IDENTIFIKASI GEN
badh
2 TERMUTASI PADA PADI BC4F1
MENTIK WANGI (CM) DAN BC5F1
CIHERANG-PANDAN WANGI (CP)
HELMY RAMADHAN AL ANSHARY
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Identifikasi Gen badh2 termutasi pada Padi BC4F1 Ciherang-Mentik Wangi (CM) dan BC5F1 Ciherang-Pandan Wangi (CP) adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Juni 2014
ABSTRAK
HELMY RAMADHAN AL ANSHARY. Identifikasi Gen badh2 termutasi pada Padi BC4F1 Ciherang-Mentik Wangi (CM) dan BC5F1 Ciherang-Pandan Wangi (CP). Dibimbing oleh DJAROT SASONGKO HS dan TRI JOKO SANTOSO.
Pengembangan varietas padi aromatik berbasis nontransgenik diperlukan untuk mendapatkan padi aromatik dengan potensi panen yang tinggi. Penelitian ini bertujuan mempelajari pemasukan gen aromatik dari padi aromatik ke padi nonaromatik melalui persilangan dan menyeleksi tanaman hasil persilangan menggunakan marka molekuler yang terkait gen aromatik. Pandan Wangi dan Mentik Wangi digunakan sebagai tetua donor aromatik sementara Ciherang sebagai tetua penerima. Pandan Wangi dan Mentik Wangi akan disilangkan dengan Ciherang untuk menghasilkan tanaman padi yang membawa gen aromatik. Marka aromatik berbasis PCR yang digunakan adalah primer Bradbury untuk mendeteksi gen aromatik pada persilangan Ciherang x Mentik Wangi dan primer RM223 untuk mendeteksi gen aromatik pada persilangan Ciherang x Pandan Wangi. Hasil penelitian menunjukkan telah diperoleh tanaman-tanaman generasi BC4F1 dan BC5F1 dari kedua kombinasi persilangan. Seleksi DNA menunjukkan gen aromatik telah ada pada tanaman hasil persilangan yang ditunjukkan oleh terbentuknya pita DNA heterozigot dengan ukuran 580, 355, dan 257 bp pada tanaman BC4F1 Ciherang x Mentik Wangi dan 140 dan 160 bp untuk BC5F1 Ciherang x Pandan Wangi.
Kata kunci ; badh2, Ciherang, Mentik Wangi, Pandan Wangi
ABSTRACT
HELMY RAMADHAN AL ANSHARY. Identification of badh2 Mutagenized Gens of BC4F1 Ciherang-Mentik Wangi (CM) and BC5F1 Ciherang-Pandan Wangi Plant Rices. Supervised by DAROT SASONGKO HS and TRI JOKO SANTOSO
Development of aromatic rice varieties based non-transgenic required to obtain an aromatic rice with a high potential. The objectives of this experiment were to study of introduction of aromatic trait from aromatic into nonaromatic rice through crossing and to screen the plants by using molecular markers linked to aromatic trait. Pandan Wangi and Mentik Wangi will be used as aromatic donor parents meanwhile Ciherang are as recurrent parents. Pandan Wangi and Mentik Wangi will be crossed with Ciherang to produce aromatic hybrids. PCR-based markers that will be used in this research i.e. Bradbury primer for detecting the aromatic trait in Ciherang x Mentik Wangi and RM223 primer for Ciherang x Pandan Wangi. Result of the research showed that BC4F1 and BC5F1 hybrid plants have been obtained from both of the crossing combination. Screening of the plants showed that the tested plants have been proved carrying the aromatic trait indicated by the formation of DNA band heterozygous with size 580, 355, and 257 bp for Ciherang x Mentik Wangi and 140 and 160 bp for Ciherang x Pandan Wangi.
IDENTIFIKASI GEN
badh
2 TERMUTASI PADA PADI BC4F1
MENTIK WANGI (CM) DAN BC5F1
CIHERANG-PANDAN WANGI (CP)
HELMY RAMADHAN AL ANSHARY
Skripsi
Sebagai Salah Satu Syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains di departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul Skripsi : Identifikasi Gen badh2 termutasi Pada Padi BC4F1 Mentik Wangi (CM) dan BC5F1 Ciherang-Pandan Wangi (CP)
Nama : Helmy Ramadhan Al Anshary NIM : G84070039
Disetujui oleh
Dr. Djarot Sasongko HS. MS. Dr. Tri Joko Santoso M.Si Pembimbing I Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc. Ketua Departemen Biokimia
PRAKATA
Puji syukur penulis haturkan pada Allah SWT dengan segala limpahan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul Identifikasi Gen BADH2 Termutasi Pada Padi BC4F1 Ciherang-Mentik Wangi (CM) dan BC5F1 Ciherang-Pandan Wangi (CP). Penelitian ini dilaksanakan pada bulan September 2011 sampai dengan bulan Januari 2012 di Laboratorium Biologi Molekular, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian, Cimanggu Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Djarot Sasongko HS MS. sebagai pembimbing dari Departemen Biokimia dan Dr. Tri Joko Santoso sebagai pembimbing dari Laboratorium Biologi Molekular Balai Besar Biogen Cimanggu Bogor yang telah bersedia untuk membimbing penulis baik dalam penelitian maupun penulisan. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada semua pihak balai yang turut memfasilitasi penelitian ini dan semua staf laboratorium yang memberikan bantuan teknis serta teman-teman yang telah memberikan dukungan moril.
Semoga hasil karya ilmiah ini dapat memberikan manfaat bagi penulis secara khusus dan perkembangan penelitian Indonesia secara umum.
Bogor, Juni 2014
DAFTAR ISI
Halaman
PRAKATA ... vi
DAFTAR ISI ... vii
DAFTAR GAMBAR ... viii
DAFTAR LAMPIRAN ... viii
PENDAHULUAN ... 1
Waktu dan Tempat Penelitian ... 2
Bahan ... 2
Alat ... 3
Prosedur Analisis Data ... 3
HASIL DAN PEMBAHASAN ... 5
Hasil ... 5
Pembahasan ... 7
SIMPULAN DAN SARAN ... 10
Simpulan ... 10
Saran ... 11
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1. Tahap pembentukan populasi padi ... 5
2. Elektroforesis hasil isolasi DNA daun padi ... 6
3. Contoh seleksi padi BC4F1 CM menggunakan primer Bradbury ... 6
4. Contoh seleksi BC5F1 CP menggunakan primer RM223 ... 7
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman 1. Metodologi penelitian ... 142. Isolasi DNA ( Shure et al. 1983 dan Doyle & Doyle 1987) ... 15
3. Hasil pengukuran konsentrasi DNA ... 16
4. Hasil seleksi BC4F1 CM ... 19
1
PENDAHULUAN
Pemuliaan tanaman merupakan suatu metode yang menggali potensi genetik suatu tanaman untuk memaksimumkan ekspresi dari potensi tersebut pada suatu kondisi lingkungan tertentu (Stoskopf et al. 1983). Pemuliaan tanaman padi yang banyak berkembang di Indonesia umumnya lebih terfokus untuk mengurangi resiko kegagalan panen dan meningkatkan kuantitas panen (Slamet & Loedin 2000). Aspek kualitas dalam pemuliaan tanaman padi belum tersentuh banyak. Sehingga penelitian yang dilakukan lebih mengarah pada kondisi produktivitas yang seharusnya mengarahkan juga pada aspek kualitatif. Karena tidak dapat dipungkiri bahwa rasa, tekstur dan aroma juga menjadi tolok ukur konsumtif beras oleh masyarakat. Oleh karena itu, padi aromatik adalah jawaban untuk masalah tersebut.
Padi aromatik lokal yang digunakan dalam penelitian ini adalah Mentik Wangi dan Pandan Wangi. Mentik Wangi merupakan padi varietas javanica dengan karakteristik berbiji bulat, daun berwarna hijau, dan tinggi tanamannya berkisar 95 hingga 115 sentimeter. Kelebihan dari padi Mentik Wangi yaitu memiliki aroma menyerupai pandan dan bertekstur pulen. Namun, padi ini memiliki tingkat produktivitas yang rendah dan tidak tahan terhadap hama (LITBANG 2006). Pandan Wangi merupakan varietas padi lokal aromatik yang telah terkenal sejak tahun 1973 di pasaran beras lokal maupun internasional. Pandan Wangi merupakan varietas javanica dengan ciri bulat, berbulu, tahan rontok, dan usia tanamnya mencapai 150 hingga 160 hari dan tingginya mencapai 150 sentimeter. Kelemahan padi pandan wangi adalah tingkat produktivitasnya rendah dan tidak tahan terhadap hama dan penyakit (LITBANG 2006). Ciherang merupakan kelompok padi varietas unggul hasil beberapa kali persilangan. Padi Ciherang mulai diresmikan oleh menteri pertanian pada tahun 2000 dengan anjuran cocok ditanam pada musim hujan dan kemarau dengan ketinggian di bawah 500 meter di bawah permukaan laut (Hermanto 2006).
Studi genetik awal yang dilakukan oleh Ahn et al. (1992) terhadap sebuah gen fgr (fragrance) yang mengendalikan sifat aroma pada varietas Della (padi aromatik turunan Jasmine) pada kromosom 8. Terdapat tiga kandidat gen dalam wilayah fgr yaitu gen yang menyandi protein betain aldehid dehidrogenase (BADH2), karbonat anhidrase (Cah), dan 3-metilkrotonil-KoA (Mccc2). Bradbury et al. (2005a) lebih mempersempit wilayah genom untuk sifat aroma dan mengidentifikasi satu gen resesif yang bertanggung jawab untuk sifat aroma pada verietas-varietas padi seperti Jasmine dan Basmati. Bradbury juga telah melakukan pengurutan gen di wilayah fgr dari 64 padi aromatik dan 14 padi aromatik varietas Thailand dan melaporkan bahwa gen yang menyandi protein BADH2 yang menjadi gen penyebab aroma karena memiliki delesi 8 basa.
Marka molekuler telah digunakan secara luas oleh para pemulia tanaman karena menyediakan informasi genetik yang sangat berguna pada tingkat molekuler (Roy et al. 2006). Marka molekuler telah digunakan untuk melacak keberadaan gen penyandi aroma diantaranya marka RM 223 dan marka Bradbury. Keduanya diperoleh melalui seleksi PCR ysng kemudian divisualisasi dengan elektroforesis berbasis gel.
2
nonaroma serta heterozigot dalam suatu populasi yang bersegregasi. Primer Bradbury terdiri atas dua buah primer eksternal dan dua buah primer internal. Primer internal terdiri atas internal fragrant antisense primer (IFAP) dan internal non-fragrant sense primer (INSP), sedangkan primer eksternal terdiri atas external sense primer (ESP) external antisense primer (EAP). Primer eksternal dirancang sebagai kontrol positif yang akan mengamplifikasi daerah di 580 bp pada padi aromatik dan nonaromatik.
Lang & Buu (2008) melaporkan primer RM 223 sebagai primer yang dapat membedakan pola pita dari padi aromatik dan nonaromatik berdasarkan ukuran DNA padi penyandi gen aromatik. Sebuah marka SSR (single sekuen repeat) yang berhasil mengamplifikasi lokus target sekaligus membedakan polimorfisme di antara tetua tanaman padi telah berhasil dilakukan oleh Lang & Buu untuk menyeleksi hasil persilangan antara padi varietas aromatik Thailand yaitu Jasmine 85 dengan nonaromatik C53. Sepasang primer RM 223 yang terdiri atas forward dan reverse digunakan dalam reaksi amplifikasi untuk membedakan padi aromatik Jasmine 85, nonaromatik C53, dan hasil persilangannya pada generasi BC2F2.
Penelitian dilakukan dengan tujuan menguji secara kualitatif terdapatnya gen badh2 yang menjadi indikator terbentuknya silangan padi non aromatik dengan padi aromatik. Identifikasi dilakukan terhadap varian-varian padi lokal dan nonlokal yang berkualitas dengan orientasi utama mendapatkan varian silang terbaik. Hipotesis penelitian ini adalah Gen badh2 termutasi dari Pandan Wangi dan Mentik Wangi dapat diintroduksikan ke varietas Ciherang yang dapat divisualisasikan melalui proses elektroforesis produk PCR. Diharapkan penelitian ini memberi manfaat secara langsung untuk meningkatkan kualitas padi lokal sehingga meningkatkan pendapatan petani.
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi Molekular, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian, Cimanggu Bogor. Penelitian dilakukan mulai bulan September 2011 sampai Januari 2012.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan adalah daun padi hasil persilangan BC4F1 CM (Ciherang dan Mentik Wangi) dan daun padi hasil persilangan BC5F1 CP (Ciherang dan Pandan Wangi), bufer ekstrak yang mengandung Tris-HCl (pH 8.0), etilendiamin tetraasetat (EDTA), natrium klorida (NaCl), setiltrimetil amonium bromida (CTAB), dan merkaptoetanol. Bahan lain yang digunakan untuk isolasi DNA adalah isopropanol, etanol 70%, dan bufer Tris-EDTA (TE) yang mengandung ribonuklease. Reaksi PCR menggunakan bufer PCR MgCl2,
dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), primer Bradbury (ESP, EAP, IFAP, dan INSP), primer Lang & Buu (RM 223), DNA, Taq polimerase (FastStart), dan ddH2O. Selain itu, bahan lain yang digunakan pada analisis elektroforesis adalah
3
Alat
Alat-alat yang digunakan adalah cawan Petri, bak plastik, ember, penyedot vakum, kertas minyak, klip, lampu listrik, dan gunting. Isolasi DNA menggunakan tabung mikro, mortar, satu set pipet mikro, tip pipet mikro, spin, sentrifus (Backman rotor 12), dan inkubator. Analisis PCR menggunakan mesin PCR PTC-100 (MJ Research, Inc) dan seperangkat alat elektroforesis yang terdiri atas tangki elektroforesis dan alat dokumentasi gel (chemidoc EQ gel system). Selain itu, spektrofotometer (SmartSpec TM Plus Spectrophotometer, Biorad) digunakan untuk kuantifikasi DNA.
Prosedur Analisis Data
Persilangan Balik BC4F1 CM dan BC5F1 CP (Soedyanto et.al 1978)
Materi yang digunakan adalah tetua pemulih Ciherang dan tanaman BC4F1 CM serta tanaman BC5F1 CP. Dilakukan penanaman butir padi dari masing-masing varietas dalam cawan petri hingga membentuk kecambah (selama 14 hari). Setelah itu, dipilih kecambah yang pertumbuhannya baik untuk dipindahkan ke bak pembenihan. Setelah berumur 2 minggu, tanaman dipindahkan ke ember dan dipelihara sampai berbunga.
Tanaman tetua ciherang dan BC4F1 CM serta BC5F1 CP yang waktu pembungaannya bersamaan digunakan untuk persilangan. Sebelum dilakukan persilangan terlebih dahulu dilakukan kastrasi pada bunga-bunga tanaman tetua. Bunga pada malai yang akan dikastrasi dijarangkan menjadi 15-50 bunga. Sepertiga bagian bunga dipotong miring menggunakan gunting kemudian benang sari diambil dengan alat penyedot vakum. Bunga yang telah bersih dari benang sari ditutup dengan kertas minyak agar tidak terserbuki oleh tepung sari yang tidak dikehendaki.
Penyerbukan tanaman padi dilakukan dengan menyalakan semua lampu di ruang persilangan untuk meningkatkan suhu hingga 32 °C sehingga dapat mempercepat pemasakan tepung sari. Setelah kepala sari membuka, bunga jantan diletakkan di atas bunga betina yang telah dikastrasi. Tanaman selanjutnya dipelihara sampai panen. Biji-biji yang telah masak dipanen dan dikeringkan dalam oven pada suhu 28 °C selama 2 malam untuk mengurangi kadar air. Biji padi F1 selanjutnya ditumbuhkan dalam cawan petri dan bak pembenihan.
Isolasi DNA Tanaman Padi Hasil Persilangan
Isolasi DNA dengan metode CTAB yang mengacu pada Shure et al. (1983) dan Doyle & Doyle (1987) dilakukan melalui tiga tahap yaitu preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA, dan pemekatan DNA. Preparasi ekstrak sel dimulai dengan penggerusan daun padi sebanyak 0.5 gram dalam mortar steril yang diberi bufer ekstraksi sebanyak 1000 µL (2 x 500µL). Hasil gerusan dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 mL, kemudian diinkubasi di dalam penangas air pada suhu
65 ˚C selama 15 menit.
4
µL ke dalam supernatan dan dicampur perlahan. Sampel disentrifugasi pada kecepatan 17724 g selama 5 menit. Pelet yang diperoleh dicuci dengan 500 µL etanol 70%. Campuran disentrifugasi kembali selama 2 menit pada kecepatan 17724 g. Pelet selanjutnya dikeringkan dalam oven selama 10 menit. Pelet yang telah kering dilarutkan dalam bufer TE yang mengandung ribonuklease sebanyak
50 µL dan diinkubasi pada suhu 37 ˚C selama 30 menit.
Kuantitas dan Kualitas DNA Tanaman Hasil Persilangan (Sambrook et.al. 1989)
Hasil isolasi DNA selanjutnya diukur konsentrasi dan kemurniannya. Konsentrasi dan kemurnian DNA dari masing-masing hasil isolasi diuji dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Kemurnian DNA ditetapkan berdasarkan nilai perbandingan A260/A280. Batas
kemurnian yang biasa dipakai dalam analisis molekuler pada rasio A260/A280
adalah 1.8-2.0 (Sambrook et al. 1989).
Total volume yang digunakan untuk pengukuran sebanyak 400 µL dengan faktor pengenceran sebesar 200 kali. Larutan blanko yang digunakan adalah ddH2O. Kualitas DNA diuji dengan elektroforesis untuk mengetahui ada atau
tidaknya DNA dari pita yang terbentuk. Konsentrasi DNA hasil isolasi dapat diketahui dengan menyertakan DNA lambda yang telah diketahui konsentrasinya. Konsentrasi DNA lambda yang digunakan adalah 20 ng/ µL dan 40 ng/ µL. Jumlah 2 µL DNA lambda sebanding dengan 10 ng/µL sampel DNA. Elektroforesis DNA hasil isolasi dilakukan pada gel agarosa 1%.
Marka Bradbury Melalui Seleksi PCR (Bradbury et.al. 2005b)
Hasil isolasi DNA tanaman BC4F1 CM yang telah disamakan konsentrasinya selanjutnya dilakukan tahap PCR. Campuran reaksi untuk PCR terdiri atas 2 µL bufer PCR 10x, 1.2 µL MgCl2, 50 mM, 0.4 µL dNTP mix 50 mM, 1 µL
masing-masing primer external sense primer (ESP), internal fragrant antisense primer (IFAP) , internal non-fragrant sense primer (INSP), dan external antisense primer (EAP), 0.16 µL Taq Polymerase, 2 µL DNA 50 ng/µ L, dan MQ H2O.
Kemudian digunakan program BADH2 pada mesin PCR. Reaksi amplifikasi dilakukan sebanyak 30 siklus yang terdiri atas denaturasi awal selama 5 menit pada suhu 94 ºC, denaturasi selama 30 detik pada suhu 94 ºC, penempelan primer selama 30 detik pada suhu 55 ºC, dan perpanjangan primer selama 45 menit pada suhu 72 ºC. Perpanjangan primer terakhir terjadi selama 7 menit pada suhu 72 ºC.
Marka RM223 Melalui Seleksi PCR (Lang & Buu 2008)
Hasil isolasi DNA tanaman BC5F1 CP yang telah disamakan konsentrasinya selanjutnya dilakukan tahap PCR. Campuran reaksi untuk PCR terdiri atas 2 µL bufer PCR 10x, 1.2 µL MgCl2, 50 mM, 0.4 µL dNTP mix 50 mM, 1 µL
masing-masing primer Rm223 0.8 µL (forward dan reverse), 0.16 µL Taq Polymerase, 2 µL 50 ng/µ L, dan MQ H2O. Kemudian digunakan program SSR RM223 pada
5
Elektroforesis Marka RM 223 dan Bradbury melalui seleksi PCR (Bradbury et.al. 2005b, Lang & Buu 2008)
Produk PCR DNA tanaman hasil persilangan perlu dilakukan elektroforesis untuk ukuran DNA hasil amplifikasi. Sebanyak 10 µL DNA Tahap selanjutnya dilakukan proses pewarnaan dengan larutan etidium bromida (10 mg/L) selama 5 menit, kemudian dibilas dengan air selama 10 menit. Gel agarosa selanjutnya ditampakkan dengan chemidoc gel system.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Hasil Persilangan BalikBC4F1 CM dan BC4F1 CP
Persilangan dilakukan dengan tahapan penanaman padi pada cawan petri (Gambar 1A) selama 14 hari disimpan ditempat terbuka. Padi yang sudah berkecambah dirawat sampai ukuran tinggi 10 cm dengan perakaran sudah stabil dan dipindahkan pada bak berisi media tanam yang kandungan haranya mencukupi (Gambar 1B). Dua minggu ditanam di bak kemudian dipindahkan kembali ke dalam ember untuk menjaga stabilistas pertumbuhan dan disimpan di rumah kaca (Gambar 1C). Penyilangan dilakukan dilakukan setelah padi dalam masa berbunga yaitu 63 hari untuk Mentik Wangi dan 84 hari untuk Pandan Wangi. Penyilangan dilakukan dengan tetua Ciherang (persilangan balik) (Gambar 1D).
Gambar 1 Tahap pembentukan populasi Padi. Padi ditanam di media cawan Petri, dipindahkan pada bak tanam (B), dipindahkan ke ember di dalam rumah kaca (C), setelah berbunga padi disilangkan (D).
Kuantitas dan Kualitas DNA (Sambrook et.al. 1989)
Hasil elektroforesis menunjukkan konsentrasi DNA terdapat pita smear pada semua sampel karena terdapatnya fragmen RNA. Konsentrasi DNA yang diperoleh dari hasil isolasi tidak seragam terletak pada rentang 1.53-2.10 untuk padi BC5F1 CP dan 1.53-2.00 untuk padi BC4F1 CM (lampiran 3). Oleh karena
A
B
6
itu, konsentrasi DNA yang sudah diperoleh diseragamkan dengan pengenceran menjadi 50 µg/ml. Hal tersebut dilakukan untuk menjamin bahwa jumlah DNA yang akan amplifikasi dengan PCR mempunyai konsentrasi yang sama.
Gambar 2 Elektroforesis Hasil isolasi DNA daun padi.
Marka Bradbury Melalui Seleksi PCR (Bradbury et.al. 2005b)
Sebanyak 24 sampel tanaman padi yang merupakan hasil persilangan antara padi Ciherang dan Mentik Wangi diuji dengan marka aromatik Bradbury. Hasil penelitian menunjukkan beberapa tanaman positif memiliki gen heterozigot badh2 (sampel 3, 5, 7 dan 8). Pola gen heterozigot ini terlihat dari pola pita hasil amplifikasi yang ditampakkan melalui elektroforesis gel agarosa. Pola gen heterozigot memiliki dua buah pita yang merupakan gabungan dari kedua tetua tanaman padi Ciherang dan padi Mentik Wangi (Gambar 4). Penggunaan primer Bradbury untuk seleksi hasil persilangan dari padi Ciherang dan Mentik Wangi menunjukkan padi Ciherang menghasilkan fragmen DNA ukuran 580 bp dan 355 bp, padi Mentik Wangi menghasilkan fragmen DNA ukuran 580 dan 355 bp, dan padi hasil persilangan Ciherang - Mentik Wangi menghasilkan fragmen DNA ukuran 580 bp, 355 bp, dan 257 bp. (M), sampel DNA (1-8). Tanda bintang (*) menunjukan positif.
7
Marka RM223 Melalui Seleksi PCR (Lang & Buu 2008)
Gambar menunjukan 1kb adalah marka gen yang digunakan, a sebagai air sebagai kontrol, p merupakan tetua padi Pandan Wangi , m merupakan tetua padi Mentik Wangi dan nomor 1 sampai 9 merupakan sampel. Sampel nomor 2 dan 5 menunjukan hasil positif karena mengandung pola gen heterozigot. Pola gen heterozigot ini terlihat dari pola pita hasil elektroforesis gel agarosa yang memiliki dua buah pita yang merupakan kombinasi dari kedua tetua padi Ciherang dan Pandan Wangi. Primer RM 223 dapat mengamplifikasi padi Ciherang dengan ukuran 160 bp, padi Pandan Wangi 140 bp, dan BC5F1 Ciherang-Pandan Wangi menghasilkan dua pita berukuran 140 bp dan 160 bp.
*
Gambar 3 Contoh seleksi BC5F1 PW menggunakan primer RM223. DNA Lambda (1kb), air sebagai kontrol negative (a), tetua Ciherang (P), tetua mentik wangi (m), sampel DNA (1-9). Tanda bintang (*) menunjukan positif.
Pembahasan
Persilangan Balik BC4F1 CM dan BC5F1 CP
Persilangan tanaman padi adalah penggabungan dua sifat padi berjenis berbeda melalui pertemuan tepung sari dengan kepala putik yang menghasilkan embrio dan kemudian embrio berkembang menjadi benih. Persilangan ditujukan untuk mendapatkan sifat genetik yang terbaik yang dibawa oleh seregasi genetik dari induk.
Tahap pembentukan populasi generasi BC4F1 CM dan BC5F1 CP yang diperoleh dari penelitian sebelumnya dimulai seleksi biji. Biji inilah yang selanjutnya dipelihara dalam beberapa tahap dan wadah atau media tertentu. Media pertama berupa cawan petri yang diisi oleh beberapa biji padi (gambar 1A). Media selanjutnya berupa bak yang dikondisikan berada ditempat terbuka dan teduh seperti terlihat di gambar 1B. Selanjutya media diganti dengan ember yang ditaruh di rumah kaca untuk menghindari gangguan luar berupa hama dan burung (gambar 1C). Persilangan dilakukan ketika masa pembungaan antara tetua jantan dan tetua betina sama, sehingga perlu dilakukan pengaturan dan penghitungan jarak waktu tanam agar kedua tetua dapat berbunga secara bersamaan. Pengaturan waktu pembungaan dapat dilakukan dengan menanam tetua nonaromatik (padi Ciherang) dalam selang waktu setiap satu minggu sebanyak lima kali. Persilangan antara padi ciherang dan Mentik Wangi memiliki masa berbunga 9 minggu atau 63 hari, sedangkan persilangan antara padi Ciherang dengan Pandan Wangi memiliki masa berbunga 12 minggu atau 84 hari.
8
Selain itu, persilangan membutuhkan ketelitian khusus terutama ketika dilakukan kastrasi, karena jika tidak bersih maka akan menyebabkan terjadinya penyerbukan sendiri pada bunga betina. Kastrasi adalah membuang bagian tanaman yang tidak diperlukan. Kastrasi dilakukan pada bunga betina dan dalam hal ini bagian yang tidak diperlukan adalah benang sari dan tepung sari. Setiap bunga terdapat enam benang sari dan dua kepala putik yang menyerupai rambut tidak boleh rusak. Kastrasi yang baik dilakukan sehari sebelum penyerbukan agar putik menjadi masak sempurna saat penyerbukan sehingga keberhasilan penyilangan lebih tinggi. Bunga yang telah dikastrasi sebaiknya ditutup dengan kertas minyak agar bunga tidak terserbuki oleh tepung sari dari bunga lain yang tidak dikehendaki (gambar 1D). Penyerbukan dilakukan dengan cara mengambil tepung sari dari bunga tanaman jantan yaitu bunga dari padi aromatik. Bunga tersebut diletakkan di atas bunga betina sambil digerak-gerakkan hingga tepung sari bunga jantan jatuh ke kepala putik bunga betina. Jarak waktu dari persilangan hingga terbentuknya biji terjadi selama lebih kurang 2 minggu.
Kuantitas dan Kualitas DNA (Sambrook et.al. 1989)
Hasil elektroforesis menunjukkan konsentrasi DNA sampel tidak dapat dibandingkan dengan DNA lambda karena terdapatnya pita smear pada semua sampel. Pita smear tersebut dapat disebabkan oleh terpotongnya fragmen DNA akibat pemipetan berulang ketika proses isolasi DNA sehingga dihasilkan pita-pita DNA yang tidak sama ukurannya. Konsentrasi DNA yang diperoleh dari hasil isolasi tidak seragam. Oleh karena itu, konsentrasi DNA yang sudah diperoleh diseragamkan dengan pengenceran menjadi 50 µg/ml. Hal tersebut dilakukan untuk menjamin bahwa jumlah DNA yang akan amplifikasi dengan PCR mempunyai konsentrasi yang sama.
Pola pita sampel hasil elektroforesis gel agarosa menunjukkan DNA sudah murni atau tidak terkontaminasi RNA, karena jika dalam sampel masih mengandung RNA akan dihasilkan pita di bawah atau ukurannya lebih kecil dari DNA sampel. Elektroforesis sampel menggunakan kontrol pembanding berupa DNA lambda yang sudah diketahui konsentrasinya. Konsentrasi DNA lambda ini digunakan untuk menghitung konsentrasi DNA sampel dengan cara membandingkan luas atau tebal pita hasil elektroforesis. Konsentrasi DNA lambda yang digunakan adalah 20 ng/µL dan 40 ng/µL (Gambar 2).
Uji kualitas DNA hasil isolasi diuji secara kuantitatif dan kualitatif. Uji kuantitatif menggunakan spektrofotometer melalui pengukuran konsentrasi sampel DNA pada panjang gelombang 260 nm dan kemurnian sampel pada perbandingan panjang gelombang 260/280 nm. Nilai kemurnian sampel yang baik menurut Sambrook et al. (1989) adalah 1.8-2.0. Adanya kontaminasi protein terlihat dari nilai kemurnian yang kurang dari 1.8, sedangkan nilai kemurnian sampel yang lebih dari 2.0 menunjukkan adanya kontaminasi RNA. Uji kualitatif DNA dapat dilakukan melalui elektroforesis gel agarosa. Uji kualitatif ini berupa gambaran untuk mengetahui ada atau tidaknya DNA serta untuk mengetahui ada atau tidaknya kontaminasi RNA dalam sampel.
9
membutuhkan waktu yang lama, serta tahapan metode yang relatif lebih mudah dan cepat. Bufer CTAB sangat baik digunakan untuk isolasi DNA tanaman karena memiliki kelebihan yaitu dapat mendegradasi senyawa-senyawa metabolit sekunder yang terdapat dalam tanaman. Selain itu, CTAB mampu memisahkan DNA dan RNA dari pengotor (karbohidrat dan protein). Hasil isolasi DNA ditampakkan pada gel agarosa 1%.
Marka Bradbury Melalui Seleksi PCR (Bradbury et.al. 2005b)
Sebanyak 24 sampel tanaman padi yang merupakan hasil persilangan antara padi Ciherang dan Mentik Wangi diuji dengan marka aromatik Bradbury. Hasil penelitian menunjukkan beberapa tanaman positif memiliki gen heterozigot badh2. Pola gen heterozigot ini terlihat dari pola pita hasil amplifikasi yang ditampakkan melalui elektroforesis gel agarosa. Pola gen heterozigot memiliki dua buah pita yang merupakan gabungan dari kedua tetua tanaman padi Ciherang dan padi Mentik Wangi (Gambar 4). Penggunaan primer Bradbury untuk seleksi hasil persilangan dari padi Ciherang dan Mentik Wangi menunjukkan padi Ciherang menghasilkan fragmen DNA ukuran 580 bp dan 355 bp, padi Mentik Wangi menghasilkan fragmen DNA ukuran 580 dan 355 bp, dan padi hasil persilangan Ciherang - Mentik Wangi menghasilkan fragmen DNA ukuran 580 bp, 355 bp, dan 257 bp. Hal ini mendukung pernyataan Bradbury et al. (2005a) dan penelitian sebelumnya dari Padmadi (2009).
Seleksi tanaman menggunakan marka molekuler berbasis PCR. Analisis PCR dalam penelitian ini menggunakan primer Bradbury. Penggunaan primer tersebut berdasarkan penelitian sebelumnya yang dilakukan Padmadi (2009). Hasil analisis PCR dengan primer tersebut ditampakkan dalam gel agarosa 1%. Berbeda dengan konsentrasi gel agarosa yang digunakan pada seleksi persilangan Ciherang-Pandan Wangi, konsentrasi yang digunakan untuk seleksi hasil persilangan Ciherang-Mentik Wangi lebih kecil. Pemilihan konsentrasi gel agarosa tersebut berdasarkan ukuran produk PCR yang dihasilkan. Menurut Sambrook et al. (1989) konsentrasi 1% digunakan untuk ukuran fragmen DNA 250 bp – 12 kbp.
Marka aromatik dari primer Bradbury mampu mengamplifikasi padi aromatik dengan ukuran 580 bp dan 257 bp, sedangkan untuk padi nonaromatik menghasilkan ukuran 580 bp dan 355 bp. Keuntungan dari penggunaan primer ini adalah mampu membedakan pola gen homozigot resesif (pada varietas aromatik), homozigot dominan (pada varietas nonaromatik), dan heterozigot (pada hasil persilangan). Berdasarkan penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Padmadi (2009) primer Bradbury tidak sepenuhnya dapat membedakan padi aromatik dan nonaromatik pada beberapa varietas lokal Indonesia. Varietas padi aromatik yang mempunyai pola pita DNA yang berbeda dengan padi varietas nonaromatik adalah Mentik Wangi dan Gunung Perak. Hal tersebut kemungkinan disebabkan oleh perbedaan delesi pada kromosom 4. Selain itu, penggunaan primer RM 223 tidak mampu membedakan antara padi Pandan Wangi dengan padi nonaromatik lainnya. Oleh karena itu, primer ini digunakan dalam menyeleksi padi Ciherang-Mentik Wangi.
10
memiliki kegunaan untuk bidang pertanian. Uji dengan metode yang sederhana untuk skrining padi dan penentuan aroma di antara berbagai macam jenis padi dan segregasi populasi, memiliki kelebihan yaitu sederhana, murah, dan cepat (Badbury et al. 2005b).
Marka RM223 Melalui Seleksi PCR (Lang & Buu 2008)
Sebanyak 72 sampel tanaman padi yang merupakan tanaman hasil persilangan antara padi generasi BC5F1 CP diseleksi dengan menggunakan marka aromatik RM 223. Sebagian besar tanaman positif memiliki gen heterozigot badh2. Pola gen heterozigot ini terlihat dari pola pita hasil elektroforesis gel agarosa yang memiliki dua buah pita yang merupakan kombinasi dari kedua tetua padi Ciherang dan Pandan Wangi. Primer RM 223 dapat mengamplifikasi padi Ciherang dengan ukuran 160 bp, padi Pandan Wangi 140 bp, dan BC5F1 Ciherang-Pandan Wangi menghasilkan dua pita berukuran 140 bp dan 160 bp (gambar 3).
Tidak semua organisme tanaman menghasilkan DNA heterozigot sehingga perlu dilakukan seleksi. Seleksi tanaman tidak dapat diuji secara langsung melalui uji aroma biasa untuk melihat apakah gen badh2 dari tanaman aromatik telah bergabung dengan alel gen padi nonaromatik. Oleh karena itu, digunakan marka molekuler berbasis PCR. Analisis PCR dalam penelitian ini menggunakan primer berdasarkan penelitian yang telah dilakukan sebelumnya oleh Padmadi (2009).
Berdasarkan penelitian sebelumnya oleh Padmadi (2009) yang menyatakan bahwa pola amplifikasi padi aromatik Pandan Wangi dan padi nonaromatik Ciherang dengan menggunakan primer Bradbury tidak dapat dibedakan satu sama lainnya. Namun, ketika digunakan primer RM 223 baik Pandan Wangi maupun Ciherang dapat dibedakan dengan ukuran pita yang berbeda akibat adanya polimorfisme pada kromosom nomor 3. Oleh karena itu, primer RM 223 dalam penelitian ini digunakan untuk menyeleksi padi padi Ciherang dan Pandan Wangi. Hasil PCR ditampakkan dengan menggunakan gel agarosa 3%. Penggunaan konsentrasi tersebut berdasarkan perbedaan basa yang sangat kecil dari setiap sampel yaitu berbeda 20 basa dan tidak akan terlihat berbeda jika digunakan konsentrasi gel agarosa di bawah 3%.
Penggunaan primer RM 223 mampu mengamplifikasi padi varietas aromatik dan nonaromatik dengan variasi panjang fragmen DNA antara 120 bp-160 bp (Lang & Buu 2008). Penelitian sebelumnya (Padmadi 2009) juga telah membuktikan primer RM 223 mampu membedakan padi aromatik dan nonaromatik untuk beberapa varietas lokal Indonesia. Hasil penelitian diperoleh ukuran produk amplifikasi dari padi Ciherang lebih besar daripada Pandan Wangi disebabkan oleh adanya delesi basa pada padi Pandan Wangi. Selain itu, pola amplifikasi pada tanaman hasil persilangan padi Ciherang-Pandan Wangi yang menunjukkan sifat heterozigot. Hal ini mendukung pernyataan dan penelitian sebelumnya dari Lang & Buu (2008) dan Padmadi (2009).
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
11
aromatik Pandan Wangi dan Mentik Wangi) pada tanaman hasil persilangan terdeteksi dengan marka aromatik PCR. Primer Bradbury dapat digunakan untuk menyeleksi turunan dari hasil persilangan antara padi Ciherang dengan Mentik Wangi menghasilkan fragmen DNA ukuran 580 bp, 355 bp, dan 257 bp. . Primer RM 223 dapat digunakan untuk seleksi turunan hasil persilangan padi Ciherang dan Pandan Wangi menghasilkan fragmen DNA ukuran 140 bp dan 160 bp.
Saran
Kajian lain seperti pengurutan DNA untuk padi aromatik dan nonaromatik varietas asli Indonesia perlu dilakukan sehingga dapat menentukan primer spesifik untuk membedakan padi aromatik dan nonaromatik.
DAFTAR PUSTAKA
Ahn SN, Bollisch CN, Tanksley SD. 1992. RFLP tagging of a gene for aroma in rice. Theor Appl Genet 84:825–828.
Bradbury LMT, Fitgerald TL, Henry RJ, Jin Q, Waters DLE. 2005a. The gene for fragrance in rice. J Plant Biotech 3:363–370.
Bradbury LMT, Henry RJ, Jin Q, Reinke RF, Waters DLE. 2005b. A perfect marker for fragrance genotyping in rice. J Mol Breed 16:279–283.
Doyle JJ, Doyle JL. 1987. A rapid DNA isolation from small amount of fresh leaf tissue. J Phytochem Bull 19:11-15.
Hermanto. 2006. Padi Ciherang makin populer. Warta Penelitian dan Pengembangan Pertanian 28:14-15. Kibria et al. 2008. Screening of aromatic rice lines by phenotypic and molecular markers. J Bot 37:141-147.
Lang NT, Buu BC. 2008. Development of PCR based markers for aroma (fgr) gene in rice (Oryza sativa L.). J Omonrice 16:16-23.
[LITBANG] Balai Penelitian Bahan Pangan. 2006. Mengenal padi VUTB Fatmawati. http://jakarta.litbang.deptan.go.id/klinikagribisnis. J Litbang 12:1-6.
Padmadi B. 2009. Identifikasi sifat aroma tanaman padi menggunakan marka berbasis gen aromatik [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Roy et al. 2006. Association analysis of agonomically important traits using SSR, SAMPL, and AFLP markers in bread wheat. Current Science 90:683-689.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning 3rd edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Pr.
12
Slamet, Loedin IH. 2000. Tanaman transgenik: Perspekstif dan tantangan di masa mendatang bagi Indonesia. Warta Biotek LIPI 1-3 [terhubung berkala].
http://indonesiaindonesia.com/warta [2 November 2000].
Soedyanto et al. 1978. Bercocok Tanam Jilid II. Jakarta: CV Yasaguna.
13
14
Lampiran 1 Diagram Alir Penelitian
Benih BC4F1 Ciherang/Mentik
Wangi dan Benih BC5F1
Ciherang/Pandan Wangi
dikecambahkan di dalam cawan
petri (1-2 minggu)
Benih dipindahkan dalam media
bak (1-2 minggu)
Benih dipindahkan dalam media
ember (3-4 minggu)
Isolasi DNA
Spektrofotmetri sampel hasil
isolasi DNA
Identifikasi menggunakan
elektroforesis
Analisis PCR dengan
menggunakan marka Bradbury
15
Lampiran 2 Isolasi DNA ( Shure et al. 1983 dan Doyle & Doyle 1987)
Daun padi
Bufer CTAB 1000 µL (2 x 500 µL)
Tabung mikro 2 mL
diinkubasi 65 ˚C selama 15 menit
(tiap 5 menit dibolak-balik)
12000 rpm selama 5 menit
Supernatan
+ 70 µL natrium asetat 3M + 600 µL isopropanol dingin + 100 µL natrium asetat 3M
+ 1000 µL kloroform isoamilalkohol
12000 rpm selama 5 menit
Pelet DNA
pencucian dengan etanol 200 µL 70 %
pengeringan dengan oven selama 10 menit
pelarutan kembali dalam 50 µl TE buffer + RNase
16
Lampiran 3 Hasil Pengukuran Konsentrasi DNA
19
Lampiran 4 Hasil Seleksi BC4F1 CM
M A C M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
M A C M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
M A C M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Keterangan Gambar: Marker (M)
20
21
Keterangan Gambar: Marker (M)
22
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Garut, Jawa Barat pada tanggal 19 April 1989 dari ayahanda Jajang S. Murod dan ibunda Melawati. Penulis merupakan anak ke dua dari tiga bersaudara. Tahun 2007 penulis lulus dari SMU Negeri 1 Garut dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) pada Program Studi Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA).
