mungkin akibat teknis kultur, media atau hormon.
Cara mengatasi masalah variasi genetik tentunya tidak sederhana, harus memperhatikan aspek yang dikulturkan.
5. Pertumbuhan dan Perkembangan
Masalah utama berkaitan dengan proses pertumbuhan adalah bila eksplan yang ditanam mengalami stagnasi, dari mulai tanam hingga kurun waktu tertentu tidak mati tetapi tidak tumbuh.
Untuk menghindari hal itu dapat dilakukan dengan preventif menghindari bahan tanam yang tidak juvenil atau tidak meristematik. Karena awal pertumbuhan eksplan akan dimulai dari sel-sel yang muda yang aktif membelah, atau dari sel-sel tua yang muda kembali. Media juga dapat menjadi sebab terjadinya stagnasi pertumbuhan, karena dari kondisi medialah suatu sel dapat atau tidak terdorong melakukan proses pembelahan dan pembesaran dirinya.
6. Praperlakuan
Masalah pada kegiatan in vitro bukan hanya dari penanaman eksplan saja, pertumbuahn dan perkembangannya dlama botol saja tetapi juga sangat bisa dipengaruhi oleh persyaratan kegiatan prapelakuan. Pada kasus ini masalah akan muncul bila kegiatan prapelakuaan tidak dilakukan. Prapelakuan dilakukan umumnya untuk tujuan-tujuan tertentu, secara umum adalah dalam rangka menghilangkan hambatan. Hambatan apat berupa hambatan kemikalis, fisik, biologis. Hambatan berupa bahan kimia penanganannya harus dimulai dari pengenalan senyawa aktif, potensi gangguan, proses reaksi dan alternatif pengelolaannya.
7. Lingkungan Mikro
Masalah lingkungan inkubator juga tidak bisa diabaiakan karena ini juga sering menjadi masalah. Suhu ruangan inkubator sangat menentukan optimasi pertumbuhan eksplan, suhu yang terlalu rendah aatau tinggi dapat mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan pada eksplan. Kebutuhan antara satu tananaman dengan tanaman yang lain berbeda, namun demikian solusinya sulit dilakukan mengingat umumnya ruangan inkubator suatu ruangan laboratorium kultur jaringan tidak bisa dibuat variasi antara satu ruangan dengan bagian ruangan yang lainnya. Sehingga optimasi pertumbuhan tidak bisa diharapkan sama antara kultur yang satu dengan kultur yang lain.
Dalam pelaksanaannya, teknik kultur jaringan memiliki beberapa kelemahan dan
b) Mendapatkan tumbuhan baru yang bersifat unggul dalam waktu relatif singkat. c) Efisien tempat dan waktu.
d) Tidak tergantung musim, dapat diperbanyak secara kontinu. e) Biaya lebih murah untuk skala besar.
f) Cocok untuk tanaman yang sulit bergenerasi. g) Merupakan sarana meningkatkan kualitas tanaman.
h) Dalam proses pembibitan akan bebas dari gangguan hama, penyakit, dan deraan lingkungan lainnya.
i) Menciptakan tanaman baru yang toleran terhadap stress garam. j) Melestarikan tumbuh-tumbuhan yang hampir punah.
k) Mendapatkan metabolit sekunder yang terdapat pada sel tumbuhan secara tepat, yang digunakan untuk pembuatan obat-obatan.
l) Memberikan masukan atau informasi yang sangat bermanfaat dalam bidang fisiologi tumbuhan.
m) Meningkatkan perekonomian sehingga berpengaruh terhadap devisa negara.
2. Kelemahan kultur jaringan:
Selain beberapa manfaat yang dimiliki dalam teknik kultur jaringan. Teknik ini juga memiliki beberapa kelemahan, antara lain:
a) Diperlukan biaya awal yang relatif tinggi untuk melakukan tehnik kultur jaringan. b) Membutuhkan modal investasi awal yang tinggi untuk bangunan (laboratorium
khusus), peralatan dan perlengkapan.
Produk kultur jaringan pada akarnya kurang kokoh.
BAB III
KESIMPULAN
3.1. Kesimpulan
