Apakah Minyak Atsiri itu?
Minyak atsiri merupakan minyak dari tanaman yang komponennya secara umum mudah menguap sehingga banyak yang menyebut minyak terbang. Minyak atsiri disebut juga etherial oil atau minyak eteris karena bersifat sepeti eter. Dalam bahasa internasional biasa disebut essential oil (minyak essen) karena bersifat khas sebagai pemberi aroma/bau (esen). Definisi ini dimaksudkan untuk membedakan minyak lemak dengan minyak atsiri yang berbeda tanaman penghasilnya.
Sifat minyak atsiri sendiri antara lain : 1. Dapat didestilasi.
2. Tidak meninggalkan noda. 3. Tidak tersabunkan.
4. Tidak tengik.
5. Tidak mengandung asam.
Itulah sifat yang membedakan minyak atsiri dengan minyak lemak.
Dalam tanaman, keberadaan minyak atsiri bisa di berbagai tempat antara lain : Dalam rambut kelenjar seperti Labiatae, misal: kumis kucing, mentha. Di dalam sel-sel parenkim seperti Piperaceae, misal: merica
Pada tabung minyak seperti Umbelliferae, misal: adas.
Sedang cara pembentukan minyak atsiri dalam tanaman antara lain langsung dari protoplasma, dekomposisi dari resin ataupun dengan cara hidrolisis dari glikosida tertentu.
Bila minyak atsiri baru saja didestilasi, umumnya tidak berwarna atau berwarna pucat. Penyimpanan dalam jangka waktu lama yang tidak terkontrol dapat menyebabkan minyak menjadi berwarna, mulai dari kuning tua hingga coklat. Untuk menghindari kerusakan seperti itu dapat diatasi dengan perlakuan seperti :
- Disimpan pada wadah tertutup rapat. - Terlindung dari cahaya.
- Di tempat yang kering. - Di tempat yang sejuk.
- Disimpan penuh dalam wadah.
Pada bagian tanaman, minyak atsiri terkandung dominan misalnya : Di tumbuhan Rosa sinensis, pada petala bunga.
Cinamomum, pada korteks dan daun. Foeniculi vulgare, pada perikap buah. Labiatae, pada rambut kelenjar. Citrus, pada kulit buah.
Bagi tanaman penghasil minyak, minyak atsiri berfungsi sebagai insect repellant (mengusir serangga/parasit lain) dan insect attractant (menarik). Dalam beberapa hipotesis dapat disimpulkan bahwa tumbuhan akan memproduksi minyak atsiri secara maksimal jika kondisi tumbuh dalam keadaan susah, misalnya akar tanaman sulit mendapat air, struktur tanah berkapur atau jarang nutrisi makanan, dan sebagainya. Kondisi semacam itu membuat tanaman berusaha untuk memproduksi minyak atsiri agar tetap toksik terhadap serangan serangga maupun parasit lain.
Sebagian besar minyak atsiri mempunyai sifat fisika kimia sebagai berikut : 1. Bau khas.
2. Tidak larut dalam pelarut air, larut dalam eter, kloroform, dan pelarut organik lain. 3. Sebagian komponen kandungan minyak mudah menguap.
4. Yang mengandung fenol dapat membentuk garam 5. Dapat membentuk kristal.
cineol, borneol, limonen, alfa-terpinilasetat dan alfa terpinen. Jika diuraikan, cineol berbau sedap tapi pedas seperti minyak kayu putih. Borneol berbau kamper seperti kapur barus, limonen harum seperti jeruk keprok, alfa-terpinilasetat berbau jeruk purut, sedang alfa terpinen berbau jeruk citrun. Nah, campuran dari kelima komponen itulah yang membuat aroma khas kapulaga.
Dari semua jenis minyak atsiri sebenarnya tersusun dari jalur biosintesis metabolit sekunder :
Asetat- mevalonat untuk golongan terpenoid. Jalur sikimat-fenil propan untuk golongan aromatik. Contoh kerangka minyak atsiri :
Cara penyarian minyak atsiri ada beberapa metode tergantung dari jenis dan sifat dari bahan baku dan minyak atsirinya. Beberapa metode umum yang biasa digunakan antara lain :
1. Destilasi (air, uap dan air-uap) 2. Pengepresan
3. Ekstraksi 4. Enfleurasi
5. Hidrolisis glikosida tertentu.
Pengertian HPLC
1. JENIS- JENIS HPLC
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua
pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik.
Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
1. Kromatografi Adsorbsi
dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.
2. Kromatografi fase terikat
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik. Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini
menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.
3. Kromatografi penukar ion
KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran,
meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.
4. Kromatografi Pasangan ion
5. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat
digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton.
Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.
6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.
2. Beberapa kegunaan dari HPLC :
HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan
pestisida.
Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat
dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang
dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.
Dapat memisahkan vitamin- vitamin yang larut dalam air.
Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah
biokimia.
Dapat digunakan untuk memurnikan dan mengidentifikasi suatu senyawa.
3. Aplikasi dalam ilmiah
Perkembangan yang baru-baru ini HPLC telah menjadi pengembangan metode HPLC denaturing (DHPLC). This procedure can separate double-stranded DNA molecules that differ by as little as one . Prosedur ini dapat memisahkan molekul DNA untai-ganda yang berbeda sekecil satu pasangan basa .The speed of analysis (approximately 5 minutes per sample) and the size of DNA fragment that can be analyzed (up to 2.0 kilobytes) has made it a preferred method for a variety of applications in the field of molecular biology. Kecepatan analisis (sekitar 5 menit per sampel) dan ukuran fragmen DNA yang dapat dianalisis (hingga 2,0 kilobyte) telah membuatnya menjadi metode yang disukai untuk berbagai aplikasi dalam bidang biologi molekuler.Applications of DHPLC include the detection of single nucleotide (SNPs). Aplikasi DHPLC termasuk deteksi tunggal nukleotida polimorfisme (SNP). These are single base-pair variations in DNA that can give valuable information on genetic variation within a population. Ini adalah satu dasar pasangan variasi dalam DNA yang dapat memberikan informasi berharga tentang variasi genetik dalam suatu populasi, They can also help to identify the genes that cause certain human diseases.dan juga dapat membantu untuk mengidentifikasi gen yang menyebabkan penyakit manusia tertentu. Dan aplikasi lain dari kromatrogarafi HPLC adalah dalam dunia farmasi digunakan untuk menganalisis.
Contoh analisis menggunakan kromatrografi HPLC:
Analisis Diazepam dalam darah
Diazepam (Valium) merupakan Senyawa golongan psikotropika. Senyawa ini berbentuk kristal agak kekuningan yang tidak larut dalam air, rumus kimiaC23H27N.
Mempunyai Indikasi untuk status epileptikus, ansietas atau insomnia, konvulsi akibat keracunan, kejang demam, dan sebagai obat penenang. Prinsip cara uji diazepam ini adalah dengan mengekstraksi menggunakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Kemudian sampel yang sudah melalui proses preparasi selanjutnya diinjeksikan ke sistem HPLC.
1. Kelebihan dan Kekurangan Dalam Penggunaan HPLC
Dengan adanya HPLC tentunya sangat membantu dalam proses kromatografi. Berikut merupakan kelebihan dari alat HPLC antara lain:
Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya memisah
yang tinggi.
Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis.
Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi.
Kolom dapat digunakan kembali.
Waktu analisa cukup singkat.
HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang
Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya.
Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.
Kelemahan dari alat HPLC antara lain:
Harga sebuah alat HPLC cukup mahal.
Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor.
Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan ukuran 5 dan 3
mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus seringkali dicuci dan kemurnian larutan harus dijaga.
2. Prinsip kerja
Pada dasarnya prinsip kerja HPLC sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom, yang membedakan adalah fasa diam yang digunakan pada HPLC memiliki ukuran yang lebih kecil sehingga luas permukaan besar sehingga keseimbangan antar fasa menjadi lebih baik dan efisien.
Injeksi sampel
Injeksi sample seluruhnya dilakukan secara otomatis sehingga tidak bisa
mengetahui yang terjadi pada keadaan tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas.
Waktu retensi
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut sebagai waktu retensi.Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.
Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda pula. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:
tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)
kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada
ukuran partikel)
komposisi yang tepat dari pelarut
temperatur pada kolom
Detektor
Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu
Interpretasi output dari detektor
Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan
menerap sinar UV. Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom,dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh.
Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer.Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).
1. Perawatan HPLC
Berikut beberapa cara perawatan HPLC agar tetap dapat digunakan secara efisien.
Stabilitas pH
kolom HPLC yang stabil dalam rentang pH 2 sampai 8. Jika mengukur nilai pH, pengukuran harus dilakukan dalam media air sebelum mencampur eluen dengan pelarut organik. HPLC kolom dapat digunakan di luar rentang pH. Ikatan kimia baru yang memungkinkan penggunaan sampai pH 1 untuk beberapa fasa diam. Fase stasioner didasarkan pada silika gel ultra murni juga dapat digunakan pada rentang pH yang lebih tinggi, sampai untuk pH 11, tergantung pada sifat kimia pengubah yang digunakan dalam fase gerak. Basis Besar (seperti Pyrolidine) tidak mampu menyerang permukaan silika dan oleh karena itu dapat digunakan pada pH lebih tinggi.
Teknik Stabilitas
Fase stasioner didasarkan pada silika secara mekanik sangat stabil, dikemas dalam kolom yang menunjukkan tidak ada batas tekanan, dan dapat digunakan di lebih dari 40 MPa (6000 psi) tanpa masalah. Tekanan menyebabkan guncangan penyaluran dalam kolom, yang menghasilkan puncak membelah pada kromatogram
Eluen
Penggunaan pelarut murni non HPLC menyebabkan adsorpsi ireversibel dari kotoran pada kolom. Kotoran ini memblokir situs adsorpsi, mengubah selektivitas kolom dan mengarah ke puncak memisahkan di kromatogram tersebut.
Penyimpanan Kolom
Untuk penyimpanan jangka pendek, kolom dapat disimpan dalam eluen yang
Untuk penyimpanan jangka menengah, yaitu 2 hari atau selama akhir pekan, kolom
harus dibilas dengan air yang murni untuk mencegah pertumbuhan mikroba.
Untuk penyimpanan jangka panjang, silika kolom tersebut harus dapat disimpan
dalam pelarut aprotik. Kandungan air tidak boleh lebih tinggi dari 50%. Yang terbaik adalah pelarut Asetonitril.
ANALISIS HPLC
HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Prinsip dasar dari HPLC adalah memisahkan setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Sebetulnya hanya ada dua hal utama yang menjadi krusial point dalam metode HPLC. Yang pertama adalah proses separasi/pemisahan dan yang kedua adalah proses identifikasi. Dua hal ini mejadi faktor yang sangat penting dalam keberhasilan proses analisa.
Aplikasi analisis HPLC adalah untuk penentuan kualitatif dan penentuan kuantitatif.
Penentuan Kualitatif
HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar.
Penentuan Kuantitatif
Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah:
oParameter percobaan sama antara standar dan sampel
oPenentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan menggunakan larutan
standar seri pada waktu retensi tertentu.
-Berdasarkan area kromatogram
-Berdasarkan tinggi puncak kromatogram
Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample.
Contoh kromatogram dengan banyak peak
Kesulitan biasanya dihadapi ketika akan mengidentifikasi suatu kromatogram yang terdiri atas banyak peak. Untuk mengetahui peak mana yang merupakan milik analat (zat target analisa) kromatogram dibandingkan dengan kromatogram standard. Cara yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention time (RT). Peak yang mempunyai RT yang sama dengan standard umumnya akan langsung di vonis sebagai peak milik analat. Memang senyawa/zat yang sama akan mempunyai RT yang juga sama, dengan catatan sample dan standard dijalankan dengan kondisi dan sistem HPLC yang sama. Namun bukan berarti RT yang sama pasti merupakan zat/senyawa yang sama. Disinilah para analis biasanya terkecoh.
Jadi, melihat RT sebetulnya belumlah cukup untuk mengidentifikasi suatu zat. Hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D yang juga sama. Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama.
Beberapa parameter penting yang perlu diperhatikan di dalam analisis HPLC adalah :
A. Kolom
Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm. Kolom yang biasa digunakan untuk analisa adalah bentuk kolom fase balik. Kolom diisi dengan partikel silika yang dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol.
larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut.
Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom.Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom.
Ada kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18 yang dapat digunakan untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya. Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrat (Agilent) yang khusus digunakan untuk analisa karbohidrat (mono-, di-, polysakarida). Keberhasilan proses separasi sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.
B. Komposisi Eluen
Komposisi eluen meliputi jenis dan perbandingan eluen yang digunakan. Ada 2 macam eluen, yakni pelarut nonpolar untuk fase normal, seperti heksan, dan pelarut polar untuk fase balik, seperti campuran air dan alkohol, yakni metanol.
C. Volume Injeksi
Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau manual melalui injeksi. Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel loop dengan variabel volume (misalnya 20 – 500 μL). Injeksi sampel dapat dilakukan melalui manual (menggunakan jarum suntik), step-flow injection, dan sampling value.
Detektor merupakan suatu bagian integral dari sebuah peralatan analitik kromatografi cair yang modern. HPLC mempunyai keunggulan dibanding kromatografi lain, yaitu mempunyai banyak pilihan detektor yang dapat digunakan.
Secara garis besar , detektor dalam HPLC dapat dikelompokan :
oBerdasarkan pengukuran diferensial suatu sifat yang dimiliki baik oleh molekul sampel
maupun fase gerak (bulk property detector).Detektor dapat dibedakan menjadi :
• Detektor Indeks Bias
Detektor indeks bias merupakan detektor yang juga luas penggunaannya setelah detektor ultraviolet. Dasarnya ialah pengukuran perbedaan indeks bias fase gerak murni dengan indeks bias fase gerak yang berisi komponen sampel, sehingga dapat dianggap sebagai detektor yang universal pada HPLC. Detektor ini kurang sensitif dibanding dengan detektor ultraviolet dan sangat peka terhadap perubahan suhu.
• Detektor konduktivitas
• Detektor tetapan dielektrika
o Berdasar pengukuran suatu sifat yang spesifik dari molekul sampel (disebut solute
property detector).Jenis yang kedua ini dibedakan lagi menjadi :
1)Tidak memerlukan adanya pemisahan fase gerak,
• Detektor-detektor fotometer (uv-vis dan inframerah)
dapat dipilih disesuaikan dengan jenis cuplikan yang diukur. Walaupun demikian, biasanya panjang gelombang UV yang digunakan adalah pada 254 nm karena kebanyakan senyawa organic menyerap sinar UV pada sekitar panjang gelombang tersebut.
Detektor fotometer inframerah juga dapat digunakan pada HPLC. Dengan detektor ini dapat dibuat pola spektrum infra merah dari komponen sampel sehingga gugus-gugus fungsionalnya dapat diketahui.
• Detektor Polarografi dan radioaktif;
Kedua detector ini dipengaruhi oleh variasi laju aliran..
E. Chart Speed
Diagram kecepatan dapat diketahui bila sampel diinjeksikan secara manual.
2.2APLIKASI HPLC
Beberapa aplikasi HPLC dalam kehidupan :
1)HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.
2)Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan
dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
3) Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan
dengan kolom butiran berlapis zat berpori.
5)Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air.
ANALISIS HPLC
HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Prinsip dasar dari HPLC adalah memisahkan setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Sebetulnya hanya ada dua hal utama yang menjadi krusial point dalam metode HPLC. Yang pertama adalah proses separasi/pemisahan dan yang kedua adalah proses identifikasi. Dua hal ini mejadi faktor yang sangat penting dalam keberhasilan proses analisa.
Aplikasi analisis HPLC adalah untuk penentuan kualitatif dan penentuan kuantitatif.
Penentuan Kualitatif
HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar.
Penentuan Kuantitatif
Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah:
oParameter percobaan sama antara standar dan sampel
oPenentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama
oPenentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan menggunakan larutan
standar seri pada waktu retensi tertentu.
-Berdasarkan tinggi puncak kromatogram
Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample.
Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi biasanya jauh lebih mudah karena sedikit mengandung komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja.
Contoh kromatogram dengan banyak peak
kromatogram dibandingkan dengan kromatogram standard. Cara yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention time (RT). Peak yang mempunyai RT yang sama dengan standard umumnya akan langsung di vonis sebagai peak milik analat. Memang senyawa/zat yang sama akan mempunyai RT yang juga sama, dengan catatan sample dan standard dijalankan dengan kondisi dan sistem HPLC yang sama. Namun bukan berarti RT yang sama pasti merupakan zat/senyawa yang sama. Disinilah para analis biasanya terkecoh.
Jadi, melihat RT sebetulnya belumlah cukup untuk mengidentifikasi suatu zat. Hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D yang juga sama. Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama.
Beberapa parameter penting yang perlu diperhatikan di dalam analisis HPLC adalah :
A. Kolom
Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm. Kolom yang biasa digunakan untuk analisa adalah bentuk kolom fase balik. Kolom diisi dengan partikel silika yang dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol.
Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut.
Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom.Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom.
Ada kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18 yang dapat digunakan untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya. Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrat (Agilent) yang khusus digunakan untuk analisa karbohidrat (mono-, di-, polysakarida). Keberhasilan proses separasi sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.
B. Komposisi Eluen
Komposisi eluen meliputi jenis dan perbandingan eluen yang digunakan. Ada 2 macam eluen, yakni pelarut nonpolar untuk fase normal, seperti heksan, dan pelarut polar untuk fase balik, seperti campuran air dan alkohol, yakni metanol.
C. Volume Injeksi
Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau manual melalui injeksi. Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel loop dengan variabel volume (misalnya 20 – 500 μL). Injeksi sampel dapat dilakukan melalui manual (menggunakan jarum suntik), step-flow injection, dan sampling value.
D. Detektor
Detektor merupakan suatu bagian integral dari sebuah peralatan analitik kromatografi cair yang modern. HPLC mempunyai keunggulan dibanding kromatografi lain, yaitu mempunyai banyak pilihan detektor yang dapat digunakan.
Secara garis besar , detektor dalam HPLC dapat dikelompokan :
oBerdasarkan pengukuran diferensial suatu sifat yang dimiliki baik oleh molekul sampel
• Detektor Indeks Bias
Detektor indeks bias merupakan detektor yang juga luas penggunaannya setelah detektor ultraviolet. Dasarnya ialah pengukuran perbedaan indeks bias fase gerak murni dengan indeks bias fase gerak yang berisi komponen sampel, sehingga dapat dianggap sebagai detektor yang universal pada HPLC. Detektor ini kurang sensitif dibanding dengan detektor ultraviolet dan sangat peka terhadap perubahan suhu.
• Detektor konduktivitas
• Detektor tetapan dielektrika
o Berdasar pengukuran suatu sifat yang spesifik dari molekul sampel (disebut solute
property detector).Jenis yang kedua ini dibedakan lagi menjadi :
1)Tidak memerlukan adanya pemisahan fase gerak,
• Detektor-detektor fotometer (uv-vis dan inframerah)
Pada detektor ultraviolet/visibel, deteksi komponen sample didasarkan pada absorpsi sinar ultraviolet (untuk detektor ultraviolet) dan sinar tampak (untuk detektor visibel). Detektor ultraviolet merupakan detektor yang paling luas digunakan karena sensitivitas dan reprodusibelitasnya yang tinggi serta mudah operasinya. Detektor UV terutama digunakan untuk pendeteksian senyawa-senyawa organic. Detektor UV dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang sehingga panjang gelombang UV yang digunakan dapat dipilih disesuaikan dengan jenis cuplikan yang diukur. Walaupun demikian, biasanya panjang gelombang UV yang digunakan adalah pada 254 nm karena kebanyakan senyawa organic menyerap sinar UV pada sekitar panjang gelombang tersebut.
• Detektor Polarografi dan radioaktif;
Kedua detector ini dipengaruhi oleh variasi laju aliran..
E. Chart Speed
Diagram kecepatan dapat diketahui bila sampel diinjeksikan secara manual.
2.2APLIKASI HPLC
Beberapa aplikasi HPLC dalam kehidupan :
1)HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.
2)Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan
dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
3) Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan
dengan kolom butiran berlapis zat berpori.
4)Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.
