PROFIL KIMIA FRAKSI AKTIF ANTIOKSIDAN DARI
EKSTRAK METANOL DAUN POHON PENGHASIL GAHARU
Aquilaria microcarpa HASIL INOKULASI
MAKKY JANUARI MUKTI
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Profil Kimia Fraksi Aktif Antioksidan dari Ekstrak Metanol Daun Pohon Penghasil Gaharu Aquilaria microcarpa Hasil Inokulasi adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
ABSTRAK
MAKKY JANUARI MUKTI. Profil Kimia Fraksi Aktif Antioksidan dari Ekstrak Metanol Daun Pohon Penghasil Gaharu Aquilaria microcarpa Hasil Inokulasi. Dibimbing oleh DUDI TOHIR dan ERDY SANTOSO.
Aquilaria microcarpa merupakan salah satu pohon penghasil gaharu yang digunakan secara luas dalam produksi minyak atsiri. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi komponen kimia fraksi aktif antioksidan dari ekstrak metanol daun pohon A. microcarpa hasil inokulasi. Percobaan dilakukan dengan mengekstraksi daun menggunakan pelarut metanol, lalu ekstrak kasar tersebut difraksionasi dengan teknik kromatografi kolom gradien menggunakan 4 pelarut yang berbeda polaritasnya. Fraksionasi dengan kolom silika gel menghasilkan 4 fraksi, yaitu fraksi diklorometana, diklorometana-metanol 1:1, metanol, dan metanol-air 1:1. Uji aktivitas antioksidan setiap fraksi menunjukkan bahwa fraksi metanol memiliki aktivitas tertinggi dalam penghambatan radikal 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) dengan nilai IC50 25.89 g/mL. Kromatogram gas-spektrum massa fraksi tersebut menunjukkan keberadaan senyawa fenolik, yaitu 5-nitropirimidina-2,4-diol (0.22%) dan amina sekunder aromatik, yaitu asam N-(3,5-dinitro-2-piridinil)aspartat (0.10%) yang diduga berperan sebagai senyawa antioksidan. Kapasitas antioksidan yang baik ini menunjukkan potensi daun A. microcarpa sebagai sumber obat yang berguna.
Kata kunci: amina sekunder aromatik, antioksidan, daun, fenolik, gaharu
ABSTRACT
MAKKY JANUARI MUKTI. Chemical Profile of Antioxidant Active Fraction of Methanol Extract of Inoculated Agarwood-Producing Tree Aquilaria microcarpa Leaves. Supervised by DUDI TOHIR and ERDY SANTOSO.
Aquilaria microcarpa is one of the agarwood-producing trees widely used for highly valuable essential oil production. This study aimed to identify chemical components in antioxidant active fraction of methanol extract of inoculated A. microcarpa tree leaves. The experiment was performed by extracting the leaves with methanol solvent, and then the extract was fractionated using gradient column chromatography method utilizing 4 solvents with different polarities. This fractionation using silica gel column gave 4 fractions, namely dichloromethane, dichloromethane-methanol 1:1, methanol, and methanol-water 1:1 fractions. Determination on antioxidant activity of each fraction showed that methanol fraction has the highest inhibition of 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity with IC50 of 25.89 g/mL. Gas chromatogram-mass spectrum of the fraction showed a phenolic compound as 5-nitropyrimidine-2,4-diol (0.22%) and a secondary aromatic amine as N-(3,5-dinitro-2-pyridinyl)aspartic acid (0.10%), which presumably act as antioxidant agents. The antioxidant property indicates the potential of A. microcarpa leaves as a source of useful drugs.
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
pada
Departemen Kimia
PROFIL KIMIA FRAKSI AKTIF ANTIOKSIDAN DARI
EKSTRAK METANOL DAUN POHON PENGHASIL GAHARU
Aquilaria microcarpa HASIL INOKULASI
MAKKY JANUARI MUKTI
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah yang berjudul Profil Kimia Fraksi Aktif Antioksidan dari Ekstrak Metanol Daun Pohon Penghasil Gaharu Aquilaria microcarpa Hasil Inokulasi ini berhasil diselesaikan.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Drs Dudi Tohir, MS dan Bapak Dr Erdy Santoso, MS selaku pembimbing yang telah banyak memberi bimbingan, arahan, dan saran. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Bapak Atep dari KHDTK Carita yang telah membantu dalam pengambilan sampel dan Bapak Sabur dari Laboratorium Kimia Organik Departemen Kimia IPB yang telah membantu dalam persiapan alat dan bahan penelitian. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada Ibu dan seluruh keluarga atas segala doa, dukungan dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL vii
DAFTAR GAMBAR vii
DAFTAR LAMPIRAN vii
PENDAHULUAN 1
METODE 2
Alat dan Bahan 2
Pengambilan Sampel 2
Preparasi Sampel 2
Penentuan Kadar Air 3
Ekstraksi 3
Fraksionasi 3
Uji Aktivitas Antioksidan 4
Analisis GC-MS 4
HASIL DAN PEMBAHASAN 4
Kadar Air 4
Ekstraksi 5
Fraksionasi 6
Aktivitas Antioksidan 6
Analisis GC-MS 8
SIMPULAN DAN SARAN 10
Simpulan 10
Saran 10
DAFTAR PUSTAKA 11
LAMPIRAN 13
DAFTAR TABEL
1 Aktivitas antioksidan ekstrak kasar dan hasil fraksionasi 7 2 Profil kimia fraksi metanol ekstrak daun muda A. microcarpa hasil
inokulasi 9
DAFTAR GAMBAR
1 Diagram rendemen fraksi-fraksi ekstrak metanol daun A. microcarpa hasil inokulasi, menggunakan kolom silika gel dengan varian eluen 6
2 Reaksi DPPH dengan antioksidan 7
3 Dugaan senyawa aktif antioksidan dalam fraksi metanol ekstrak daun muda A. microcarpa hasil inokulasi: 1) alkaloid fenolik (5-nitropirimidina-2,4-diol) dan 2) alkaloid amina sekunder aromatik
(asam N-(3,5-dinitro-2-piridinil)aspartat) 10
DAFTAR LAMPIRAN
1 Diagram alir penelitian 13
2 Kadar air simplisia daun muda A. microcarpa hasil inokulasi 14
3 Rendemen ekstrak dan fraksi 15
4 Hasil uji antioksidan metode peredaman radikal bebas DPPH 16
5 Spesifikasi dan kondisi alat GC-MS 22
6 Kromatogram GC-MS fraksi metanol 23
1
PENDAHULUAN
Gaharu adalah komoditas hasil hutan bukan kayu yang bernilai ekonomi tinggi karena sangat luas aplikasinya sebagai bahan wewangian, minyak atsiri, dan pengobatan. Pohon penghasil gaharu terbaik di Indonesia antara lain Aquilaria malaccensis, Aquilaria microcarpa, dan Gyrinops versteegii. Ketiganya termasuk ke dalam divisi Spermatophyta, subdivisi Angiospermae, kelas Magnoliopsida, ordo Myrtales, dan famili Thymelaeaceae (Chang et al. 2008). Secara umum, perdagangan gaharu digolongkan ke dalam 3 kelas: gubal, kemedangan, dan abu. Komponen utama minyak gaharu adalah seskuiterpena dan kromon seperti agarofuran, 2-(2-feniletil)kromon, agarol, agarospirol, dan jinkoh-eremol (Bhuiyan et al. 2004). Seskuiterpena dan kromon inilah yang menghasilkan aroma khas gaharu.
Gaharu merupakan endapan resin yang terakumulasi pada jaringan kayu sebagai reaksi pohon terhadap infeksi jamur. Masuknya mikrob ke dalam jaringan tanaman yang terluka dianggap sebagai benda asing sehingga sel tanaman menghasilkan senyawa fitoaleksin yang merupakan metabolit sekunder sebagai mekanisme pertahanan tanaman terhadap penyakit akibat infeksi tersebut. Kini pembentukan gaharu dengan teknologi inokulasi membantu produksi gaharu agar dapat direncanakan dan dipercepat, yaitu melalui induksi jamur pembentuk gaharu pada batang pohon penghasil gaharu (Siran 2010).
Di bidang pengobatan tradisional, dilaporkan bahwa gaharu dimanfaatkan sebagai obat gangguan ginjal, hepatitis, sirosis, rematik, malaria, tukak lambung, sakit perut dan diare, penghilang stres, penghilang rasa sakit, bahan antibiotik, stimulan kerja syaraf, antiasma, dan antikanker (Novriyanti 2008). Manfaat gaharu yang sangat tinggi kemudian menyebabkan perburuan besar-besaran pada spesies pohon penghasil gaharu dan mengakibatkan spesies tersebut menjadi langka. Aquilaria microcarpa, salah satu pohon penghasil gaharu terbaik yang banyak tumbuh di Sumatera dan Kalimantan, telah dimasukkan ke dalam Appendix II Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora (CITES) sejak tahun 2004 sebagai tumbuhan yang terancam punah sehingga dalam penebangan dan perdagangannya dibatasi (CITES 2004).
Penelitian telah banyak dilakukan terhadap gaharu dan mengungkap berbagai macam aktivitas farmakologis yang dimilikinya. Aktivitas farmakologis tersebut ditentukan terutama oleh kandungan senyawa metabolit sekundernya (Lisdawati et al. 2006). Sementara itu, seiring proses pembentukan gaharu, metabolisme pohon penghasil gaharu juga meningkat sehingga metabolit sekunder yang dihasilkan diduga terdistribusi ke bagian lain dari pohon terutama daun. Oleh karena itu, studi pada daun pohon penghasil gaharu perlu dikembangkan sehingga dapat ditentukan potensi farmakologisnya dan di samping itu, juga dapat meminimumkan kepunahan spesies akibat penebangan pohonnya.
2
2009). Data ini mendukung penelitian untuk mengevaluasi aktivitas antioksidan dari ekstrak daun tersebut. Suatu ekstrak berpotensi sebagai antioksidan jika konsentrasi penghambatan 50% (IC50) ˂200 g/mL (Molyneux 2004). Antioksidan adalah bahan yang beraktivitas mencegah atau menghambat kerusakan sel akibat reaksi oksidasi oleh radikal bebas (Huda et al. 2009). Aktivitas antioksidan suatu tanaman obat ditentukan oleh kandungan metabolit sekunder atau senyawa aktif yang dimilikinya sehingga menentukan kualitas pengobatan. Oleh karena itu, tujuan penelitian ini adalah mengidentifikasi komponen kimia fraksi aktif antioksidan dari ekstrak metanol daun muda pohon penghasil gaharu A. microcarpa hasil inokulasi.
METODE
Metode penelitian diringkaskan dalam diagram alir pada Lampiran 1 yang terdiri atas tahap pengambilan sampel, preparasi sampel, maserasi dengan pelarut metanol, fraksionasi kolom, uji aktivitas antioksidan metode DPPH, dan analisis kromatografi gas-spektrometri massa (GC-MS).
Alat dan Bahan
Bahan-bahan yang digunakan antara lain daun muda pohon penghasil gaharu berumur 17 tahun jenis A. microcarpa hasil inokulasi jamur Fusarium solani (isolat asal Papua) pada tahun 2009, metanol teknis, diklorometana teknis, akuades, silika gel 60 (0.040-0.063 mm), asam askorbat (vitamin C), dan 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH).
Alat yang digunakan antara lain alat kaca, oven, eksikator, penguap putar, kromatografi kolom, spektrofotometer ultraviolet tampak (UV-Vis) berkas ganda Pharma Spec 1700 Shimadzu, dan GC-MS Agilent dengan GC seri 7890 dan MS seri 6950.
Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel dilakukan di Kawasan Hutan dengan Tujuan Khusus (KHDTK) Carita, Banten (6° 28´ LS; 105° 85´ BB) pada bulan Desember 2014. Daun berasal dari pohon A. microcarpa hasil inokulasi isolat jamur asal Papua (F. solani). Daun yang diambil adalah daun muda. Daun muda adalah pucuk sampai beberapa tangkai daun setelahnya yang daunnya masih bertekstur halus, tidak kaku, dan berwarna hijau muda mengilat.
Preparasi Sampel
3
Penentuan Kadar Air (AOAC 2006)
Simplisia ditimbang sebanyak 1 g kemudian dimasukkan ke dalam cawan porselen yang telah dipanaskan sebelumnya di dalam oven bersuhu 105 °C selama 3 jam sampai bobotnya konstan. Cawan berisi sampel dipanaskan di dalam oven bersuhu 105 °C selama 3 jam, lalu didinginkan di dalam eksikator dan ditimbang. Pemanasan diulangi hingga diperoleh bobot konstan. Kadar air contoh ditentukan dengan persamaan
d r ir 100
Keterangan: A = bobot contoh sebelum dikeringkan (g) B = bobot contoh setelah dikeringkan (g)
Ekstraksi (Dewi 2013)
Simplisia ditimbang sebanyak 280 g, lalu dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer. Metanol ditambahkan dengan nisbah bobot simplisia terhadap volume metanol sebesar 1:10, dan maserasi dilakukan selama 24 jam dengan bantuan pengadukan secara berkala. Filtrat disaring dan residu diremaserasi dengan volume metanol yang sama selama 24 jam sebanyak 2 kali ulangan lagi sehingga total maserasi menjadi 3×24 jam. Filtrat yang dihasilkan dikumpulkan lalu dipekatkan dengan penguap putar dan ditentukan rendemennya. Rendemen ditentukan dengan persamaan
e de e e str 100
Keterangan: A = bobot ekstrak (g) B = bobot contoh kering (g)
Fraksionasi (Iswani 2014)
4
Uji Aktivitas Antioksidan (Huda etal. 2009)
Sebanyak 7.8864 mg DPPH dilarutkan dalam labu takar 50 mL dengan metanol sehingga konsentrasinya 0.40 mM. Larutan induk sampel 500 g/mL dibuat dari 2.5 mg sampel dilarutkan dengan metanol hingga volumenya 5 mL, dan larutan induk standar asam askorbat 300 g/mL dibuat dari 3 mg standar dilarutkan dengan metanol hingga volumenya 10 mL. Deret konsentrasi sampel dibuat dari larutan induknya menjadi 5, 10, 25, 50, dan 100 g/mL, demikian pula deret konsentrasi standar dibuat dari larutan induknya menjadi 3, 6, 9, 12, dan 15 g/mL. Sampel dan standar masing-masing dimasukkan sebanyak 3 mL ke dalam tabung reaksi, sebagai blangko digunakan 3 mL metanol. Selanjutnya larutan DPPH 0.40 mM ditambahkan sebanyak 0.6 mL ke dalam setiap tabung, tepat sebelum campuran diinkubasi pada suhu 37 °C selama 30 menit. Campuran diukur absorbansnya dengan spektrofotometer UV-Vis pada 515 nm. Nilai IC50 dihitung dari kurva antara persentase aktivitas penghambatan radikal DPPH dan logaritma konsentrasi sampel dan standar.
Analisis GC-MS (Ichzan 2014)
Fraksi teraktif dari hasil penapisan aktivitas antioksidan pada keempat fraksi, yaitu fraksi dengan IC50 terendah selanjutnya dianalisis dengan menggunakan GC-MS Agilent dengan GC seri 7890 dan GC-MS seri 6950 yang kondisi alatnya telah disesuaikan. Kolom kapiler nonpolar J&W tipe HP-5ms (5% fenilmetilpolisiloksana) digunakan sebagai fase diam. Helium digunakan sebagai fase gerak dengan laju alir sebesar 1.00 L/ e it. Pengukuran kromatografi gas dilakukan pada mode kerja suhu terprogram. Selanjutnya MS dioperasikan pada mode ionisasi tumbukan elektron (electron impact) dengan tegangan 70 eV. Evaluasi spektrum massa dilakukan dengan mencocokkan pola spektrum pada pustaka spektrum massa pada pangkalan data MS.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kadar Air
5
Ekstraksi
Ekstraksi adalah proses pemisahan senyawa dari suatu bahan dengan menggunakan pengekstrak yang sesuai. Pemisahan berprinsip like dissolved like, artinya kelarutan zat dalam pelarut bergantung pada kepolarannya. Zat yang polar akan larut dalam pelarut polar, sedangkan zat yang nonpolar akan larut dalam pelarut nonpolar (Harbourne et al. 2013). Ekstraksi maserasi didasarkan pada perpindahan massa komponen zat padat secara difusi ke dalam pelarut. Sampel tanaman yang direndam akan mengalami pemecahan dinding sel dan membran sel akibat perbedaan tekanan antara di dalam dan di luar sel, sehingga metabolit sekunder dari dalam sitoplasma akan terlarut ke dalam pelarut organik (Seidel 2005).
Maserasi dipilih untuk ekstraksi daun A. microcarpa karena pada teknik ini, sampel hanya direndam pada suhu ruang tanpa mengalami proses lain selain pengadukan. Hal ini akan menghindari kerusakan komponen senyawa yang belum diketahui, sehingga maserasi sangat cocok untuk digunakan dalam ekstraksi pendahuluan senyawa bahan alam. Pemilihan pelarut yang sesuai merupakan faktor penting dalam proses maserasi. Secara umum, pelarut untuk ekstraksi harus selektif, mampu mengekstraksi komponen sasaran, sifat racunnya rendah, mudah diuapkan, dan harganya terjangkau. Alkohol adalah pelarut serbaguna yang baik untuk ekstraksi pendahuluan karena dapat mengekstraksi keseluruhan senyawa (Simanjuntak 2007). Metanol juga dipilih karena mengacu pada hasil penelitian Dewi (2013), toksisitas ekstrak metanol daun muda A. microcarpa hasil inokulasi isolat jamur asal Papua sebesar 26.47 g/mL dan memenuhi kriteria berpotensi antikanker. Pelarut metanol bersifat universal, yaitu dapat menarik sebagian besar senyawa kimia. Metanol adalah alkohol paling sederhana yang memiliki gugus polar ( OH) dan gugus nonpolar ( CH3). Hal inilah yang membuatnya mampu menarik analit dengan polaritas yang bervariasi.
6
Fraksionasi
Fraksionasi adalah pemisahan golongan senyawa yang satu dari golongan yang lain dalam suatu campuran (Day dan Underwood 2002). Pemisahan golongan senyawa dalam ekstrak kasar daun A. microcarpa dilakukan secara kromatografi kolom. Kolom kaca dengan cerat pada salah satu ujungnya diisi dengan fase diam silika gel, lalu ekstrak dituangkan ke atasnya. Pelarut (eluen) sebagai fase gerak lalu dibiarkan mengalir melalui kolom dengan dorongan gaya gravitasi. Komponen dengan afinitas yang lebih besar terhadap adsorben secara selektif akan lebih tertahan dibandingkan dengan komponen yang afinitasnya kecil yang lebih mudah terbawa bersama eluen. Dengan cara ini, pemisahan terjadi (Hendayana 2006). Pemisahan golongan senyawa dilakukan secara gradien, yaitu selama proses elusi polaritas fase gerak terus ditingkatkan. Gambar 1 menunjukkan diagram rendemen fraksi-fraksi yang diperoleh dengan varian eluen yang digunakan. Data lengkap rendemen fraksi dapat dilihat pada Lampiran 3b.
Gambar 1 Diagram rendemen fraksi-fraksi ekstrak metanol daun A. microcarpa hasil inokulasi, menggunakan kolom silika gel dengan varian eluen Fraksionasi memisahkan komponen-komponen dalam ekstrak daun muda A. microcarpa berdasarkan tingkat kepolarannya. Eluen diklorometana, metanol, dan air berturut-turut memiliki indeks polaritas sebesar 3.1, 6.6, dan 10.2 (Reichardt dan Welton 2010). Oleh karena itu, fraksi diklorometana akan mengandung senyawa-senyawa yang bersifat nonpolar dan fraksi diklorometana-metanol 1:1 mengandung senyawa-senyawa semipolar. Sementara itu, senyawa-senyawa polar akan terdapat dalam fraksi metanol dan senyawa-senyawa yang sangat polar terpisah pada fraksi metanol-air 1:1. Sisa ekstrak di dalam kolom sebanyak 11.91%. Rendemen tertinggi diperoleh fraksi diklorometana-metanol 1:1, yaitu sebesar 39.60%, yang menunjukkan bahwa ekstrak daun muda A. microcarpa hasil inokulasi lebih banyak mengandung senyawa semipolar. Keempat fraksi yang diperoleh lalu ditapis aktivitas antioksidannya dengan metode DPPH.
Aktivitas Antioksidan
7
Aktivitas suatu ekstrak sebagai antioksidan antara lain dapat diketahui dengan menggunakan metode DPPH. Senyawa DPPH menerima transfer radikal hidrogen dari antioksidan membentuk molekul hidrazina dan terbentuk radikal baru dari molekul antioksidan yang kereaktifannya rendah (Gambar 2).
Gambar 2 Reaksi DPPH dengan antioksidan (Amic et al. 2003)
Metode DPPH merupakan metode pengukuran antioksidan yang sederhana, cepat, dan tidak membutuhkan banyak pereaksi. Molekul DPPH adalah radikal bebas yang stabil karena elektron yang tidak berpasangan didelokalisasi ke keseluruhan molekul sehingga tidak terjadi dimerisasi seperti pada radikal bebas umumnya. Delokalisasi ini juga menyebabkan molekul dalam larutan berwarna ungu, ditandai dengan serapan maksimum pada 515 nm. Jika larutan DPPH bereaksi dengan suatu zat yang mampu mendonorkan atom hidrogen, maka dihasilkan suatu bentuk tereduksi (2,2-difenil-1-pikrilhidrazina) yang ditunjukkan dengan hilangnya warna ungu (atau perubahan ke kuning pucat akibat masih adanya gugus pikril). Perubahan tersebut diukur dengan spektrofotometer dan dialurkan terhadap konsentrasi sehingga aktivitas peredaman radikal bebas dapat ditentukan (Molyneux 2004). Tabel 1 menunjukkan hasil uji aktivitas antioksidan untuk ekstrak kasar dan fraksi-fraksinya. Perhitungan IC50 disajikan pada Lampiran 4.
Tabel 1 Aktivitas antioksidan ekstrak kasar dan hasil fraksionasi
Sampel IC50
( g/mL) Vitamin C (kontrol positif) 3.49
Ekstrak kasar 68.99
Fraksi diklorometana 3244.54 Fraksi diklorometana-metanol 1:1 39.69
Fraksi metanol 25.89
Fraksi metanol-air 1:1 54.48
Hasil uji menunjukkan adanya senyawa aktif antioksidan pada ekstrak kasar daun muda A. microcarpa hasil inokulasi sebab IC50 yang diperoleh sebesar
DPPH
Antioksidan
Hidrazina
8
68.99 g/mL, memenuhi kriteria IC50 ekstrak kasar di bawah 200 g/mL yang berpotensi sebagai antioksidan (Molyneux 2004). Komponen aktif antioksidan dalam ekstrak ini berada dalam rentang senyawa semipolar sampai sangat polar, sebab ketiga fraksi pada tingkat kepolaran tersebut memiliki nilai IC50 di bawah 200 g/mL. Hanya fraksi diklorometana yang tidak memiliki aktivitas antioksidan. Aktivitas tertinggi dihasilkan fraksi metanol dengan IC50 sebesar 25.89 g/mL. Aktivitas antioksidan fraksi ini lebih kuat dibandingkan dengan ekstrak kasarnya karena senyawa berada dalam kondisi yang lebih murni oleh pemisahan dengan kromatografi kolom berdasarkan tingkat kepolaran. Namun, aktivitas tersebut belum sebaik standar vitamin C sebagai antioksidan komersial yang nilai IC50-nya 3.49 g/mL. Hal ini dikarenakan aktivitas komponen aktif antioksidan dalam fraksi metanol tersebut dipengaruhi oleh senyawa yang masih banyak terbawa oleh metanol dari ekstrak kasarnya.
Analisis GC-MS
Analisis GC-MS adalah metode yang menggabungkan fitur dari kromatografi gas (GC) dan spektroskopi massa (MS) untuk mengidentifikasi komponen kimia dalam sampel uji. GC-MS terdiri atas 2 bagian: bagian GC yang memisahkan campuran ke dalam komponen-komponennya dan bagian MS yang mengidentifikasi dan mengkuantifikasi komponen-komponen tersebut. Setelah sampel melewati GC, komponen kimia diteruskan ke MS. Molekul ditembak oleh elektron dan terpecah menjadi fragmen-fragmen yang kemudian berubah menjadi partikel bermuatan positif. Ion-ion ini kemudian bergerak melewati medan elektromagnetik yang akan menyaring ion berdasarkan massanya. Ion-ion lalu memasuki detektor dan jumlah ion dengan massa tertentu akan dihitung. Informasi ini dikirim ke komputer dan spektrum massa dibuat, berupa hubungan jumlah ion dengan massanya yang telah bergerak melalui filter (Hamid et al. 2011). Spesifikasi dan kondisi alat GC-MS dapat dilihat pada Lampiran 5.
Fraksi metanol dianalisis dengan GC-MS karena memiliki aktivitas antioksidan tertinggi dari keempat fraksi yang diperoleh. Identifikasi komponen kimia didasarkan pada spektrum massa komponen yang dicocokkan dengan pustaka National Institute of Standard and Technology (NIST) pada perangkat lunak GC-MS. Kromatogram GC-MS dapat dilihat pada Lampiran 6. Hasil analisis memperlihatkan adanya 24 senyawa, tetapi 4 senyawa di antaranya memili i ti g t e irip spe tru ˂72% (Lampiran 7). Tabel 2 menunjukkan senyawa-senyawa hasil analisis dengan tingkat kemiripan spektrum ≥72%.
9
2,4,5-trioksoimidazolidina, 5-nitropirimidina-2,4-diol, dan asam N-(3,5-dinitro-2-piridinil)aspartat.
Oktilsiklopropil)oktanal C19H36O 10 20.588 3 568 477 2.16 Metil stearat C19H38O2 11 21.167 3 902 915 2.36 Asam cis-vaksenat C18H34O2 12 21.526 11 353 647 6.86
13,17,21-Trimetilpentatriakontana C38H78 13 22.104 2 068 898 4.38 1-Heksakosena C26H52 14 22.564 1 010 454 1.72 cis-1-kloro-9-oktadekena C18H35Cl 15 24.742 3 626 475 2.19 Tetrapentakontana C54H110 16 25.746 3 870 798 2.76 Oktatriakontil
pentafluoropropionat C41H77F5O2 17 26.231 2 050 185 1.24 Oktadesil trifluoroasetat C30H57F3O2 18 26.663 325 438 0.20 Dokosil
pentafluoropropanoat C25H45F5O2 19 27.600 12 922 296 7.81 Heneikosana C21H44 20 28.308 417 846 0.25 1-Heksakosanol C26H54O
10
Gambar 3 Dugaan senyawa aktif antioksidan dalam fraksi metanol ekstrak daun muda A. microcarpa hasil inokulasi: 1) alkaloid fenolik (5-nitropirimidina-2,4-diol) dan 2) alkaloid amina sekunder aromatik (asam N-(3,5-dinitro-2-piridinil)aspartat) (Brown 2009)
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Daun muda pohon penghasil gaharu Aquilaria microcarpa hasil inokulasi berpotensi sebagai sumber antioksidan karena fraksi metanol dari ekstrak daun tersebut memiliki IC50 yang baik sebesar 25.89 g/mL. Hasil analisis GC-MS memperlihatkan adanya 24 senyawa yang teridentifikasi di dalam fraksi metanol, di antaranya adalah senyawa fenolik, yaitu 5-nitropirimidina-2,4-diol dan alkaloid amina sekunder aromatik, yaitu asam N-(3,5-dinitro-2-piridinil)aspartat yang diduga berperan sebagai senyawa antioksidan.
Saran
Aktivitas antioksidan lazim dihubungkan dengan manfaatnya dalam terapi kanker. Disarankan pengujian toksisitas fraksi aktif antioksidan yang diperoleh agar diketahui potensi antikankernya. Penelitian lebih lanjut dapat dilakukan untuk isolasi dan pemurnian menggunakan KCKT preparatif sehingga diperoleh senyawa bioaktif yang murni dan dapat dielusidasi struktur molekulnya dengan NMR dan instrumen pendukung lainnya sehingga dapat dibandingkan hasilnya dengan senyawa yang diperoleh dari hasil analisis GC-MS.
11
DAFTAR PUSTAKA
[AOAC] Association of Official Analytical Chemists. 2006. Official Methods of Analysis. Ed ke-18. Washington DC (US): AOAC.
Amic D, Beslo D, Trinajstic N. 2003. Structure-radical scavenging activity relationships of flavonoids. Croatia Chem Acta. 76(1):55-61.
Ariffin SHZ, Haryani WH, Omar W, Ariffin ZZ, Safian MF, Senafi S, Wahab RMA. 2009. Intrinsic anticarcinogenic effects of Piper sarmentosum ethanolic extract on a human hepatoma cell line. Cancer Cell Int Primary Res. 9(6):1-9.
Bhuiyan NI, Begum J, Bhuiyan NH. 2004. Analysis of essential oil of eaglewood tree by gas chromatography mass spectrometry. Bangladesh J Pharmacol. 4:24-28.
Brown DJ. 2009. The Chemistry of Heterocyclic Compound. New York (US): J Wiley.
[CITES] Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora. 2004. Amendments to Appendices I and II of CITES. Thirteenth Meeting of the Conference of the Parties. Bangkok (TH): CITES.
Chang YS, Nor AMA, Mailina J, Abu SA, Abdul MJ, Saidatul HS, Nor HH, Nik YY. 2008. Comparison of chemical profiles of selected gaharu oils from Peninsular Malaysia. Malaysian J Anal Sci. 12(2):338-340.
Day RA, Underwood AL. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif. Sopyan I, penerjemah; Wibi H, Simarmata L, editor. Jakarta (ID): Erlangga. Terjemahan dari: Quantitative Analysis. Ed ke-6.
Dewi KS. 2013. Toksisitas dan aktivitas antioksidan ekstrak daun pohon penghasil gaharu hasil inokulasi [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Hamid AA, Aiyelaagbe OO, Usman LA. 2011. Essential oils: its medicinal and pharmacological uses. Int J Curr Res. 3(2):86-98.
H rbour e N, M rete E, J cquire JC, O’ iord D. 2013. Conventional extraction techniques for phytochemicals. Di dalam: Tiwari BK, Brunton NP, Brennan CS, editor. Handbook of Plant Food Phytochemicals: Sources, Stability, and Extraction. New Jersey (US): Wiley-Blackwell.
Hendayana S. 2006. Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforesis Modern. Bandung (ID): Remaja Rosdakarya.
Herawati, Nuraida L, Sumarto. 2012. Cara Produksi Simplisia yang Baik. Bogor (ID): IPB Pr.
Huda AWN, Munira MAS, Fitrya SD, Salmah M. 2009. Antioxidant activity of Aquilaria malaccensis (Thymelaeaceae) leaves. Pharmacogn Res. 1(5):270-273.
Ichzan AM. 2014. Pemrofilan kandungan metabolit sekunder temu hitam (Curcuma aeroginosa) dengan kromatografi gas-spektroskopi massa dan kemometrik [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
12
Lisdawati V, Wiryowidagdo S, Kardono LBS. 2006. Bioasai in vitro antikanker terhadap sel leukemia L1210 dari berbagai fraksi ekstrak daging buah dan kulit biji mahkota dewa (Phaleria macrocarpa). JBAI. 5(1):303-309.
Mendki MJ, Ganesan K, Prakash S, Suryanarayana MVS, Malhotra RC, Rao KM, Vaidyanathaswamy R. 2000. Heneicosane: an oviposition attractant pheromone of larval origin in Aedes aegypti mosquito. Current Science. 78(11):1295-1296.
Molyneux P. 2004. The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity. Songklanakarin J Sci Technol. 26(2):211-219.
Novriyanti E. 2008. Peranan zat ekstraktif dalam pembentukan gaharu pada Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte dan Aquilaria microcarpa Baill [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Reichardt C, Welton T. 2010. Solvents and Solvent Effects in Organic Chemistry. Ed ke-4. New York (US): J Wiley.
Seidel V. 2005. Initial and bulk extraction. Di dalam: Sarker SD, Latif Z, Gray AI, editor. Methods In Biotechnology. Vol 20. Natural Product Isolation. Ed ke-2. New Jersey (US): Humana Pr. hlm 27-46.
Simanjuntak P. 2007. Strategi pencarian senyawa bioaktif baru dari sumber bahan alami tumbuhan. JIFI. 1(2):19-23.
Siran SA. 2010. Perkembangan pemanfaatan gaharu. Di dalam: Siran SA, Turjaman M, editor. Pengembangan Teknologi Produksi Gaharu Berbasis Pemberdayaan Masyarakat Sekitar Hutan. Bogor (ID): Pusat Penelitian dan Pengembangan Hutan dan Konservasi Alam. hlm 1-34.
13
Lampiran 1 Diagram alir penelititan Daun muda
A. microcarpa hasil inokulasi
Dikeringkan dan digiling
Difraksionasi dengan kromatografi kolom Diuji antioksidan dengan metode DPPH
Fraksi-fraksi
Ditentukan kadar airnya Dimaserasi dengan metanol Dipekatkan dengan penguap putar
Diuji antioksidan dengan metode DPPH
Fraksi teraktif
Profil kimia
Dianalisis GC-MS Ekstrak kasar
Simplisia
14
Lampiran 2 Kadar air simplisia daun muda A. microcarpa hasil inokulasi Ulangan Bobot cawan
kosong (g)
Bobot cawan + sampel (g) Bobot sampel (g) Kadar air (%)
Awal Akhir Awal Akhir
1 18.5642 19.5652 19.5199 1.0010 0.9557 4.52 2 18.9603 19.9605 19.9164 1.0002 0.9561 4.41 3 27.4296 28.4299 28.3861 1.0003 0.9565 4.38
Rerata 4.44
Contoh perhitungan:
d r ir bobot s pe bobot s pe bobot s pe hir 100
d r ir 1.00101.0010 g0.λ557 g 100
d r ir 4.52
15
Lampiran 3 Rendemen ekstrak dan fraksi
3. a Rendemen ekstrak metanol daun muda A. microcarpa hasil inokulasi
Contoh perhitungan:
e de e e str bobot s pe 100 d r ir 100 bobot e str
e de e e str 280.0000 g 100 4.44 100 31.λ18λ g
e de e e str 11.λ3
3. b Rendemen fraksi ekstrak metanol daun muda A. microcarpa hasil inokulasi Sampel Bobot ekstrak (g) Bobot fraksi (g) Rendemen (%) Fraksi A
12.1166
2.4875 20.53
Fraksi B 4.7983 39.60
Fraksi C 2.5140 20.75
Fraksi D 0.8739 7.21
Contoh perhitungan:
e de e fr si bobot e str 100 bobot fr si
e de e fr si 12.1166 g 100 2.4875 g
e de e fr si 20.53
Keterangan: Fraksi A = fraksi diklorometana
Fraksi B = fraksi diklorometana-metanol 1:1 Fraksi C = fraksi metanol
Fraksi D = fraksi metanol-air 1:1
Sampel Bobot sampel (g) Bobot ekstrak (g) Rendemen (%)
16
Lampiran 4 Hasil uji antioksidan metode peredaman radikal bebas DPPH 4. a Asam askorbat (kontrol positif)
Konsentrasi (µg/mL)
Absorbans Absorbans
rerata % inhibisi ln Konsentrasi Ulangan 1 Ulangan 2
Persamaan regresi linear: y = 36.3060x + 4.5937
17
lanjutan Lampiran 4
4. b Ekstrak metanol daun muda A. microcarpa hasil inokulasi Konsentrasi
(µg/mL)
Absorbans Absorbans
rerata % inhibisi ln Konsentrasi Ulangan 1 Ulangan 2
Persamaan regresi linear: y = 31.6110x 83.8410
18
lanjutan Lampiran 4 4. c Fraksi diklorometana Konsentrasi
(µg/mL)
Absorbans Absorbans
rerata % inhibisi ln Konsentrasi Ulangan 1 Ulangan 2
Persamaan regresi linear: y = 6.7357x 4.4563
19
lanjutan Lampiran 4
4. d Fraksi diklorometana-metanol 1:1 Konsentrasi
(µg/mL)
Absorbans Absorbans
rerata % inhibisi ln Konsentrasi Ulangan 1 Ulangan 2
Persamaan regresi linear: y = 23.4880x 36.4610
20
rerata % inhibisi ln Konsentrasi Ulangan 1 Ulangan 2
Persamaan regresi linear: y = 28.7880x 43.6710
21
rerata % inhibisi ln Konsentrasi Ulangan 1 Ulangan 2
Persamaan regresi linear: y = 22.0130x 38.0040
22
Lampiran 5 Spesifikasi dan kondisi alat GC-MS
Kondisi GC Spesifikasi dan program
Kolom
Tipe Kolom kapiler GC J&W tipe HP-5ms,
30 mm × 0.25 mm, eteb 0.25
Model aliran Konstan
Laju alir 1.00 L/ e it
Instrumen GC-MS
GC Agilent GC seri 7890
Gas pembawa Helium
Detektor Agilent MS seri 6950
Mode ionisasi Ionisasi tumbukan elektron 70 eV
Injektor
Tipe Manual
Volume Injeksi 2.00 L
Inlet
Suhu 250 ⁰C
Teknik injeksi Split
Suhu Oven
Suhu awal 40 ⁰C
Waktu awal 5 menit
Waktu operasi 30 menit
Program Suhu
Suhu awal 40 ⁰C ditahan selama 2 menit Laju kenaikan suhu 10 ⁰C/menit
23
24
Lampiran 7 Struktur senyawa-senyawa hasil analisis GC-MS
No Senyawa
Persen kemiripan
spektrum
Struktur molekul
1
2,4,5-Trioksoimidazolidina 72
2
5-Nitropirimidina-2,4-diol 78
3 Asam
N-(3,5-dinitro-2-piridinil)aspartat 79
4 Pentanal 64
5 2,5-Dioksopirolidina-1-karboksimidamida
47
6
N-Metil-1,3-dioksolana-2-metanamina 53
7 N-formildikarbonimida
25
lanjutan Lampiran 7
No Senyawa
Persen kemiripan
spektrum
Struktur molekul
8 Asam heksadekanoat 92
9 Asam
trans-13-oktadekenoat 91
10 Asam oleat 91
11 Metil palmitat 96
12 Asam oktadekanoat 95
13
8-(2-Oktilsiklopropil)oktanal 95
14 Metil stearat 95
15 Asam cis-vaksenat 90
16
26
lanjutan Lampiran 7
No Senyawa
Persen kemiripan
spektrum
Struktur molekul
17 1-Heksakosena 95
18
cis-1-Kloro-9-oktadekena 93
19 Tetrapentakontana 93
20 Oktatriakontil
pentafluoropropionat 90
21 Oktadesil trifluoroasetat 92
22 Dokosil
pentafluoropropanoat 90
23 Heneikosana 96
27
