KARAKTERISTIK SEMEN DOMBA YANG DIKRIOPRESERVASI
DENGAN GLISEROL ATAU
DIMETHYL SULPHOXIDE
(DMSO)
DALAM PENGENCER LAKTOSA-KUNING TELUR
DIBA MAHARGIA TANTARY
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Karakteristik Semen Domba yang Dikriopreservasi dengan Gliserol atau Dimethyl Sulphoxide (DMSO) dalam Pengencer Laktosa-Kuning Telur adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
ABSTRAK
DIBA MAHARGIA TANTARY. Karakteristik Semen Domba yang Dikriopreservasi dengan Gliserol atau Dimethyl Sulphoxide (DMSO) dalam Pengencer Laktosa-Kuning Telur. Dibimbing oleh NI WAYAN KURNIANI KARJA.
Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi kualitas (karakteristik) semen domba yang diperoleh dari ejakulat yang dibekukan dengan krioprotektan gliserol (C3H5(OH)3) dan Dimethyl Sulfophoxide (DMSO) ((CH3)2SO) dalam pengencer laktosa-kuning telur. Semen diperiksa secara makroskopik dan mikroskopik kemudian diencerkan dalam medium NSF (Niwa Sazaki Freezing) yang ditambahkan dengan krioprotektan gliserol atau DMSO. Terjadi penurunan kualitas (motilitas, viabilitas, dan integritas membran plasma) spermatozoa setelah dibekukan baik dengan gliserol maupun DMSO (P<0.05). Akan tetapi tidak ditemukan adanya perbedaan yang nyata pada persentase motilitas, viabilitas, dan integritas membran plasma spermatozoa setelah dibekukan dengan gliserol atau DMSO (P>0.05). Dari data yang diperoleh pada penelitian ini dapat disimpulkan bahwa gliserol dan DMSO sebagai krioprotektan mempunyai efektifitas yang sama untuk pembekuan semen domba.
Kata kunci: dimethyl sulphoxide, gliserol, kriopreservasi, semen domba
ABSTRACT
DIBA MAHARGIA TANTARY. Characteristic of Ram Semen Cryopreservated with Glycerol or Dimethyl Sulphoxide (DMSO) in Diluent Lactose-Egg Yolk. Supervised by NI WAYAN KURNIANI KARJA.
The aim of this research was to evaluate the ram semen quality (characteristic) cryopreservated with extender contains of glycerol or dimethyl sulphoxide in lactose-egg yolk. Semen were examined by macroscopic and microscopic then diluted in NSF (Niwa Sazaki Freezing) which added by cryoprotectant glycerol or DMSO. The quality decreased (motility, viability, and membrane plasma integrity) of spermatozoa after cryopreservated with glycerol or DMSO (P<0.05). There was no differences on motility, viability, and membrane plasma integrity after cryopreservated (P>0.05). Based on this result, concluded that glycerol and DMSO as a cryoprotectant has the same effectiviness for ram semen cryopreservation.
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Hewan
pada
Fakultas Kedokteran Hewan
KARAKTERISTIK SEMEN DOMBA YANG DIKRIOPRESERVASI
DENGAN GLISEROL ATAU
DIMETHYL SULPHOXIDE
(DMSO)
DALAM PENGENCER LAKTOSA-KUNING TELUR
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2015
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini dapat berhasil diselesaikan. Judul yang dipilih dalam penelitian ini yaitu “Karakteristik Semen Domba yang Dikriopreservasi dengan Gliserol atau Dimethyl Sulphoxide (DMSO) dalam Pengencer Laktosa-Kuning Telur”. Penulis menyampaikan terima kasih dan penghargaan teristimewa kepada Drh. Ni Wayan Kurniani Karja, MP., Ph.D sebagai pembimbing atas perhatian dan bimbingannya selama penelitian dan penyelesaian skripsi. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada seluruh staff dan tenaga kependidikan Bagian Reproduksi dan Kebidanan FKH IPB yang telah membantu penulis untuk menyelesaikan skripsi ini.
Tak lupa ucapan terima kasih juga disampaikan kepada orangtua, keluarga tercinta serta kerabat dekat atas doa dan kasih sayangnya, serta teman-teman seperjuangan ACROMION 47 atas kerjasama dan bantuannya selama ini.
Menyadari banyaknya kekurangan dalam diri Penulis, maka Penulis mengharapkan saran dan kritik guna penyempurnaan skripsi ini dan semoga bermanfaat bagi kita semua.
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR vii
PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Tujuan Penelitian 2
Manfaat Penelitian 2
TINJAUAN PUSTAKA 2
Karakteristik Semen 2
Pengencer Semen 2
Krioprotektan 3
METODE 4
Bahan 4
Alat 4
Metode Penelitian 5
Analisis Data 6
HASIL DAN PEMBAHASAN 6
SIMPULAN DAN SARAN 10
Simpulan 10
Saran 10
DAFTAR PUSTAKA 11
DAFTAR GAMBAR
1 Motilitas spermatozoa domba sebelum dan setelah thawing 7 2 Viabilitas spermatozoa domba sebelum dan setelah thawing 7 3 Integritas membran plasma spermatozoa domba sebelum dan setelah 8
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Inseminasi buatan (IB) merupakan teknologi yang telah digunakan secara luas dalam bidang pertanian dan peternakan di dunia. Inseminasi buatan memegang peranan penting seperti perbaikan mutu genetik, kontrol penyakit seksual menular, dan pelestarian plasma nutfah (Cseh et al. 2012). Beberapa faktor yang menentukan keberhasilan IB antara lain sinkronisasi birahi pada betina, deposisi sperma yang tepat, dan kualitas dari spermatozoa (Saacke 2008). Perkembangan IB saat ini berfokus pada pelestarian semen segar dan beku dengan meningkatkan komposisi pengencer, serta mengubah protokol pembuatan semen beku (Cseh et al. 2012). Inseminasi buatan pada ruminansia kecil sebagian besar masih dilakukan dengan semen segar karena masih terdapat banyak kendala dalam pengolahan semen beku (Cseh et al. 2012).
Salah satu faktor penting yang menunjang keberhasilan IB adalah kualitas semen. Semen yang digunakan dalam IB akan mengalami pembekuan (cryopreservation), sehingga akan terjadi kerusakan atau yang biasa disebut sebagai cryoinjury.). Proses kriopreservasi dapat menyebabkan kerusakan pada spermatozoa akibat kejutan dingin (cold shock), pembentukkan kristal es, stres oksidatif, dan perubahan komposisi dari protein lipid sel membran spermatozoa (Medeiros et al. 2002; Morris et al. 2012). Kerusakan semen akibat proses kriopreservasi dapat dicegah dengan penambahan krioprotektan ke dalam bahan pengencer semen. Krioprotektan dikategorikan ke dalam dua tipe berdasarkan kemampuannya untuk menembus membran sel. Tipe yang pertama yaitu tipe krioprotektan yang bersifat permiabel seperti gliserol, etilen glikol, propylene glikol, dimethyl sulphoxide (DMSO), dan tipe yang kedua adalah krioprotektan yang bersifat non-permiabel seperti sukrosa, glukosa dan polimer seperti dextran, susu, kuning telur, dan anti beku protein (Devismita dan Kumar 2015).
Gliserol dan DMSO telah digunakan dalam beberapa penelitian dengan hasil yang bervariasi. Watson et al. (1997) melaporkan bahwa tidak ada perbedaan efektifitas antara gliserol 5% dan DMSO 5% dalam pengencer Tris-kuning telur terhadap kualitas spermatozoa epididymis waterbuck, greater kudu, dan warthog. Sedangkan penelitian pada kerbau ditemukan bahwa efektifitas gliserol lebih superior daripada DMSO dalam pengencer Tris-asam sitrat (Rasul et al. 2007). Hasil yang sama dilaporkan oleh Saragusty et al. (2009), penggunaan gliserol 5%, 7%, dan 10% menunjukkan hasil yang lebih baik dibandingkan DMSO 6% pada kriopreservasi semen gajah dengan pengencer kuning telur.
2
karena senyawa pengoksidasi menghasilkan produk yang dapat merusak integritas membran.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi kualitas (karakteristik) semen domba yang dibekukan dengan krioprotektan gliserol (C3H5(OH)3) dan dimethyl sulfoxide ((CH3)2SO) dalam media laktosa-kuning telur.
Manfaat Penelitian
Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi krioprotektan yang sesuai untuk pengencer laktosa-kuning telur dan kualitas semen beku domba setelah dibekukan dengan jenis krioprotektan yang berbeda.
TINJAUAN PUSTAKA
Karakteristik Semen
Semen merupakan cairan yang mengandung spermatozoa dan plasma semen yang dihasilkan dari sekresi oleh kelenjar kelamin jantan (Herdis et al. 2003). Semen domba normal berwarna krem dengan derajat kekeruhan tergantung dari konsentrasi spermatozoa yang dikandung. Selain itu semen domba normal memiliki konsistensi yang kental. Volume semen domba berkisar antara 0.5 sampai 2.5 ml dengan konsentrasi 1.500 juta sampai 3.000 juta sel per ml semen dan persentase spermatozoa hidup sekitar 90%. Derajat keasaman (pH) berkisar antara 5.9 sampai 7.3. Semen dengan konsentrasi spermatozoa yang tinggi bereaksi agak asam, sedangkan yang memiliki konsentrasi rendah bereaksi agak basa (Paalloan 2013). Kualitas karakteristik semen segar dapat berubah akibat proses kriopreservasi. Kerusakan umum pada sel spermatozoa selama proses kriopreservasi diakibatkan oleh adanya fenomena cold shock, kerusakan organel sitoplasma, dehidrasi dari suspensi media baik intra maupun ekstraseluler dan perubahan fisik serta kimiawi sel (Camara et al. 2011). Oleh sebab itu perlu diperhatikan faktor yang menunjang keberhasilan kriopreservasi, motilitas spermatozoa, dan fungsi metabolik dari spermatozoa itu sendiri serta penambahanan krioprotektan yang tepat (Watson 2000; El-harairy et al. 2011).
Pengencer Semen
3 melindungi membran sel spermatozoa, mereduksi kejutan dingin (cold shock), dan meningkatkan viabilitas spermatozoa (Medeiros et al. 2002; Kulaksiz et al. 2010). Pada pengencer susu skim terkandung fosfokasein dan laktoglobulin-b untuk memperpanjang masa hidup spermatozoa pada saat terjadi proses kriopreservasi (Battelier 2001). Pengencer lainnya seperti tris, memiliki sifat tidak larut dalam air namun memiliki kemampuan menembus membran spermatozoa dan lebih tahan terhadap perubahan pH selama proses pendinginan (Castelo et al. 2010). Pengencer tris juga mengandung fruktosa dan glukosa yang berfungsi sebagai sumber energi utama pada spermatozoa (Castelo et al. 2010). Sementara itu menurut penelitian yang dilakukan Kasimanickan et al. (2011) ekstrak kacang kedelai dapat digunakan sebagai bahan pengencer dalam proses kriopreservasi semen domba. Dimana di dalamnya terkandung lesitin dan lipoprotein yang digunakan untuk perlindungan sel spermatozoa selama proses kriopreservasi.
Selain karbohidrat, laktosa juga memiliki peran yang penting terhadap spermatozoa. Laktosa yang ditambahkan ke dalam pengencer mampu meningkatkan persentase spermatozoa motil setelah thawing. Hal ini disebabkan oleh fungsi laktosa sebagai krioprotektan ekstraseluler yang mampu mengurangi kerusakan membran plasma sel selama proses ekuilibrasi sampai dengan thawing. Selain itu laktosa dapat meningkatkan fluiditas membran plasma sel spermatozoa sebelum pembekuan (Rizal 2006). Laktosa juga memiliki kemampuan untuk menggantikan molekul air secara normal, sifat laktosa tersebut akan membantu menstabilkan membran plasma sel spermatozoa selama masa transisi (dimana spermatozoa akan melewati zona suhu yang kritis), mengubah sifat mekanik pengencer melalui peningkatan viskositas (Viswanath dan Shannon 2000). Berbeda dengan kelompok oligosakarida, penggunaan jenis gula dari kelompok disakarida terutama laktosa telah digunakan dari waktu ke waktu. Laktosa berperan sebagai sumber energi, membantu pengeluaran air dari dalam sel sehingga mampu mengurangi pembentukkan kristal es. Selain itu laktosa juga sebagai penyangga osmotik untuk menghindari pembengkakan sel dan memiliki kemampuan menggantikan molekul air secara normal dalam kelompok polar hydrated. Sifat-sifat ini akan membantu menstabilkan membran sel selama transisi melalui zone temperatur kritis, serta mengubah sifat mekanik dari pengencer melalui peningkatan viskositas (Vishnawanth dan Shanon 2000). Laktosa terdiri dari atas satu unit glukosa dan galaktosa yang keduanya dapat dimanfaatkan oleh spermatozoa dalam proses glikolisis dan siklus Krebs untuk menghasilkan energi berupa adenosin trifosfat (ATP). Adenosin trifosfat dimanfaatkan oleh spermatozoa sebagai energi dalam proses pergerakan sehingga dapat tetap motil dan mempertahankan daya hidupnya (Subowo 1995).
Krioprotektan
4
atau intraseluler sehingga viabilitas sel setelah kriopreservasi dapat terjaga (Ana et al. 2013). Secara umum terdapat dua kelompok krioprotektan yaitu krioprotektan intraseluler yang dapat masuk ke dalam sel sehingga dapat bekerja di dalam dan di luar sel. Kelompok yang kedua yaitu krioprotektan ekstraseluler yang bekerja hanya di luar sel. Krioprotektan intraseluler diantaranya adalah glycerol, dimethyl sulphoxide (DMSO), ethylene glycol (EG) dan 2 propanediol. Krioprotektan ekstraseluler memiliki molekul yang besar sehingga tidak dapat menembus membran sel, contohnya monosakarida, disakarida, protein, lipoprotein dan serum (Devismita dan Kumar 2015). Selain itu krioprotektan juga dapat diklasifikasikan berdasarkan komponen bahan utamanya; kelompok alkohol (ethylene glycol dan alkohol) dan amida (methylformamide dan dimethylformamide) (Alvarenga et al. 2005).
Gliserol merupakan krioprotektan yang digunakan secara luas pada peternakan unggas, ruminansia besar dan kecil serta pelestarian satwa liar (Holt 2000). Gliserol secara efektif dapat menurunkan titik beku intraselular spermatozoa dan dapat mendorong proses dehidrasi pada suhu yang rendah sehingga sel spermatozoa terlindungi (Hammerstedt et al. 1990). Selain itu gliserol memiliki kemampuan menyebabkan perubahan viskositas sitoplasma dan stabilitas membran plasma spermatozoa dari gangguan struktur fosfolipid dan protein yang berpotensi merusak spermatozoa pada saat proses kriopreservasi (Bessa et al.2006). Dimethyl sulphoxide telah digunakan dalam kriopreservasi embrio ikan yang dikombinasikan dengan teknik elektroporasi untuk mencegah terjadinya cryoinjury (Rahman et al. 2013). Penambahan DMSO sebagai krioprotektan juga dapat meningkatkan daya osmolalitas spermatozoa ikan (Horvath et al. 2005) dan kerusakan tudung akrosom spermatozoa bulu babi Laboratorium Fertilisasi In Vitro, Bagian Reproduksi dan Kebidanan dan Unit Rehabilitasi Reproduksi, Departemen Klinik Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
Alat dan Bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini, semen domba, telur ayam, aquades, bubuk penyumbat straw, laktosa, ampicillin, nitrogen cair, gliserol dan DMSO, Orvus es Paste (OEP), Eosin Negrosin, dan media fruktosa.
5
Metode Penelitian
Pembuatan Medium
Komposisi media Niwa dan Sazaki Freezing (NSF) (Kikuchi et al. 1999) yang terdiri dari NSF I dan NSF II. NSF I terdiri dari kuning telur (20%), laktosa (8.8%) yang dilarutkan dengan air mili-Q kemudian ditambahkan ampicillin (20 mg/mL). Medium NSF I disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 3500 rpm. NSF II terdiri dari NSF I yang ditambahkan OEP (1.48%), gliserol (6%) atau dimethyl sulfoxide (DMSO) (6%).
Koleksi Semen
Semen dikoleksi dari seekor domba dewasa kelamin (± umur 1-2 tahun) yang memiliki libido dan kondisi tubuh baik. Domba dipelihara dalam kandang terpisah, diberi pakan hijauan dan konsentrat secara teratur. Koleksi semen dilakukan satu kali seminggu. Ejakulat semen yang telah diperoleh kemudian dibawa ke laboratorium untuk diproses lebih lanjut.
Evaluasi Semen
Evaluasi semen dilakukan secara makroskopis dan mikroskopis. Evaluasi makroskopis dilakukan untuk semen segar meliputi pengukuran volume, warna, konsistensi, dan pH. Evaluasi mikroskopis meliputi penilaian terhadap presentase motilitas sperma, viabilitas, dan keutuhan membran plasma spermatozoa.
Pengamatan motilitas spermatozoa dinilai secara subjektif dengan meneteskan 1 tetes semen di atas gelas objek kemudian ditambahkan 7-8 tetes larutan NaCl fisiologis, dihomogenkan lalu diambil 1 tetes dan dipindahkan pada gelas objek lalu ditutup dengan cover glass. Penilian motilitas progresif spermatozoa dilakukan dengan interval nilai 1-100%.
Pemeriksaan viabilitas spermatozoa dilakukan dengan pewarnaan eosin negrosin dimana 1 tetes sperma diletakkan pada gelas objek kemudian ditambahkan 7-8 tetes pewarna eosin negrosin. Dihomogenkan lalu dibuat preparat ulas yang kemudian difiksasi selama 15 detik. Pemeriksaan viabilitas dilakukan dengan mikroskop cahaya perbesaran 400x dengan melihat bagian kepala spermatozoa dengan jumlah maksimal yang dihitung adalah 200 spermatozoa. Spermatozoa yang mati ditandai dengan terserapnya warna sedangkan spermatozoa yang hidup ditandai dengan tidak terserapnya warna merah dari eosin negrosin.
Membran Plasma Utuh (MPU) spermatozoa dianalisa dengan media Hypo-osmotic Swelling (HOS) Test. Media HOS terdiri dari 0.135 g fruktosa dan 0.0735 g trisodium citrate 2H2O dalam air mil-Q (Perez-Llano et al. 2001). Pemeriksaan
dilakukan dengan menambahkan sebanyak 10 μL semen ke dalam tabung ependorf yang telah diisi media HOS sebanyak 40 μL lalu dihangatkan dalam
6
Pembekuan Semen
Semen diperiksa secara makroskopik dan mikroskopik kemudian diencerkan dalam medium NSF I. Medium dibagi menjadi dua bagian sebanyak 1 mL kemudian dicampur dengan 0.025 mL semen. Selanjutnya dilakukan proses ekuilibrasi pada suhu 4 ºC selama dua jam. Semen yang telah diekuilibrasi ditambahkan medium NSF II sebanyak 0.5 mL dengan perbandingan konsentrasi gliserol atau DMSO 1:1 lalu diekuilibrasi kembali selama 5 menit, kemudian ditambahkan medium NSF II kembali sebanyak 0.5 mL. Semen dikemas dalam mini straw (0.25 mL) dengan konsentrasi spermatozoa 100x106 per straw. Jumlah straw yang digunakan untuk masing-masing krioprotektan berjumlah tiga. Straw yang berisi semen ditempatkan di atas permukaan nitrogen cair untuk dilakukan penguapan selama 120 menit. Langkah selanjutnya straw dmasukkan ke dalam nitrogen cair untuk disimpan. Semen beku diperiksa kembali karakteristiknya dengan cara mencairkan kembali (thawing) semen beku dengan memasukkan straw ke dalam air hangat.
ANALISIS DATA
Data berupa persentase motilitas, viabilitas, dan membran plasma utuh (MPU) diolah dengan menggunakan IBM SPSS Statistic 20 dan Microsoft excel 2013. Pengujian yang dipakai adalah uji One-Way Analysis of Variance (ANOVA) dan Paired Samples T-Test.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Evaluasi kualitas semen segar domba merupakan hal penting yang dilakukan sebelum proses kriopreservasi. Hasil evaluasi semen segar domba secara makroskopis pada penelitian ini adalah volume semen 0.75 mL, warna krem, konsistensi kental, dan derajat keasaman (pH) 6.7. Hasil evaluasi mikroskopis yang meliputi motilitas sebesar 83%, viabilitas 87.2%, MPU 86.8%, dan konsentrasi semen segar sebesar 4590 juta/mL. Dari hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa semen segar domba lokal yang didapat memiliki kualitas yang bagus dan normal. Hal ini sesuai dengan persyaratan umum spermatozoa segar yang akan dibekukan minimal memiliki persentase motilitas 70%, konsentrasi 2 x 109 sel/mL. gerakan massa ++/+++, persentase hidup minimal 80%, dan presentase abnormal tidak lebih dari 15% (Ihsan 2013).
7
Gambar 1 Motilitas spermatozoa domba sebelum (Fresh) dan setelah dibekukan dengan gliserol (PT-Gliserol) atau DMSO (PT-DMSO)
Keterangan:
PT-Gliserol,PT-DMSO =Post-Thawing spermatozoa dibekukan dengan Gliserol/DMSO
Superscript dengan huruf yang berbeda (a,b) pada bar yang sama menunjukkan adanya perbedaan nyata (P<0.05)
Motilitas spermatozoa (Gambar 1) setelah dibekukan dan dicairkan kembali mengalami penurunan sebesar 50% pada spermatozoa yang dibekukan dengan gliserol (PT-Gliserol) dan 53% pada sepermatozoa yang dibekukan dengan DMSO (PT-DMSO). Penurunan motilitas diakibatkan oleh adanya gangguan proses metabolisme dan kerusakan sel spermatozoa karena keluarnya air yang cukup banyak untuk mencapai keseimbangan potensial kimiawi intra dan ekstraselluler sehingga akibatnya sel mengalami dehidrasi, konsentrasi larutan intraselluler meningkat (Herdiawan 2004). Penurunan motilitas biasanya diikuti kerusakan organel sel sampai dengan terjadinya kematian sel spermatozoa (Kasai et al. 2002).
Gambar 2 Viabilitas spermatozoa domba sebelum (Fresh) dan setelah dibekukan dengan gliserol (PT-Gliserol) atau DMSO (PT-DMSO)
Keterangan:
PT-Gliserol,PT-DMSO =Post-Thawing spermatozoa dibekukan dengan gliserol/DMSO
8
Supersript dengan huruf yang berbeda (a,b) pada bar yang sama menunjukkan adanya perbedaan nyata (P<0.05)
Proses pembekuan mengakibatkan penurunan viabilitas spermatozoa sebesar 51.4% kelompok PT-Gliserol dan 54.20% PT-DMSO. Hernandez et al. (2012) melaporkan bahwa selama proses pembekuan-thawing hampir 50% spermatozoa mati. Zen et al. (2001) memaparkan bahwa yang terpenting bagi spermatozoa untuk memperpanjang daya hidupnya adalah adanya zat makanan dan keseimbangan asam basa (pH) pada bahan pengencer. Persentase viabilitas berkaitan dengan persentase motilitas spermatozoa, hal ini dikarenakan viabilitas dan motilitas merupakan syarat mutlak bagi spermatozoa agar dapat melakukan metabolisme dengan baik (Martinez et al. 1996).
Gambar 3 Integritas membran plasma spermatozoa domba sebelum (Fresh) dan setelah dibekukan dengan gliserol (PT-Gliserol) atau DMSO (PT-DMSO)
Keterangan:
PT-Gliserol,PT-DMSO=Post-Thawingspermatozoa dibekukan dengan gliserol/DMSO
Supercript dengan huruf yang berbeda (a,b) pada bar yang samamenunjukkan adanya perbedaan nyata (P<0.05)
Membran plasma utuh (MPU) spermatozoa setelah thawing mengalami penurunan sebesar 12.40% pada kelompok PT-Gliserol dan 16.60% pada kelompok PT-DMSO. Pembekuan lambat dan cepat dapat menyebabkan kerusakan integritas membran spermatozoa (Herdiawan 2004). Selama proses pembekuan dapat menyebabkan dehidrasi sehingga terjadi perbedaan konsentrasi cairan intraseluler dengan ekstraseluler. Hal tersebut dapat menimbulkan perubahan tekanan osmotik sel selama pembekuan sehingga selubung lipoprotein pecah dan membran sel mengalami kerusakan. Pembekuan cepat (20 ºC per menit) akan membentuk kristal-kristal es intraseluler yang akan mendesak membran sel ke segala arah, sehingga selaput membrannya pecah dan substansi kimia sel sperma keluar). Rusaknya membran plasma spermatozoa akan mengakibatkan terganggunya proses metabolisme dan fisiologis sehingga spermatozoa akan mengalami kematian (Zhu dan Liu 2000).
Persentase motilitas, viabilitas, dan MPU spermatozoa setelah thawing dengan penambahan krioprotektan gliserol dan DMSO menunjukkan hasil yang
9 tidak berbeda nyata (P>0,05). Hal ini dikarenakan kedua krioprotektan tersebut bersama-sama dengan kuing telur memberikan perlindungan teradap spermatozoa secara intraselluler dan ekstraselluler (Supriatna et al. 2005). Mekanisme perlindungan intraseluler terjadi dengan memasuki sel kemudian menggantikan air dan mendesak elektrolit lalu mengurangi daya perusak spermatozoa. Perlindungan secara ekstraseluler diberikan oleh lipoprotein yang terdapat dalam kuning telur ayam dengan memberikan perlindungan terhadap cold shock selama proses pembekuan dengan menstabilkan membran spermatozoa.
Penggunaan krioprotektan gliserol dan DMSO dapat mengurangi pembentukkan kristal es. Kedua krioprotektan ini dapat mereduksi kandungan air yang terdapat dalam intraseluler sel spermatozoa dan konsentrasi garam pada suhu tertentu (Keeley et al. 2012; Rasul et al. 2007). Kemampuan dari kedua krioprotektan tersebut mampu melindungi spermatozoa dari fenomena cryoinjury (Tasdemir et al. 2013). Pada beberapa penelitian penggunaan dari kedua krioprotektan ini menunjukkan hasil yang berbeda. Penggunaan gliserol dan DMSO pada kriopreservasi semen Tasmania devil menunjukkan hasil yang lebih baik pada DMSO (Keeley et al.2012). Pada kriopreservasi semen anjing domestic menunjukkan hasil yang paling baik dengan penggunaan gliserol (Songsasen et al. 2002). Pada banteng; simpanse; dan manusia penggunaan gliserol lebih efektif daripada DMSO (Tasdemir et al. 2013; Agca et al. 2005; Gao et al. 1997).
Gliserol yang digunakan sebagai krioprotektan berdifusi, menembus dan memasuki sel spermatozoa. Gliserol digunakan spermatozoa untuk metabolisme oksidatif, menggantikan elektrolit, menurunkan konsentrasi elektrolit intraseluler, dan mengurangi daya rusak terhadap sel spermatozoa (Arifiantini dan Azizah 2009). Adapun mekanisme kerja gliserol menurut penelitian yang dilaporkan oleh Mumu (2009), gliserol berdifusi ke dalam sel spermatozoa dan dapat dimetabolisir. dalam proses yang menghasilkan energi dan membentuk fruktosa. Selanjutnya gliserol akan memasuki siklus perombakan fruktosa pada triosa fosfat dan selanjutnya akan dirombak menjadi asam laktat. Fruktosa yang tersedia ini akan menyebabkan spermatozoa tetap bergerak, karena berperan menghasilkan energi berupa ATP (Adenosine Tri Phospate) yang mengandung fosfat anorganik yang kaya energi. Selain itu gliserol juga dapat mencegah terjadinya dehidrasi karena memiliki daya pengikat air yang kuat, sifat demikian mempengaruhi tekanan uap sehingga titik beku medium akan menurun. Peranan lain dari gliserol adalah dapat mencegah dehidrasi karena memiliki tiga gugus hidroksil (-OH) yang memiliki daya pengikat air yang kuat. Tiap gugus hidroksil ini dapat mengadakan interaksi dengan gugus karboksil asam lemak (Kimball 1998). Gliserol melindungi membran sel dengan mengikat gugus pusat fosfolipid sehingga mengurangi ketidakstabilan membran. Fosfolipid dapat berinteraksi dengan membran untuk mengikat protein dan glikoprotein (Parks dan Graham 1992). Keunggulan gliserol terletak pada daya pengikat air sehingga tidak dapat membentuk kristal es tajam yang dapat merusak sel spermatozoa.
10
tersebut berfungsi mencegah kematian sel saat proses pembekuan, memiliki titik beku tinggi pada suhu kamar. Penggunaan DMSO tidak lebih dari 10% pada metode slow-freezing dan sel spermatozoa aman dibekukan pada -80 ºC atau disimpan dalam nitrogen cair (Randhawa 2006). Penambahan DMSO ke dalam pengencer mempengaruhi proses pembekuan dan pencairan kembali. Dimethyl sulphoxide mencegah kerusakan dan kematian spermatozoa serta memberikan perlindungan yang efektif terhadap spermatozoa pada konsentrasi yang optimal
(Handayani 2004). Penambahan DMSO ke dalam pengencer dengan konsentrasi ≥
8% menunjukkan efek beracun terhadap viabilitas spermatozoa pada suhu 37 °C (Widjajakusuma et al. 2001). Mekanisme kerja DMSO menurut Handayani 2004, krioprotektan masuk ke dalam sel lalu menggantikan air dan mendesak elektrolit intraseluler keluar sampai pada titik konsentrasi yang tidak berbahaya saat proses pembekuan. Dimethyl Sulphoxide berperan sebagai pelarut antioksidan, meningkatkan permeabilitas membran sel dan dapat meningkatkan konsentrasi ion kalsium pada sitoplasma (Santos 2007).
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Gliserol dan Dimethyl Sulphoxide (DMSO) sebagai krioprotektan mempunyai efektifitas yang sama untuk pembekuan semen domba dalam media laktosa-kuning telur.
Saran
11
DAFTAR PUSTAKA
Agca Y, Liu J, Mullen S, Ward JJ, Gould K, Chan A, Critser J. 2005. Chimpanzee (Pan troglodytes) spermatozoa osmotic tolerance in cryoprotectant. Journal of Andrology. 26:470-477.
Aisen EG, Medina VH, Venturino A. 2002. Cryopreservation and post thawed fertility of ram semen frozen in different trehalose concentrations. Theriogenology. 57:1801-1808.
Alvarenga MA, Papa FO, Landi-Alfarenga FC, Medeiros ASL. 2005. Amides as cryoprotectants for freezing stallion semen. Animimal Reproduction Science. 89:105-113.
Ana IS, Balbin V, Eduardo GF, Marcimara P, Maura RVI, Miriam HT, Frederico OP, Maria DL. 2013. Cryoprotective effect of different glycerol concentrations on domestic cat spermatozoa. Theriogenology. 80:730-737. Arifiantini RI, Azizah. 2009. Kualitas semen beku kuda pada pengencer susu skim
dengan konsentrasi gliserol yang berbeda. Journal of Veterinary. 10 (02):63-70.
Battelier F, Vidament M, Fauquant J, Duchamp G, Arnaud G, Yvon JM. 2001. Advances in cooled semen technology. Animal Reproduction Science. 68:90-181.
Bessa AM, Rocha A, Aguirre AM. 2006. Comparing ethylene glycol with glycerol; for cryopreservation of canine semen in egg-yolk TRIS extenders. Theriogenology. 66:2047-2055.
Blesbois E, Grasseau I, Seigneurin F. 2005. Membrane fluidity and the ability of domestic bird spermatozoa to survive cryopreservation. Reproduction. 129:371-378.
Camara DR, Silva SV, Almeida FC. Nunes JF, Guerra MMP. 2011. Effects of antioxidants and duration of pre-freezing equilibration on frozen-thawed ram semen. Theriogenology. 76:342-350.
Castelo CS, Bezerra FSB, Souza ALP, Moreira MAP, Paula VV, Oliveira MF, Silva AR. 2010. Influence of the thawing rate on the cryopreservation of semen from collared peccaries (Tayassu tajacu) using Tris-based extenders. Theriogenology. 74:1060-065.
Cseh S, Faigl V, Amiridis GS. 2012. Semen processing and artificial insemination in health management of small ruminants. Animal Reproduction Science. 130:187-192.
Devismita D, Kumar K. 2015. Effect of cryoprotectant on optimal cooling rate during cryopreservation. Cryobiologi. 70:53-59.
El-Harairy MA, Eid NL, Zeidan AEB, El-Salam AMA, El-Kishk MAM. 2011. Quality and fertilityof the frozen-thawed bull semen as affected by the different cryoprotectants and glutathione levels. Journal of American Sains. 7(5):791-801.
Gao D, Mazur P, Critser JK. 1997. Fundamental Cryobiology of Mammalian Spermatozoan. San Diego: Academic Press.
12
Hammerstedt RH, Graham JK, Nolan JP. 1990. Cryopreservation of mammalian sperm: what we ask them to survive. Journal of Andrology. 11:73–88. Herdiawan I. 2004. Pengaruh laju penurunan suhu dan jenis pengencer terhadap
kualitas semen beku domba priangan. Jurnal Ilmu Ternak dan Veteriner. 9(2):98-107.
Herdis, Toelihere MR, Supriyatna I, Purwaritara B, Adikara RTS. 2003. Integritas dan daya hidup spermatozoa pada pembekuan semen domba garut (ovis arios) dengan pengenceran dasar tris dan susu skim kuning telur. Jurnal Sains dan Teknologi Indonesia. 2(3):62-68.
Hernandez PJE, Fernandez RF, Rodriguez SJL, Soto MYG, Verona JEH, Garcia RAD. 2012. Post-thaw acrosomal viability and reaction in sperm obtained from equine epididymis tail. Revista de Salud Animal. 34(2):84-88.
Holt WV. 2000. Basic aspects of frozen storage of semen. Animal Reproduction Science. 62:3-22.
Horvath A, Wayman WR, Urbanyi B, Ware KM, Dean JC, Tiersch TR. 2005. The relationship of the cryoprotectants methanol and dimethyl sulfoxide and hyperosmotic extenders on sperm cryopreservation of two North-American sturgeon species. Aquaculture. 247:243-251.
Ihsan MN. 2013. Pembekuan vitrifikasi semen kambing boer dengan tingkat gliserol berbeda. Jurnal Ternak Tropika. 2:38-45.
Kasai T, Ogawa K, Mizuno K, Nagai S, Uchida Y, Ohta S, Fujie M, Suzuki K, Hirata S, Hoshi K. 2002. Relationship between sperm mitochondrial membrane potential, sperm motility and fertility potential. Asian Journal of Andrology. 4:97-103.
Kasimanickan R, Kasimanickan V, Tibary A, Pelzer K. 2011. Effect of semen extenders on sperm parameters of ram semen during liquid storage 4 ˚C. Small Ruminant Research. 99:208-213.
Keeley T, Mcgreevy PD, O’Brien JK. 2012. Cryopreservation of epididymal
sperm collected postmortem in the Tasmanian devil (Sarcophilus harrisii). Theriogenology. 78:315-325.
Kikuchi K, Kashiwazaki N, Nagai T, Noguchi J, Shimada A, Takahashi R, Hirabayashi M, Shino M, Ueda M, Kaneko H. 1999. Reproduction in pigs using frozen-thawed spermatozoa from epididymis stores 4 ºC. Journal of Reproduction andDevelopment. 45:345-350.
Kimball JW. 1998. Biologi Jilid 1. Ed ke-5. Penerjemah Tjitrosomo SS, Sugiri N. Jakarta (Indonesia): Erlangga. Terjemahan dari Biology. hlm.86-115. Kulaksiz, R., Cebi C., Akcay E., Daskin A. 2010. The protective effect of egg
yolk from different avian species during the cryopreservation of Karyaka ram semen. Small Rumininant Research. 88: 12–15.
Martinenez HR. B Larsson, and H Pertoft. 1996. Evaluation of Sperm Damage and Techniques for Sperm Clean-up. Tecthniques for Gamate Manipulation and Storage, Hamilton New Zealand.
Medeiros CM, Forell F, Oliveira AT, Rodrigues JL. 2002. Current status of sperm
cryopreservation: why isn’t it better?. Theriogenology. 57:327-344.
Morris JG, Acton E, Murray BJ, Fonseca F. 2012. Freezing injury: The special case of the sperm cell. Cryobiologi. 64:71-80.
13 Naing SW, Wahid H, Azam MK, Rosnina Y, Zuki AB, Kazhal S, Bukar MM, Thein M, Kyaw T, San MM. 2010. Effect of sugarson characteristics of Boer goat semen after cryopreservation. Animal Reproduction Science. 122:23-28.
Nur Z, Zik B, Ustuner B, Tutuncu S, Sagirkaya H, Ozguden CG, Gunay U, Dogan I. 2011. Effect of freezing rate on acrosome and chromatin integrity in ram semen. Ankara Univ Vet Fak Derg 58:267-272.
Paalloan SML. 2013. Kualitas semen domba garut dengan pemberian pakan limbah tauge dan Indigofera sp. pada pengencer tris kuning telur [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Parks JE, Graham JK. 1992. Effect of cryopreservation procedures on sperm membranes. Theriogenology. 38:209-222.
Pérez-Llano B, Lorenzo JL, Yenes P, Trejo A, García-Casado P. 2001. A short hypo-osmotic swelling test for the prediction of boar sperm fertility. Theriogenology. 56:387-398.
Psenicka M, Dietrich GJ, Wojtczak M, Nynca J, Rodina, Linhart O, Cosson J, Ciereszko A. 2009. Acrosome staining and motility characteristics of starlet spermatozoa after cryopreservation with use of methanol and DMSO. Cryobiologi. 56:251-253.
Quan GB, Hong QH, Shao QY, Yang HY, Wu SS. 2012. The effect of trehalose and sucrose on frozen spermatozoa of Yunnan semi-finewool sheep during a non-mating season. Cryoletters. 33:307-317.
Rahman SKM, Strussmann CA, Suzuki T, Watanabe M. 2013. Electroporation enchances permeation ofcryoprotectant (dimethyl sulfoxide) into Japanese whiting (Sillago japonica) embryos. Theriogenology. 79:853-858.
Randhawa MA. 2006. The effect of dimethyl sulphoxide (on the growth) of dermatophytes. Japanese Medical Mycology. 47:313-318.
Rasul Z, Ahmed N, Anzar M. 2007. Antagonist effect of DMSO on the cryo-protection ability of glycerol during cryopreservation of buffalo sperm. Theriogenology. 68:813-819.
Santos RR. 2007. Cryopreservation of caprine ovarian tissue: recovery of gonadal function after auto transplantation [thesis]. Netherland: Utrecht University. Saragusty J, Hildebrant Thomas B, Behr B, Knieriem A, Kruse J, Hermes R. 2009.
Successful cryopreservation of Asia elephant (Elephas maximum) spermatozoa. Animal Reproduction Science. 115:255-266.
Songsasen N, Yu I, Murton S, Paccamonti DL, Ellts BE, Godke RA, Lelbo SP. 2002. Osmotic of sensitivity of canine spermatozoa. Cryobiologi. 44:79-90. Subowo. 1995. Biologi Sel. Bandung: Penerbit Angkasa.
14
Tasdemir U, Buyukleblebici S, Tuncer PB, Coskun E, Ozgurtas T, Aydin FN, Buyukleblebici O, Gurcan IS. 2013. Effects of various cryoprotectants on bull sperm quality, DNA integrity, and oxidative stress parameters. Cryobiologi. 66:38-42.
Vishwanath R. Shannon P. 2000. Storage of bovine semen in liquid frozen state. Animal Reproduction Science. 62:23-53.
Watson PF. 1997. The preservation of semen in mammals. In: Finn C,editor. Ox-ford reviews of reproductive biology. OxOx-ford: OxOx-ford University Press: 283-350.
Watson PF. 2000. The cause of reduced fertility with cryopreserved semen. Animal Reproduction Science. 60:481-492.
Widjajakusuma R, Supriatna I, Ekastuti DR, Nurdiani N. 2001. Efektivitas krioprotektan dan evaluasi kualitas spermatozoa hasil kriopreservasi sebagai kontribusi potensial preservasi genetika ayam hutan hijau yang ditangkarkan. Lembaga Penelitian IPB.
Zen Z, SGD Putih, Leswita. 2001. Pengaruh Sitrat Susu Kedelai Sebagai Pengencer Semen Terhadat Persentase Hidup. Abnormalitas dan Daya Tahan Hidup Spermatozoa Sapi Fresian Holstein. Media peternakan. 24:579-585.
15
RIWAYAT HIDUP
Penulis lahir di Semarang tanggal 19 Mei 1992. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara dari Bapak Tantowi dan Ibu Wulan Untarie, ST., MT. Penulis menempuh pendidikan sekolah dasar di SD Negeri Batursari 06, Demak tahun 1998-2004, sekolah menengah pertama di SMPN 9 Semarang 2004-2007 dan sekolah menengah atas di SMAN 5 Semarang dan lulus pada tahun 2010.
