KAJIAN Listeria monocytogenes PADA KEJU GOUDA
DEBBY FADHILAH PAZRA
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis dengan judul Kajian Listeria monocytogenes pada Keju Gouda adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2013
Debby Fadhilah Pazra
RINGKASAN
DEBBY FADHILAH PAZRA. Kajian Listeria monocytogenes pada Keju Gouda. Dibimbing oleh TRIOSO PURNAWARMAN dan DENNY WIDAYA LUKMAN.
Listeria monocytogenes termasuk dalam foodborne pathogen yang dapat
menyebabkan listeriosis terutama pada kelompok yang berisiko tinggi.
L. monocytogenes dapat ditemukan pada keju Gouda karena dipengaruhi berbagai faktor diantaranya proses pasteurisasi susu yang tidak sempurna, kontaminasi setelah pasteurisasi, prosedur sanitasi yang tidak benar serta kemampuan bakteri ini membentuk biofilm. Selain itu, bakteri ini dapat bertahan hidup selama proses pembuatan keju serta pada proses pemeraman keju. Tujuan dari penelitian ini
L. monocytogenes pada penelitian ini mengacu pada Bacteriological Analytical Manual (BAM), Food and Drug Administration (FDA) dan Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Tahap pertama yaitu pengayaan sampel pada media
Listeria enrichment broth, kemudian dilakukan isolasi pada media Oxford agar
dan dilanjutkan dengan tahap identifikasi menggunakan uji katalase, uji KOH 3%, pewarnaan Gram, uji fermentasi karbohidrat (mannitol, rhamnose, xylose), uji motilitas dan uji CAMP.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa tidak ditemukan keberadaan
L. monocytogenes pada 15 sampel keju Gouda produksi lokal (0%) dan 15 sampel keju Gouda impor (0%). Tidak ditemukannya L. monocytogenes pada sampel keju
Gouda produksi lokal dan impor yang diuji disebabkan karena kombinasi dari faktor-faktor preservatif (penghambat) pada keju Gouda seperti proses pasteurisasi susu sebagai bahan baku pembuatan keju Gouda, penurunan pH akibat dari penambahan kultur starter bakteri asam laktat (BAL), dan terjadinya penurunan aktivitas air selama proses pemeraman keju Gouda. Kombinasi dari faktor-faktor presevatif ini dapat menghambat pertumbuhan L. monocytogenes
bahkan dapat menginaktifkan L. monocytogenes. Selain itu, tidak terjadinya kontaminasi dari bakteri ini setelah proses pasteurisasi susu maupun selama proses pengolahan susu hingga menjadi keju. Faktor lainnya yang dapat mempengaruhi tidak ditemukannya L. monocytogenes pada sampel keju Gouda
yang diuji yaitu jumlah L. monocytogenes pada sampel masih di bawah limit deteksi dari metode konvensional yang digunakan pada penelitian ini. Penelitian ini dapat disimpulkan bahwa semua sampel keju Gouda yang diuji tidak
ditemukan keberadaan L. monocytogenes dan relatif aman dari cemaran
L. monocytogenes serta telah memenuhi standar yang ditetapkan oleh SNI 7388:2009 tentang Batas Maksimum Cemaran Mikroba dalam Pangan.
SUMMARY
DEBBY FADHILAH PAZRA. Study of Listeria monocytogenes in Gouda Cheeses. Supervised by TRIOSO PURNAWARMAN and DENNY WIDAYA LUKMAN.
Listeria monocytogenes is a foodborne pathogen, which has been associated
with several outbreaks of human listeriosis especially in high risk groups.
L. monocytogenes could present in Gouda cheeses because it was influenced by various factors, including unsatisfactory pasteurization treatment, contamination after heat treatment, improper sanitizing procedures and ability of this bacteria to forming biofilms. In addition, this bacteria could survive during the process of cheese making and ripening. The purpose of this study were to examine the presence of L. monocytogenes in Gouda cheeses and to provide an overview of Gouda cheese safety ofin regards with L. monocytogenes.
The samples of this study consisted of 15 local Gouda cheese and 15 imported Gouda cheese which were sold in supermarkets. The samples were taken with considering production code and expired date. The method to detect presence of L. monocytogenes which referred to the Bacteriological Analytical Manual, US Food and Drug Administration and Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. The first step was enrichment of samples in Listeria enrichment broth, then isolated in oxford agar and identification step using catalase test, 3% KOH test, Gram stain, carbohydrate fermentation test (mannitol, rhamnose, xylose), motility test and CAMP test.
The results of this study showed that L. monocytogenes was not found in 15 samples of local Gouda cheese (0%) and 15 samples of imported Gouda cheese (0%). The absence of L. monocytogenes in local and imported Gouda cheeses was related to combination of preservative factors in Gouda cheese such as pasteurization of milk as raw material for making of Gouda cheese, decrease in pH was caused by the addition of lactic acid bacteria starter cultures, and decline in water activity during the ripening process of Gouda cheeses. The combination of these preservative factors could inhibit the growth of L. monocytogenes could
even inactivate L. monocytogenes. In addition, there was not contamination of
L. monocytogenes after the pasteurization and during processing of milk to become cheeses. Another factor that could affect the absence of L. monocytogenes
in Gouda cheese samples was the number of L. monocytogenes in the samples below the detection limit of conventional method which used in this study. The study could be concluded that all of samples of Gouda cheese were not found the
existence of L. monocytogenes and relatively safe from contamination of
L. monocytogenes and fulfilled the standard that determined by national standard of Indonesia 7388:2009 about Maximum Limit of Microbial Contamination in Food.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2013
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB.
KAJIAN Listeria monocytogenes PADA KEJU GOUDA
DEBBY FADHILAH PAZRA
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains
pada
Program Studi Kesehatan Masyarakat Veteriner
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul Tesis : Kajian Listeria monocytogenes pada Keju Gouda Nama : Debby Fadhilah Pazra
NIM : B251110011
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Dr drh Trioso Purnawarman, MSi Dr med vet drh Denny Widaya Lukman, MSi
Ketua Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Dekan Sekolah Pascasarjana Kesehatan Masyarakat Veteriner
Dr med vet drh Denny Widaya Lukman, MSi Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat dan karuniaNya sehingga studi dan tesis ini dapat diselesaikan dengan baik. Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dan kelemahan baik dalam segi materi, tata bahasa maupun dalam memberikan deskripsi. Selama pengerjaan tesis ini, penulis mendapatkan banyak saran dan masukan yang membangun dari berbagai pihak dalam penyempurnaan tulisan.
Terima kasih sebesar-besarnya penulis ucapkan kepada Dr drh Trioso Purnawarman, MSi selaku ketua komisi pembimbing atas bimbingan, saran, dan arahannya dalam penyelesaian tesis; Dr med vet drh Denny Widaya Lukman, MSi selaku anggota komisi pembimbing sekaligus Ketua Program Studi Kesehatan Masyarakat Veteriner Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor (PS KMV SPs IPB) yang dengan sabar membimbing dan mengarahkan penulisan tesis; dan seluruh staf pengajar beserta tenaga kependidikan PS KMV SPs IPB. Terima kasih kepada seluruh rekan PS KMV Reguler tahun 2011/2012 dan rekan-rekan mahasiswa pascasarjana lainnya yang telah memberikan warna dan keceriaan saat proses pendidikan. Terima kasih juga kepada Pak Hendra, Pak Rahmat dan Pak Ade yang sudah banyak membantu selama penelitian di laboratorium. Tidak lupa penulis mengucapkan terima kasih kepada keluarga tercinta atas kasih sayang, perhatian, dan dukungannya kepada penulis.
Atas segala kebaikan yang telah penulis terima, semoga Allah SWT melimpahkan rahmat dan karuniaNya kepada kita semua. Semoga tesis ini bermanfaat dan dapat memberikan informasi yang berguna bagi semua pihak.
Bogor, Agustus 2013
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL ix
DAFTAR GAMBAR ix
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang 1
Perumusan Masalah 2
Tujuan Penelitian 2
Manfaat Penelitian 2
2 TINJAUAN PUSTAKA
Karakteristik L. monocytogenes 2
L. monocytogenes pada Keju 4
Listeriosis pada Manusia 4 Patogenesis L. monocytogenes 5
Keju Gouda 7
3 METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian 9
Bahan dan Metode 9
Metode Pengambilan Sampel dan Besaran Sampel 9
Metode Pengujian L. monocytogenes 10
Analisis Data 13
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Keberadaan L. monocytogenes pada Keju Gouda 13 Kajian Aspek Kesehatan Masyarakat Veteriner 20 5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan 24
Saran 24
DAFTAR PUSTAKA 24
14
DAFTAR TABEL
1 Interpretasi hasil uji L. monocytogenes 3 2 Persentase L. monocytogenes pada keju Gouda produksi lokal dan
impor
14
3 Wabah listeriosis yang dikaitkan dengan keju pada beberapa negara dari tahun 2000-2010
21
DAFTAR GAMBAR
1 Listeria monocytogenes dengan pewarnaan Gram pada kultur cairan serebrospinal
3
2 Tahap proses invasi dan penyebaran intraseluler L. monocytogenes 6
3 Keju Gouda 7
4 Diagram alir pembuatan keju Gouda 8 5 Diagram alir pembiakan L. monocytogenes 11 6 Diagram alir identifikasi L. monocytogenes 11
7 Uji CAMP 12
8 Tahap pengayaan menggunakan LEB 14 9 Media Oxford agar mengandung biakan sampel keju Gouda produksi
lokal dan impor yang telah diperkaya dalam media LEB tidak ditemukan pertumbuhan koloni yang mencirikan L. monocytogenes
14
10 Kontrol positif yang diisolasi pada media Oxford agar terdapat pertumbuhan dari L. monocytogenes
1
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Listeria monocytogenes termasuk dalam foodborne pathogen yang dapat menyebabkan listeriosis terutama pada kelompok yang berisiko tinggi seperti bayi, lanjut usia (umur ≥60 tahun), wanita hamil dan penderita
immunocompromised. Infeksi yang disebabkan oleh L. monocytogenes terutama dapat menyebabkan septikemia dan meningitis dengan tingkat mortalitas yang tinggi (Lomonaco et al. 2009). Beberapa penelitian terakhir menyatakan bahwa sebagian besar infeksi L. monocytogenes bersumber dari makanan yang terkontaminasi (Ueda et al. 2006).
Keju terutama keju lunak dikaitkan dengan sejumlah wabah listeriosis di beberapa negara. Wabah listeriosis yang disebabkan karena mengonsumsi keju telah dilaporkan di Jepang pada tahun 2001. Sebanyak 86 orang telah terinfeksi
L. monocytogenes dan 38 orang diantaranya menunjukkan gejala gastroenteritis atau gejala seperti flu (flue like syndrome) setelah mengonsumsi keju (Makino et al. 2005). Sebanyak 119 kasus listeriosis juga terjadi di Chili pada tahun 2008 setelah mengonsumsi keju Brie dan Camembert (Gilmour et al. 2010), sedangkan di Indonesia belum tersedia data maupun laporan yang mencatat kejadian listeriosis. Hal ini cukup menyulitkan dalam menentukan prevalensi listeriosis di Indonesia.
Infeksi L. monocytogenes melalui makanan pada manusia terutama berkaitan dengan produk-produk yang tidak memerlukan pemasakan sebelum dikonsumsi dan masa simpannya diperpanjang pada suhu dingin, produk ini disebut dengan ready to eat (makanan siap saji) salah satunya yaitu keju (Lomonaco et al. 2009). Keju Gouda merupakan salah satu jenis keju yang dikenal di Indonesia, dimana merupakan keju semi keras yang berasal dari Belanda. Pemenuhan kebutuhan keju Gouda di Indonesia tidak hanya melalui impor tetapi sudah dapat di produksi di dalam negeri sejak tahun 1999.
Listeria monocytogenes dapat ditemukan pada keju Gouda karena dipengaruhi berbagai faktor diantaranya proses pasteurisasi susu yang tidak sempurna, perlakuan atau kontaminasi setelah pasteurisasi, prosedur sanitasi yang tidak benar, pengembangan resistensi bahan kimia yang secara rutin digunakan untuk sanitasi serta kemampuan bakteri ini membentuk biofilm juga mengakibatkan resisten terhadap desinfektan. Selain itu, beberapa sifat dari
L. monocytogenes seperti tahan terhadap pH rendah (sampai pH 4.4), tahan terhadap konsentrasi garam yang tinggi dan kemampuan untuk tumbuh pada suhu dingin memungkinkan bakteri ini dapat bertahan hidup selama proses pembuatan keju dan pada proses pemeraman keju (Lomonaco et al. 2009). Pada umumnya permukaan keju Gouda dilapisi oleh lilin sehingga oksigen yang masuk ke dalam keju Gouda menjadi sedikit. Kondisi ini menjadi media yang cocok untuk pertumbuhan L. monocytogenes mengingat bahwa bakteri ini bersifat fakultatif anaerob sampai mikroaerofilik. Laporan dari CDC (2010), menyatakan bahwa
L. monocytogenes telah dideteksi pada keju Gouda. Pengujian terhadap keju
2
Serikat akibat dari mengonsumsi keju. Berdasarkan hal di atas, maka diperlukan pengujian terhadap keberadaan L. monocytogenes pada keju Gouda yang beredar di Indonesia.
Perumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang yang telah dijelaskan di atas dapat diambil suatu perumusan masalah yaitu apakah keberadaan L. monocytogenes ditemukan pada keju Gouda serta bagaimana gambaran keamanan keju Gouda tersebut ditinjau dari keberadaan L. monocytogenes.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji keberadaan L. monocytogenes pada keju Gouda serta untuk memberikan gambaran keamanan keju Gouda ditinjau dari keberadaan L. monocytogenes.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan gambaran keamanan keju
Gouda ditinjau dari keberadaan L. monocytogenes. Selain itu, diharapkan dapat sebagai bahan pertimbangan terhadap kebijakan teknis kegiatan importasi untuk mencegah peluang masuk L. monocytogenes melalui media pembawa keju.
2 TINJAUAN PUSTAKA
Karakteristik L. monocytogenes
Listeria monocytogenes merupakan bakteri Gram positif, berbentuk batang, berukuran kecil dengan diameter 0.5 µm dan panjang 1-2 µm (Gambar 1). Susunan sel dari bakteri ini ditemukan sebagai unit tunggal atau rantai pendek serta dapat berbentuk V dan Y. Kadang-kadang bakteri ini berbentuk coccoid
dengan rata-rata diameter 0.5 µm dan dapat dikelirukan dengan streptococci.
L. monocytogenes tidak menghasilkan spora dan tidak membentuk kapsul serta bakteri ini merupakan patogen fakultatif intraseluler yang dapat ditemukan dalam monosit dan netrofil (Baek 2000; Donnelly 2001; Ryser dan Marth 2007).
3
Gambar 1 L. monocytogenes dengan pewarnaan Gram pada kultur cairan serebrospinal (Lee et al. 2010)
Listeria monocytogenes memiliki flagela peritrikus yang merupakan alat gerak ketika dikultur pada suhu 20-25 °C dan tidak atau motilitasnya sangat lemah pada suhu 37 °C. Preparat hanging-drop dari biakan segar dalam tryptose phosphate broth diinkubasi pada suhu 20 °C menunjukkan karakteristik motilitas tumbling. Motilitas biakan dalam media semisolid menghasilkan gambaran khas berbentuk payung atau pohon pinus terbalik sekitar 0.5 cm di bawah permukaan,
karena bakteri ini bersifat mikroaerofilik (Ryser dan Marth 2007). Selain itu,
L. monocytogenes bersifat fakultatif anaerob, hemolitik dan mempunyai kemampuan memfermentasi rhamnose tetapi bukan xylose (Ray 2005).
Karakteristik penting dari L. monocytogenes adalah bersifat psikrotrof dimana mampu tumbuh pada suhu dingin, mampu mentoleransi konsentrasi garam (NaCl) yang tinggi, kondisi pH yang rendah (Vázquez-Boland et al. 2001), tahan terhadap pembekuan dan pengeringan (Ray 2005) serta mampu membentuk biofilm pada permukaan peralatan pengolahan dan lingkungan pengolahan (Borucki et al. 2003). Biofilm adalah koloni bakteri yang melekat pada permukaan benda atau lingkungan dan berlindung dalam matriks extracellular
polymeric substances (EPS) (Donlan dan Costerton 2000). Kemampuan
L. monocytogenes membentuk biofilm membuat bakteri ini menjadi lebih resisten terhadap desinfektan dan paparan suhu tinggi (Moltz dan Martin 2005).
Menurut Ray (2005), kisaran suhu pertumbuhan L. monocytogenes yaitu 1-44 °C dengan pertumbuhan optimal pada suhu 35-37 °C. L. monocytogenes
4
terjadi dalam 21 hari. Menurut Adams dan Moss (2008), pada konsentrasi NaCl 16% dengan pH 6.0 L. monocytogenes dapat bertahan selama satu tahun.
L. monocytogenes pada Keju
Kehadiran L. monocytogenes pada keju disebabkan oleh berbagai faktor antara lain proses pasteurisasi yang tidak sempurna, perlakuan atau kontaminasi setelah pasteurisasi. Kontaminasi dapat meningkat akibat prosedur sanitasi yang tidak benar, pengembangan resistensi bahan kimia yang secara rutin digunakan untuk sanitasi serta kemampuan bakteri ini membentuk biofilm juga mengakibatkan resisten terhadap desinfektan. Selain itu, beberapa sifat dari
L. monocytogenes seperti tahan terhadap pH rendah (sampai pH 4.4), tahan terhadap konsentrasi garam yang tinggi dan kemampuan untuk tumbuh pada suhu dingin memungkinkan bakteri ini dapat bertahan hidup selama proses pembuatan keju dan pada proses pemeraman keju (Lomonacoet al. 2009).
Menurut Doyle et al. (2001), selama proses pembuatan keju bakteri ini terkonsentrasi dalam curd (dadih keju) dan hanya sebagian kecil ditemukan pada
whey. Perilaku pertumbuhan bakteri ini dalam curd dipengaruhi oleh jenis keju. Pada keju Feta terdapat pertumbuhan L. monocytogenes sedangkan pada keju
Cottage terjadi inaktivasi dari bakteri ini. Saat pemeraman, sel bakteri dapat meningkat seperti pada keju Camembert, menurun secara berlahan seperti pada keju Cheddar atau penurunan secara cepat kemudian stabil seperti keju Blue.
Penelitian yang dilakukan pada keju Gouda dengan menginokulasikan
L. monocytogenes sebesar 500 cfu/ml ke dalam susu pasteurisasi dan diperam selama 6 minggu pada suhu 13 °C. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa
L. monocytogenes terkonsentrasi dalam curd selama proses pembuatan keju yang mengakibatkan peningkatan populasi sekitar 10 kali lipat dari jumlah yang diinokulasikan. Jumlah L. monocytogenes relatif konstan pada bagian dalam dari sampel keju Gouda yaitu 104 cfu/g selama 2 minggu pemeraman, tetapi bakteri ini tidak terdeteksi pada permukaan sampel keju Gouda. Setelah 6 minggu pemeraman, L. monocytogenes terdeteksi di permukaan sampel keju Gouda sebesar 102-104 cfu/g. Sebaliknya, pada bagian dalam sampel keju Gouda yang diperam selama 6 minggu, jumlah L. monocytogenes menurun empat sampai delapan kali lipat (Ryser dan Marth 2007).
Listeriosis pada Manusia
Listeria monocytogenes merupakan foodborne pathogen yang sumber infeksi utamanya melalui makanan yang terkontaminasi bakteri ini. Penyakit yang disebabkan oleh infeksi L. monocytogenes disebut listeriosis. Listeriosis sering terjadi pada kelompok berisiko tinggi seperti bayi, lanjut usia, wanita hamil dan penderita immunocompromised dengan tingkat kematian yang tinggi sebesar 30%
5
Secara keseluruhan, 1 558 kasus listeriosis dari 27 negara anggota Uni Eropa telah dilaporkan pada tahun 2007. Kelompok yang paling banyak terinfeksi yaitu kelompok berusia tua (>50 tahun) dan bayi baru lahir, dengan kejadian masing-masing 1 kasus/100 000 penduduk dan 0.51 kasus/100 000 penduduk. Pada kelompok anak-anak (0-4 tahun), 85% kasus terjadi pada bayi baru lahir.
Tingkat kematian di Uni Eropa diperkirakan sekitar 20% (dari 795 kasus penyakit yang dilaporkan terdapat 160 orang meninggal) (EFSA 2009).
Terdapat dua bentuk gejala klinis yang diakibatkan oleh infeksi
L. monocytogenes yaitu listerial gastroenteritis/gastrointestinal illness (bentuk saluran pencernaan) dan invasive listeriosis (bentuk invasif). Pada listerial gastroenteritis, gejala klinis ditandai dengan mual, muntah, kram perut dan diare yang terlihat setelah menelan bakteri selama lebih dari 12 jam. Listeriosis bentuk invasif diakui sebagai foodborne disease yang serius karena tingkat keparahan gejala dan tingkat kematian yang tinggi yaitu 20-30% (Garrido et al. 2008). Masa inkubasi penyakit invasif pada umumnya jauh lebih lama dari bentuk pencernaan yaitu antara 20-30 hari (Garrido et al. 2010). Telah dilaporkan bahwa 1-10% manusia yang terinfeksi L. monocytogenes tidak menunjukkan gejala klinis, tetapi bakteri ini dapat mengkontaminasi lingkungan melalui feses (Lovett dan Twedt 2004).
Gejala klinis bentuk invasif pada wanita hamil yang paling sering terlihat yaitu gejala seperti flu diantaranya demam, menggigil, sakit kepala, kelelahan dan nyeri otot sekitar 2-14 hari sebelum keguguran serta kadang-kadang menimbulkan gejala gastrointestinal (Adams dan Moss 2008). Infeksi terhadap fetus dapat terjadi melalui transplasenta yang dapat mengakibatkan abortus, kematian pada bayi baru lahir atau persalinan prematur (Disson et al. 2008). Listeriosis pada bayi baru lahir dapat mengakibatkan meningitis, pneumonia, septikemia dan granuloma (abses) yang tersebar luas. Listeriosis pada kelompok umur dewasa yang tidak hamil biasanya ditandai dengan septikemia, meningitis dan meningoensefalitis, tetapi dapat juga menyebabkan endokarditis, arteritis, abses lokal atau osteomielitis (Vazquez-Boland et al. 2001; Doganay 2003; Delgado 2008).
Patogenesis L. monocytogenes
Listeria monocytogenes merupakan patogen fakultatif intraseluler yang mampu bertahan dalam makrofag dan menyerang berbagai sel nonphagocytic
6
oleh lisosom. Secara cepat bakteri berkembang biak di dalam sitoplasma dan membentuk F-aktin (Gambar 2d). Bakteri akan menginvasi sel lain dengan bantuan F-aktin mengakibatkan kerusakan sel dan septikemia (Gambar 2e). Setelah berhasil menginvasi sel lain, bakteri berada dalam vakuola dengan membran ganda dan melanjutkan siklus hidup dengan terus menginvasi sel lain (Gambar 2f) (Lovett dan Twedt 2004).
Gambar 2 Tahap proses invasi dan penyebaran intraseluler L. monocytogenes
(Hamon et al. 2006)
Lima hari hingga tiga minggu setelah tertelan, bakteri ini menyebar ke seluruh tubuh dan mengakibatkan kerusakan sistem syaraf, jantung, mata, organ lain dan fetus. Infeksi L. monocytogenes pada sistem syaraf menimbulkan meningitis, ensefalitis dan abses dengan tingkat kematian 70%. Infeksi pada wanita hamil dapat mengakibatkan aborsi dan kematian bayi setelah lahir dengan rata-rata tingkat kematian sebesar 80%. Data epidemiologi menunjukkan bahwa
7
kematian 50% dapat terjadi pada kelompok usia dewasa dengan kekebalan rendah atau kelahiran bayi. Kemampuan L. monocytogenes untuk menimbulkan septikemia tergantung beberapa faktor seperti jumlah bakteri yang tertelan, status kekebalan tubuh induk semang dan keganasan galur bakteri yang menginfeksi (Lovett dan Twedt 2004).
Keju Gouda
Keju Gouda merupakan salah satu keju semi keras yang berasal dari Belanda. Bentuk umum dari keju ini adalah berkulit tipis dan kering serta umumnya dilapisi dengan lilin kuning (Gambar 3). Curd berwarna kuning gading dan tidak lengket, tektur padat, rasanya gurih dengan sedikit asin tetapi tidak masam (Scott 1986). Keju Gouda dapat berbentuk bulat atau silinder datar dengan sisi menonjol berukuran antara 0.2-20 kg. Kandungan lemak dalam bahan kering berkisar dari 40 sampai >50%, kadar air dalam keju bebas lemak berkisar dari 53-63%, kadar garam dalam air keju berkisar antara 2-7%, pH dapat bervariasi dari 4.9-5.6 dan lama pemeramannya antara 2 minggu sampai 2 tahun (Fox et al. 2004).
Gambar 3 Keju Gouda (Anonim 2013)
8
Fungsi rennet sebagai bahan koagulan akan lebih optimal jika ditambahkan dalam kondisi susu yang telah mengalami penurunan pH hingga mencapai pH 5-6. Kemudian dilanjutkan dengan pemotongan curd dan pengadukan kembali, setelah itu dilakukan pengendapan selama 30 menit. Kemudian whey dikeluarkan dan ditambahkan air hangat (34.5 °C) lalu diaduk. Proses pengendapan curd dan pengeluaran whey dilakukan sebanyak 3 kali, sedangkan penambahan air hangat dilakukan 2 kali. Setelah pengeluaran whey yang ke-3 kali, curd dicetak dan kemudian dilakukan pengempresan dengan tekanan pada permukaan keju meningkat secara bertahap sekitar 25 kPa dalam tiga atau empat tahap selama 80 menit. Setelah pengempresan, kemudian didiamkan selama 1 jam. Tahapan selanjutnya yaitu perendaman dalam air garam dengan konsentrasi 17-18% selama 1 hari, lalu dikeringkan. Keju kemudian dilapisi dengan lilin dengan cara dicelupkan pada lilin cair panas, selanjutnya keju diperam dalam jangka waktu tertentu sesuai dengan jenis keju dalam kondisi suhu 12-16 °C dan kelembaban (RH) 80-85%. Pemeraman pada keju Gouda dilakukan selama 2 minggu sampai 2 tahun. Keju yang telah diperam dilakukan pengemasan dalam kondisi vakum (Fox et al. 2004). Proses pembuatan keju Gouda dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4 Diagram alir pembuatan keju Gouda (Fox et al. 2004) Susu segar
Pasteurisasi suhu 73-74 °C selama 15 detik
Penambahan kultur starter (0.6%) terlebih dahulu, setelah itu rennet (0.02%)
rennet (0.02%)
Koagulasi susu
Pemotongan curd
Pengendapan 30 menit (3 kali proses)
Penambahan air hangat (2 kali proses)
Penyaringan whey (3 kali proses) Pencetakan curd
Pengepresan curd meningkat secara bertahap (3-4 kali) 25 kPa, 80 menit Perendaman dalam larutan garam
(17-18%) selama 24 jam
Coating (pelapisan)
Pemeraman keju jangka waktu tertentu (sesuai jenis keju)
Keju Gouda
9
3 METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Bagian Kesehatan Masyarakat Veteriner, Depertemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor, mulai bulan Maret 2012 sampai dengan April 2013.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Keju Gouda produksi lokal dan impor. Bahan kimia yang digunakan yaitu Listeria enrichment broth
(LEB), Oxford agar, trypticase soy agar dengan yeast extract (TSAye), tryptone soya broth dengan yeast extract (TSBye), media semisolid SIM, pereaksi H2O2 3%, KOH 3%, gula-gula mannitol, xylosa, rhamnosa, pewarnaan Gram, anaerob gas pack, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Rhodococcus equi ATCC 6939,
Streptococcus agalactiae, dan biakan L. monocytogenes (isolat lapang) sebagai kontrol positif.
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu cawan petri (diameter 100 mm, tinggi 15 mm), tabung reaksi berpenutup, botol media, gelas erlenmeyer, pipet ukur, pipet tetes, ose, mikroskop, pembakar bunsen, timbangan, tube shaker
(vortex), stomacher, tabung jar, inkubator bersuhu 30 °C ± 1 °C, inkubator bersuhu 37 °C ± 1 °C, penangas air, autoklaf, lemari pendingin (refrigerator).
Metode Pengambilan Sampel dan Besaran Sampel
10
Keterangan:
n : ukuran sampel
a : tingkat kepercayaan (90%) D : nilai dugaan populasi yang sakit [D = PxN, dengan asumsi prevalensi (P) = 2%] N : jumlah populasi
Pengambilan sampel dilakukan secara aseptis. Kemudian dimasukkan ke dalam kantong plastik steril yang telah diberi label kode sampel dan disimpan dalam kondisi dingin untuk ditransportasikan.
Metode Pengujian L. monocytogenes
Pengujian sampel mengacu pada Bacteriological Analytical Manual, Food and Drug Administration (2011) dan Bergey’s Manual of Determinative
Bacteriology (1994). Secara rinci dapat dilihat pada diagram alir Gambar 5. Preparasi sampel dan pengayaan (enrichment) menggunakan sampel keju
Gouda sebanyak 25 g dan ditambahkan 225 ml Listeria enrichment broth (LEB), kemudian dihomogenisasi dengan menggunakan stomacher selama 3 menit dan diinkubasi pada suhu 30 °C selama 24 jam, 48 jam dan 7 hari. Selanjutnya dilakukan isolasi pada media agar selektif (Oxford agar) secara duplo, diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24-48 jam ± 2 jam secara aerobik dan anaerobik (Gambar 5). Pertumbuhan koloni kuman yang mencirikan L. monocytogenes pada media
Oxford agar berupa koloni kecil berdiameter 1 mm berwarna hitam dengan pusat yang cekung dan halo berwarna hitam.
Tahap identifikasi diawali dengan menumbuhkan koloni yang mencirikan L. monocytogenes pada media TSAye, kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C
selama 24-48 jam. Selanjutnya dilakukan uji biokimia yang terdiri atas uji KOH 3%, Uji katalase, uji gula-gula (mannitol, rhamnose, xylose), pewarnaan Gram, uji motilitas, serta uji konfirmasi aktivitas hemolitik dengan uji CAMP. Sebelum dilakukan uji gula-gula, koloni yang diduga L. monocytogenes dibiakan terlebih dahulu pada media TSBye (Gambar 6). Interpretasi hasil uji L. monocytogenes
11
Gambar 5 Diagram alir pembiakan L. monocytogenes
Gambar 6 Diagram alir identifikasi L. monocytogenes
a. Uji Katalase
Mencampurkan koloni yang diduga L. monocytogenes dengan satu tetes pereaksi H2O2 3% pada gelas obyek hingga rata. Kemudian diamati apakah terbentuk gelembung-gelembung gas.
b. Uji KOH
Dua tetes larutan KOH 3% diletakkan di atas gelas obyek. Satu koloni kuman yang diduga L. monocytogenes diambil menggunakan ose steril. Ose yang mengandung kuman dicampur dan diaduk dengan cepat dalam larutan KOH 3% di atas gelas obyek, kemudian diamati apakah ada benang yang kental terbentuk saat menaikkan dan menurunkan ose.
Koloni dari kontrol positif dan 5 koloni yang diduga L. monocytogenes dibiakkan dalam
TSAye 24 jam/37 °C
Uji KOH, Uji Katalase, pewarnaan Gram, Uji CAMP
TSBye 8 jam/37 °C
SIM-Agar
Mannitol, rhamnose, xylose
25 g sampel ditambah 225 ml LEB dan kontrol positif diinkubasi 24 jam, 48 jam dan 7 hari/30 °C
24 jam/30 °C
48 jam/30 °C
7 hari/30 °C
Oxford agar
24-48 jam ± 2 jam /37 °C secara aerobik dan
12
c. Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram dilakukan mengikuti prosedur Hans Christian Gram (Xu1007). L. monocytogenes merupakan bakteri Gram positif sehingga menunjukkan sel berwarna violet pada pemeriksaan mikroskopis.
d. Uji Motilitas
Menggunakan media semi solid yaitu media SIM dalam tabung medium. Koloni dari media TSAye diambil dengan ose jarum, kemudian ditusukkan ke dalam media SIM secara tegak dan diinkubasi pada suhu 25 °C selama 24 jam.
e. Uji Gula-gula
Sebanyak 0.5 ml biakan dari media TSBye diinokulasikan pada media yang mengandung karbohidrat (mannitol, rhamnosa dan xylosa), kemudian diinkubasikan pada suhu 37 °C selama 24 jam.
f. Uji Konfirmasi
Konfirmasi aktivitas hemolitik L. monocytogenes (β-hemolitik) dilakukan dengan uji CAMP. Uji ini dilakukan dengan menggoreskan biakan
Staphylococcus aureus(β-hemolitik) dan Rhodococcus equi secara parallel/sejajar dan diametris berlawanan satu dengan yang lain pada media agar darah (mengandung darah domba 5-7%). Kemudian beberapa koloni yang diduga
L. monocytogenes digoreskan sejajar terhadap yang lain tetapi membuat sudut ke arah kanan dan diantara goresan S. aureus dan R. equi. Selanjutnya sebagai kontrol positif, biakan L. monocytogenes juga digoreskan sejajar dengan koloni yang diduga L. monocytogenes. Selain itu, biakan Streptococcus agalactiae juga digoreskan sejajar dengan koloni yang diduga L. monocytogenes untuk membedakan hasil uji CAMP positif antara L. monocytogenes dengan
Streptococcus agalactiae (Gambar 7). Selanjutnya media diinkubasikan pada suhu 37 °C selama 24-48 jam.
Gambar 7 Uji CAMP
L. monocytogenes
R. equi
S. agalactiae
Koloni yang diduga L. monocytogenes S. aureus
13
Tabel 1 Interpretasi hasil uji L. monocytogenes
No. Jenis uji Hasil uji Keterangan 1. Pewarnaan Gram Positif Batang pendek, Gram positif
2. Motilitas Positif Terdapat pertumbuhan bakteri di sepanjang tusukan dan menyebar seperti payung (umbrella motility) sekitar 0.5 cm di bawah permukaan media SIM
3. Mannitol Negatif Berwarna ungu 4. Rhamnosa Positif Berwarna kuning 5. Xylosa Negatif Berwarna ungu
6. KOH Negatif Tidak terbentuk benang kental 7. Uji katalase Positif Terbentuk gelembung gas
8. CAMP test Positif Zona hemolisis di sekitar goresan
Staphylococcus aureus yang
membentuk mata anak panah
Analisis Data
Analisis data yang digunakan dalam penelitian ini adalah analisa deskriptif
yaitu dengan menyajikan hasil uji keju Gouda terhadap keberadaan
L. monocytogenes dalam bentuk tabel dan gambar. Menurut Mattjik dan Sumertajaya (2002), analisa deskriptif adalah bidang statistik yang membahas tentang cara atau metode mengumpulkan, menyederhanakan dan menyajikan data sehingga dapat memberikan informasi.
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Keberadaan L. monocytogenes pada Keju Gouda
Hasil penelitian menunjukkan bahwa sebanyak 30 sampel keju Gouda yang terdiri atas 15 sampel keju Gouda produksi lokal dan 15 sampel keju Gouda
impor tidak ditemukan keberadaan L. monocytogenes (Tabel 2). Hal ini ditandai dengan tidak ditemukan pertumbuhan koloni yang mencirikan L. monocytogenes
pada media agar selektif (Oxford agar) setelah diinkubasi 24-48 jam ± 2 jam dengan suhu inkubasi 37 °C secara aerobik maupun anaerobik pada semua sampel yang diuji (Gambar 9), sedangkan pada kontrol positif yang diisolasi pada media
14
Tabel 2 Persentase L. monocytogenes pada keju Gouda produksi lokal dan impor Jenis sampel Hasil pengujian
Positif Persentase (%)
Keju Gouda impor (n = 15) Tidak ada 0
Keju Gouda produksi lokal (n = 15) Tidak ada 0
Gambar 8 Tahap pengayaan menggunakan LEB
a b
Gambar 9 Media Oxford agar mengandung biakan sampel keju Gouda produksi lokal (a) dan impor (b) yang telah diperkaya dalam media LEB tidak
15
Gambar 10 Kontrol positif yang diisolasi pada media Oxford agar terdapat pertumbuhan dari L. monocytogenes
Hal ini berbeda dengan laporan dari CDC (2010) yang menyatakan bahwa
L. monocytogenes dideteksi pada keju Gouda. Pengujian terhadap keju Gouda
dilakukan oleh Department of Food and Agriculture California terkait dengan terjadinya wabah penyakit di beberapa negara bagian Amerika Serikat akibat dari mengonsumsi keju. Keju Gouda yang diuji merupakan keju yang terbuat dari susu yang tidak dipasteurisasi. Selain L. monocytogenes, Escherichia coli O157:H7 juga dideteksi pada keju Gouda tersebut yang mengakibatkan 38 orang terinfeksi dan 15 orang dirawat di rumah sakit, sedangkan kasus penyakit akibat dari infeksi
L. monocytogenes tidak dilaporkan. Nwachukwu et al. (2009) juga telah mendeteksi keberadaan L. monocytogenes pada keju Gouda yang diproduksi di Nigeria.
Penelitian yang dilakukan oleh Wemmenhove et al. (2013) dengan menginokulasikan tiga strain L. monocytogenes (Scott A, 2F, 6E) pada susu yang telah dipasteurisasi sebagai bahan baku untuk pembuatan keju Gouda. Hasil
penelitian ini menunjukkan bahwa tidak ada pertumbuhan ketiga strain
L. monocytogenes pada keju Gouda selama 8 minggu pemeraman dan terjadi penurunan pertumbuhan pada ketiga strain L. monocytogenes secara signifikan setelah 8 minggu sampai 52 minggu pemeraman sebesar 1 log-7 log.
Tidak ditemukannya L. monocytogenes pada sampel keju Gouda produksi lokal dan impor yang diuji disebabkan karena kombinasi dari faktor-faktor preservatif (penghambat) pada keju Gouda seperti proses pasteurisasi susu sebagai bahan baku pembuatan keju Gouda, penurunan pH akibat dari penambahan kultur starter bakteri asam laktat (BAL), dan terjadinya penurunan aktivitas air selama proses pemeraman keju Gouda. Kombinasi dari faktor-faktor presevatif ini dapat menghambat pertumbuhan L. monocytogenes bahkan dapat menginaktifkan L. monocytogenes. Menurut Ryser dan Marth (2007), inaktivasi
16
hurdle technology pada bahan makanan dapat mengeliminasi, menginaktifkan atau setidaknya dapat menghambat pertumbuhan dari mikroba yang tidak diinginkan karena tidak dapat mengatasi hambatan tersebut. Hambatan yang berbeda dalam pengolahan makanan tidak hanya merupakan gabungan efek tetapi dapat bertindak secara sinergis.
Sampel keju Gouda produksi lokal dan impor yang diuji terbuat dari susu
yang dipasteurisasi terlebih dahulu sehingga mampu mengeliminasi L. monocytogenes dan bakteri patogen lain. Selain itu, tidak terjadinya
kontaminasi dari bakteri ini setelah proses pasteurisasi susu maupun selama proses pengolahan susu hingga menjadi keju. Suhu pasteurisasi susu yang digunakan pada keju Gouda produksi lokal yaitu 65 °C selama 30 menit, suhu ini mampu menginaktifkan L. monocytogenes, sedangkan untuk keju Gouda impor tidak diketahui berapa suhu pasteurisasi susu yang digunakan.
Menurut Ray (2005), L. monocytogenes sensitif terhadap suhu pasteurisasi (71.7 °C selama 15 detik atau 62.8 °C selama 30 menit). Menurut Ryser dan Marth (2007), suhu tinggi dapat menyebabkan kerusakan sel yang irreversible
dari Listeria spp yang dapat mengakibatkan kematian sel. Terpaparnya
L. monocytogenes terhadap suhu di atas 56 °C menyebabkan kerusakan ribosom,
unfolding dan denaturasi protein serta inaktivasi enzim. Saat pemanasan, ribosom kehilangan Mg2+ yang menyebabkan pemisahan subunit ribosomal 30S dan 50S. Kerusakan ribosom terutama denaturasi dari subunit ribosom 30S dikaitkan dengan inaktivasi termal bakteri vegetatif dan diyakini menjadi penyebab utama kematian bakteri. Aktivitas enzim superoksida dimutase dari L. monocytogenes
akan menurun apabila terpapar pada suhu di atas 45-50 °C, sedangkan aktivitas enzim katalase dari L. monocytogenes akan menurun apabila terpapar pada suhu di atas 55-60 °C. Suhu pengolahan yang lebih tinggi dapat menginaktifkan enzim-enzim tersebut.
Susu segar yang merupakan bahan dasar pembuatan keju dapat menjadi sumber kontaminasi L. monocytogenes pada keju terutama keju yang berasal dari susu yang tidak dipasteurisasi. Hewan dapat terinfeksi L. monocytogenes karena memakan silase atau pakan yang terkontaminasi bakteri ini. Beberapa hewan yang terinfeksi L. monocytogenes tidak menunjukkan gejala klinis (carrier) dan dapat menjadi sumber kontaminasi lingkungan peternakan dan susu. Susu dapat terkontaminasi L. monocytogenes melalui kontaminasi silang dari lingkungan peternakan, peralatan yang digunakan saat pemerahan, dan melalui pekerja yang terkontaminasi L. monocytogenes (Nightingale et al. 2004). L. monocytogenes
juga dapat menyebabkan mastitis pada sapi dan bakteri ini dapat dieksresikan di dalam susu (Shakespeare 2009). Tingginya kejadian L. monocytogenes pada susu segar menyebabkan keju yang terbuat dari susu yang tidak dipasteurisasi dapat menjadi faktor risiko terhadap kontaminasi L. monocytogenes pada keju.
17
Menurut Wemmenhove et al. (2013), tidak adanya pertumbuhan atau menurunnya pertumbuhan L. monocytogenes pada keju Gouda dapat disebabkan karena kandungan asam laktat dan terjadinya penurunan aktivitas air selama proses pemeraman keju Gouda. Asam laktat merupakan asam organik yang dominan terdapat pada keju Gouda (13.9 g/kg). Setelah terbentuk, konsentrasi asam laktat tidak berubah secara signifikan selama proses pemeraman keju
Gouda. Asam laktat yang terkandung pada keju Gouda dalam bentuk tidak terdisosiasi (tidak terurai) dapat menghambat pertumbuhan L. monocytogenes. Bakteri asam laktat yang ditambahkan pada proses pembuatan keju Gouda akan memfermentasi laktosa pada susu menjadi asam laktat sehingga dapat
menurunkan pH. Kondisi ini yang mengakibatkan terhambatnya pertumbuhan
L. monocytogenes. Keju Gouda yang diperam selama lebih dari 2 minggu memiliki pH berkisar antara 5.3-5.5 dan setelah 6 bulan pemeraman pH keju
Gouda tidak mengalami peningkatan secara signifikan. Kisaran pH keju Gouda
tersebut masih lebih rendah dari kisaran pH pertumbuhan dari L. monocytogenes. Menurut Doyle et al. (2001), L. monocytogenes dapat tumbuh pada kisaran pH 5.6-9.6.
Menurut Ryser dan Marth (2007), tidak adanya pertumbuhan dan penurunan kelangsungan hidup sel L. monocytogenes (viabilitas) dapat diamati pada pH ≤5.5,
ketika kondisi lingkungan lainnya (suhu) tidak optimal untuk kelangsungan hidup
L. monocytogenes. Suhu mempengaruhi perilaku pertumbuhan L. monocytogenes
dalam kondisi asam. Sensitivitas L. monocytogenes terhadap keasaman tinggi (pH <4.5) meningkat seiring dengan meningkatnya suhu terutama ketika media tidak kondusif untuk pertumbuhan bakteri ini. Populasi L. monocytogenes sebesar 104 cfu/ml diinokulasikan ke dalam jus kubis (pH 5.2) yang diinkubasi pada suhu 30 °C selama 3 hari mengalami peningkatan menjadi 109 cfu/ml. Selain itu, populasi L. monocytogenes tetap tidak berubah selama 22 hari penyimpanan pada suhu 5 °C. Pertumbuhan yang cepat terjadi pada suhu 30 °C diikuti juga dengan kematian yang cepat dari sel bakteri dimana bakteri ini tidak lagi terdeteksi setelah penyimpanan selama 15 hari.
Viabilitas L. monocytogenes terhadap kondisi pH rendah tergantung pada kemampuan sel untuk mempertahankan pH intraseluler mendekati netral, terlepas dari pH lingkungan. Sel dapat mengatasi kondisi keasaman ringan dengan mengeliminasi kelebihan proton dari sitoplasma. Sel tidak dapat mengeliminasi proton secara cepat dan penurunan pH intraseluler tidak dapat dihindari, apabila berada pada kondisi di bawah ambang batas pH. Pengasaman sitoplasma dapat menyebabkan kehilangan energi penting dari sel untuk metabolisme. Kelebihan H+ dapat mengubah aktivitas enzim dan menyebabkan denaturasi protein. Komposisi makanan, pengolahan dan kondisi penyimpanan dapat mempengaruhi apakah pH rendah dapat bersifat listeriostatik atau listerisidal (Ryser dan Marth 2007).
Menurut Wemmenhove et al. (2013), aktivitas air pada keju Gouda akan semakin menurun dengan semakin lama waktu pemeraman. Aktivitas air setelah 8 minggu pemeraman pada keju Gouda yaitu 0.98, setelah 7 bulan pemeraman menurun menjadi 0.92 dan 1 tahun pemeraman aktivitas air menjadi 0.84. Aktivitas air yang rendah setelah 7 bulan dan 1 tahun pemeraman dapat menghambat pertumbuhan L. monocytogenes. Menurut Doyle et al. (2001),
18
strain L. monocytogenes tumbuh pada aktivitas air minimum 0.93. Menurut Ryser dan Marth (2007), aktivitas air yang rendah (osmolaritas tinggi) dapat mengakibatkan tekanan osmotik pada sel bakteri dengan menyerap ke luar air yang ada di dalam sel sehingga mengakibatkan sel kekurangan air dan dapat mengakibatkan penghambatan pertumbuhan bahkan dapat mengakibatkan kematian.
Keberadaan L. monocytogenes yang tersebar luas di lingkungan memungkinkan kehadiran bakteri ini pada lingkungan pengolahan, hal ini penting untuk diperhatikan karena transfer bakteri ini dari lingkungan ke makanan dapat terjadi terutama jika penerapan higiene dan sanitasi yang masih buruk (D'Amico and Donnelly 2008). L. monocytogenes dapat ditemukan pada lingkungan pengolahan keju sebesar 13.1% (Fox et al. 2011). Kontaminasi L. monocytogenes
selama proses pengolahan susu hingga menjadi keju biasanya dapat terjadi dari peralatan yang digunakan selama proses pembuatan keju yang telah tercemar
L. monocytogenes, lingkungan pengolahan keju yang tercemar L. monocytogenes, pekerja yang tidak menerapkan higiene dan sanitasi yang baik serta penambahan
bahan-bahan lain seperti rennet, kultur starter atau garam yang tercemar
L. monocytogenes (Lundén et al. 2002). Menurut Ryser dan Marth (2007), rennet dapat tercemar L. monocytogenes apabila berasal dari ekstraksi lapisan abomasum (lambung keempat) anak sapi yang terinfeksi L. monocytogenes. Menurut Oliver
(2005), bahan baku seperti susu segar yang sering terkontaminasi oleh
L. monocytogenes dapat berfungsi sebagai sumber kontaminasi pada industri pengolahan makanan.
Kontaminasi L. monocytogenes pada keju sebagian besar terlokalisasi pada permukaannya. Hal ini disebabkan karena terjadinya peningkatan pH dan terjadinya proses proteolisis pada permukaan keju (khususnya pada keju peram berkapang) selama proses pemeraman yang mengakibatkan perubahan fisik dan kimia secara teoritis memungkinkan untuk pertumbuhan L. monocytogenes. Program monitoring Listeria spp yang dilakukan oleh Dairy Research Station
Swiss menyatakan bahwa hanya 0.9% dari 2 609 keju yang diuji terkontaminasi
L. monocytogenes pada bagian dalam keju dan 5% dari 56 377 keju yang diuji terkontaminasi L. monocytogenes pada permukaan keju. Salah satu alasan tingginya kejadian ini, karena kontaminasi ulang pada keju selama proses pemeraman (Pak et al. 2002).
Perilaku pertumbuhan dari L. monocytogenes pada keju dipengaruhi oleh jenis keju. Berdasarkan kadar air keju dibagi menjadi tiga tipe yaitu: (1) keju keras memiliki kadar air 20-42%, contohnya Parmesan dari Italia dan
Emmentaler dari Swiss; (2) keju semi keras atau semi lunak memiliki kadar air 45-55%, contohnya Cheddar dari Inggris, Gouda dan Edam dari Belanda; dan (3) keju lunak memiliki kadar air (>55%), contohnya Camembert dari Normandia,
Limburger dari Belgia dan Brie dari Perancis. Semua keju jenis tersebut dikonsumsi setelah diperam selama waktu tertentu, sedangkan keju segar yang memiliki kadar air >70% dikonsumsi langsung setelah penyaringan dan pemisahan dari whey seperti keju Cottage, Mozzarella dan Ricotta dari Italia (Heller et al. 2008). Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Roth (2009) menunjukkan bahwa keju lunak dan keju semi keras lebih sering terkontaminasi
19
untuk perkembangbiakan L. monocytogenes karena memiliki aktivitas air yang tinggi dan pH >4.2 dan 5.6. Pada keju semi keras juga dapat ditemukan keberadaan L. monocytogenes karena pada tahap akhir pemeraman terjadi peningkatan pH sehingga cocok untuk pertumbuhan L. monocytogenes, sedangkan pada keju keras memiliki kandungan air yang rendah sehingga kondisi ini tidak cocok untuk pertumbuhan L. monocytogenes. Menurut Banks (2006), proses pemeraman, penanganan, dan proses pengemasan untuk beberapa keju semi keras (salah satunya yaitu keju Gouda) dan keju keras dimungkinkan sesekali terdeteksi
L. monocytogenes dengan jumlah sangat rendah pada permukaan keju.
Metode deteksi L. monocytogenes pada penelitian ini menggunakan metode deteksi secara konvensional yang mengacu pada FDA BAM. Metode ini terdiri atas beberapa tahap yaitu pemupukan pada media pengayaan LEB dan selanjutnya dilakukan isolasi pada media agar selektif Listeria spp (Oxford agar). Menurut Donnelly (2002), media pengayaan (enrichment) berfungsi untuk mendukung pertumbuhan bakteri sampai ke tingkat yang dapat dideteksi. Listeria spp mungkin ada pada makanan dengan tingkat yang sangat rendah sehingga media pengayaan harus dapat mengamplifikasi populasi awal bakteri yang rendah sampai pada batas yang dapat dideteksi. Listeria spp mungkin juga ada pada makanan dalam keadaan kerusakan subletal sebagai akibat dari proses pemanasan, paparan asam dan garam, pembekuan serta paparan senyawa sanitasi, sehingga media pengayaan biasanya digunakan untuk pemulihan Listeria spp yang mengalami kerusakan sublethal. Menurut Jeyaletchumi et al. (2010), media isolasi
Listeria spp (Oxford agar) mengandung esculin karena semua spesies dari
Listeria mampu menghidrolisis esculin dan inklusi esculin serta ion besi (ferric ion) dalam media pengayaan atau media plating menghasilkan zona hitam disekililing koloni bakteri. Warna hitam yang terbentuk disebabkan oleh pembentukan kompleks antara ferric iron dengan 6,7-dihydroxycoumarin yang merupakan produk dari pemecahan esculinoleh β-D-glucosidase.
Media pengayaan yang digunakan pada penelitian ini yaitu LEB dengan satu tahap pengayaan. Media LEB yang digunakan merupakan media pertumbuhan yang baik untuk L. monocytogenes karena mengandung tryptone soya broth, yeast extract, potassium di-hydrogen orthophosphate dan disodium hydrogen orthophosphate dengan pH 7.3 ± 0.2. Penghambatan pertumbuhan mikroba selain Listeria spp juga disikapi dengan penambahan zat antimikroba (agen selektif) pada LEB seperti acriflavine hydrochloride yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif lainnya, nalidixic acid yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram negatif dan cycloheximide yang dapat menghambat pertumbuhan cendawan (fungi). Selain LEB, media isolasi Oxford agar juga ditambahkan dengan agen selektif diantaranya yaitu cycloheximide,
colistin sulphate, acriflavine, cefotetan, dan fosfomycin.
Faktor lainnya yang dapat mempengaruhi tidak ditemukannya
L. monocytogenes pada sampel keju Gouda yang diuji yaitu jumlah
L. monocytogenes pada sampel masih di bawah limit deteksi dari metode konvensional yang digunakan pada penelitian ini. Menurut Ryser dan Marth
20
Kajian Aspek Kesehatan Masyarakat Veteriner
Tidak ditemukannya L. monocytogenes pada semua sampel keju Gouda
produksi lokal maupun impor menunjukkan bahwa sampel keju Gouda tersebut relatif aman dari cemaran L. monocytogenes. Menurut SNI 7388:2009 tentang Batas Maksimum Cemaran Mikroba dalam Pangan menyatakan bahwa batas maksimum cemaran L. monocytogenes pada keju yaitu 0 cfu/25 g. Hasil penelitian ini juga menunjukkan bahwa batas maksimum cemaran L. monocytogenes pada sampel keju Gouda yang diuji telah memenuhi standar yang ditetapkan oleh SNI
7388:2009. Selain itu, SNI 7388:2009 juga menetapkan cemaran
L. monocytogenes harus 0 cfu/25 g pada susu segar yang langsung dikonsumsi, susu pasteurisasi dan produk olahan susu lainnya seperti yoghurt, es krim, dan mentega.
Beberapa negara juga telah menetapkan standar batas maksimum cemaran L. monocytogenes pada makanan terutama makanan siap saji (ready to eat) dalam
rangka tindakan pengendalian L. monocytogenes berdasarkan hasil penilaian risiko masing-masing negara. Amerika Serikat, Austria, Australia, Selandia Baru dan Italia merupakan negara yang mensyaratkan makanan yang beredar harus bebas dari cemaran L. monocytogenes (zero tolerance). Negara Eropa lainnya seperti Jerman, Belanda dan Perancis mentoleransi cemaran L. monocytogenes
pada makanan <100 cfu/g pada tahap konsumsi. Negara lainnya seperti Kanada dan Denmark menetapkan toleransi cemaran L. monocytogenes <100 cfu/g pada beberapa makanan dan menetapkan zero tolerance terutama untuk makanan yang masa simpannya panjang yang dapat mendukung pertumbuhan L. monocytogenes
(Ryser dan Marth 2007).
Infeksi L. monocytogenes pada manusia terutama terjadi karena mengonsumsi makanan yang tercemar bakteri ini. Menurut Tompkin (2002),
resiko tertinggi terjadi penularan adalah ketika terjadi pertumbuhan
L. monocytogenes dalam bahan makanan pada saat sebelum dikonsumsi oleh populasi yang rentan (bayi, lanjut usia, wanita hamil, dan penderita
immunocompromised). Dosis infektif L. monocytogenes adalah 100-1 000 sel
terutama bagi kelompok yang rentan (Ray 2005). Keju Gouda yang tercemar
L. monocytogenes dapat menjadi ancaman bagi kesehatan masyarakat. Terdapat dua bentuk gejala klinis yang diakibatkan oleh infeksi L. monocytogenes yaitu
listerial gastroenteritis (listeriosis bentuk saluran pencernaan) dan invasive listeriosis (listeriosis bentuk invasif). Gejala klinis yang ditimbulkan oleh listeriosis bentuk saluran pencernaan diantaranya mual, muntah, kram perut, dan diare. Listeriosis bentuk invasif diakui sebagai foodborne disease yang serius karena tingkat keparahan gejala dan tingkat kematian yang tinggi yaitu 20-30% (Garrido et al. 2008). Gejala klinis yang ditimbulkan oleh listeriosis bentuk invasif yaitu meningitis, meningoensefalitis dan septikemia serta pada wanita hamil akan mengakibatkan abortus, kematian pada bayi yang baru lahir atau persalinan prematur (Delgado 2008; Disson et al. 2008).
21
(2006), kerentanan keju untuk tercemar L. monocytogenes sangat rendah dan hal ini didukung juga oleh sedikitnya data yang melaporkan kejadian listeriosis akibat mengonsumsi keju di Inggris. Selain itu, mayoritas keju yang dijual di Inggris merupakan keju yang dibuat dari susu yang dipasteurisasi.
Kasus listeriosis pada manusia karena mengonsumsi keju telah dilaporkan di berbagai negara dan termasuk dalam kasus luar biasa. Kejadian penyakit ini tergolong lebih rendah (bersifat sporadik) dibandingkan dengan foodborne disease
lainnya, tetapi mendapat perhatian besar karena memiliki tingkat kematian yang tinggi terutama pada kelompok yang berisiko tinggi (Lomonaco et al. 2009). Laporan wabah listeriosis berkaitan dengan keju pada beberapa negara dari tahun 2000-2010 dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3 Wabah listeriosis yang dikaitkan dengan keju pada beberapa negara dari tahun 2000-2010
Keterangan : a gastrointestinal listeriosis Sumber: (Garrido et al. 2010)
Kejadian listeriosis pada manusia maupun prevalensi L. monocytogenes
pada keju khususnya keju Gouda di Indonesia belum tercatat. Data yang ada hanya bersifat terbatas untuk pengembangan ilmu pengetahuan dan belum
sepenuhnya diterapkan ke masyarakat. Penelitian mengenai keberadaan
22
Praktik higiene dan sanitasi dalam industri pembuatan keju Gouda
hendaknya harus tetap dipertahankan. Hal ini disebabkan karena keberadaan
L. monocytogenes yang tersebar luas di alam dan lingkungan membuat kontaminasi keju Gouda oleh L. monocytogenes pada setiap tahapan dalam rantai makanan (mulai dari peternakan sampai ke meja makan) sulit untuk dihindarkan (Hellstrom 2011). Menurut Adzitey dan Huda (2010), strategi untuk mencegah kontaminasi L. monocytogenes dalam makanan tergantung dari penerapan tindakan higiene dan sanitasi. Tindakan ini untuk mencegah kolonisasi, transmisi, dan kontaminasi silang L. monocytogenes antara makanan dan lingkungan.
Kemampuan L. monocytogenes untuk membentuk biofilm pada permukaan peralatan pengolahan dan di lingkungan pengolahan juga membuat praktik higiene dan sanitasi yang benar penting untuk dipertahankan dalam industri pembuatan keju Gouda. Biofilm yang dibentuk oleh L. monocytogenes dapat bertahan selama beberapa bulan atau tahun. Kehadiran biofilm tentunya dapat menyebabkan masalah yang serius terhadap industri pembuatan keju. Biofilm yang melekat pada permukaan peralatan yang digunakan selama proses pembuatan keju dan lingkungan pengolahan dapat terlepas dari permukaan dan dapat mengkontaminasi produk.
Biofilm adalah koloni bakteri yang melekat pada permukaan benda atau lingkungan dan berlindung dalam matriks extracellular polymeric substances
(EPS). EPS merupakan matrik ekstraseluler yang terutama terdiri atas polisakarida (Donlan dan Costerton 2000). Kemampuan L. monocytogenes membentuk biofilm membuat bakteri ini menjadi lebih resisten terhadap desinfektan dan paparan suhu tinggi (Moltz dan Martin 2005). Peningkatan ketahanan biofilm terhadap desinfektan dan paparan suhu tinggi terjadi karena adanya mekanisme pertahanan dari sel biofilm. Adanya senyawa polisakarida ekstraselular yang dihasilkan bakteri dapat memberikan perlindungan sehingga bakteri lebih tahan terhadap desinfektan dan paparan suhu tinggi. Umur sel biofilm juga merupakan faktor yang menyebabkan berbedanya ketahanan sel biofilm terhadap desinfektan. Semakin lama umur sel biofilm maka ketahanannya terhadap desinfektan semakin tinggi karena terbentuknya beberapa lapis biofilm (multilayer) pada substrat. Terbentuknya beberapa lapis biofilm (multilayer) menyebabkan desinfektan tidak bisa menembus bagian dalam biofilm. Desinfektan yang digunakan biasanya hanya mampu mencapai bagian terluar karena sulit masuk ke bagian terdalam biofilm, padahal semua sisi biofilm berpeluang menjadi kontaminan sehingga diperlukan pengendalian khusus. Selain menghalangi penetrasi, kehadiran senyawa polisakarida ekstraselular yang sebagian besar merupakan senyawa
organik, akan menghambat mekanisme kerja senyawa desinfektan (Bal’a et al. 1998). Bakteri di dalam biofilm lebih resisten 10-1 000 kali dibandingkan dengan tanpa biofilm (Monroe 2007).
Tindakan pengendalian terhadap L. monocytogenes di industri pembuatan keju dapat dilakukan dengan penerapan Hazard Analysis and Critical Control Points (HACCP). Program ini harus dilakukan dengan monitoring secara ketat. Tindakan monitoring pada HACCP harus menekankan pada praktik sanitasi, pemrosesan, pengemasan, higiene personal dan program pengujian terhadap
L. monocytogenes secara rutin. Tindakan investigasi harus dilakukan segera untuk
menentukan sumber kontaminasi sehingga dapat mencegah transmisi
23
Manajemen perusahaan harus memiliki kebijakan yang jelas serta diperlukan pelatihan untuk karyawan sehingga mereka memahami pentingnya praktik sanitasi yang tepat. Tindakan pengendalian terhadap L. monocytogenes di pedagang dapat berupa pemantauan suhu refrigerator secara teratur, menghindari pencampuran produk dari berbagai sumber, produk harus dikemas dengan baik dan produk yang kadaluarsa harus segera dibuang (Adzitey dan Huda 2010).
Era globalisasi dan perdagangan bebas antar negara menuntut Indonesia harus waspada terhadap kemungkinan masuknya agen infeksius melalui media pembawa makanan. Pada kenyataannya, pengujian L. monocytogenes belum diterapkan pada pangan yang dilalulintaskan dari/menuju wilayah Republik Indonesia maupun pangan yang diedarkan di dalam negeri. Adanya beberapa negara lain yang telah menetapkan peraturan perundangan untuk pengendalian
L. monocytogenes seyogyanya menjadi pemicu bagi Pemerintah Indonesia untuk menetapkan kebijakan dalam pengendalian penyakit ini. Penetapan kebijakan dalam rangka pengendalian penyakit ini dapat diawali dengan melakukan penilaian risiko L. monocytogenes pada makanan siap saji produksi lokal maupun impor yang beredar di Indonesia.
Menurut Rocourt et al. (2003) dalam studinya melakukan penilaian risiko terhadap L. monocytogenes pada pangan siap saji dengan pendekatan FAO/WHO. Melalui analisis risiko tersebut, penilaian risiko terhadap peluang kontaminasi
L. monocytogenes pada pangan siap saji dapat diperkirakan dan diadaptasikan pada pangan dalam negeri. Diharapkan hasil penilaian risiko tersebut dapat diterapkan pula dalam menjamin keamanan makanan siap saji yang dilalulintaskan melalui perdagangan internasional. Hasil penilaian risiko tersebut kemudian disesuaikan CAC (Codex Alimentarius Commission) dengan melengkapi risiko makanan siap saji terkontaminasi L. monocytogenes sebagai berikut: (1) perkiraan risiko pada kelompok yang rentan (lanjut usia, bayi, wanita hamil dan individu dengan kekebalan rendah) dalam populasi tertentu; (2) perkiraan risiko tumbuhnya L. monocytogenes pada pangan yang mendukung pertumbuhan dan pangan yang tidak mendukung pertumbuhan L. monocytogenes
pada kondisi penyimpanan; dan (3) perkiraan bila pangan tercemar oleh 0 cfu/25 g/ml hingga 1 000 cfu/g/ml atau tidak melebihi batas jumlah cemaran. Hasil penilaian risiko terhadap L. monocytogenes pada makanan siap saji akan memberikan manfaat dalam menentukan kebijakan keamanan keju Gouda
maupun produk pangan siap saji lainnya, tindakan sanitasi dan penetapan baku keamanan pangan di Indonesia.
Pengujian L. monocytogenes pada keju Gouda memiliki nilai strategik yang tinggi apabila dihubungkan dengan risiko yang diakibatkan oleh bakteri tersebut pada manusia dan jumlah impor keju Gouda yang cukup besar di Indonesia. Makanan khususnya keju Gouda yang tercemar L. monocytogenes tidak hanya menjadi ancaman bagi kesehatan masyarakat tetapi dapat menimbulkan kerugian
ekonomi sehingga tindakan pencegahan dan pengendalian terhadap
L. monocytogenes perlu dilakukan. Menurut laporan CDC pada tahun 2000, diperkirakan 76 juta kasus foodborne illness telah dilaporkan dan 5 000 kematian terjadi setiap tahunnya di Amerika Serikat. Sebanyak 2 298 kasus dari jumlah tersebut memerlukan perawatan di rumah sakit dan 499 kematian disebabkan oleh
24
per tahun. Perkiraan biaya tersebut termasuk biaya cacat kronis atau kelainan bawaan, infeksi bayi baru lahir tetapi tidak termasuk komplikasi kronis lainnya, kehilangan waktu untuk bekerja karena harus merawat anak yang sakit, perjalanan untuk mendapatkan perawatan medis, waktu luang yang hilang, rasa sakit, dan penderitaan (Ryser dan Marth 2007).
5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Penelitian ini dapat disimpulkan bahwa dari 30 sampel keju Gouda yang terdiri atas 15 sampel keju Gouda produksi lokal dan 15 sampel keju Gouda
impor tidak ditemukan keberadaan L. monocytogenes. Sebanyak 30 sampel keju
Gouda tersebut relatif aman dari cemaran L. monocytogenes dan telah memenuhi standar yang ditetapkan oleh SNI 7388:2009 tentang Batas Maksimum Cemaran Mikroba dalam Pangan.
Saran
Perlu dilakukan analisis risiko terhadap cemaran L. monocytogenes pada makanan siap saji khususnya keju Gouda produksi lokal dan impor yang beredar di Indonesia. Diharapkan hasil dari analisis risiko tersebut dapat diterapkan dalam menjamin keamanan makanan siap saji khususnya keju Gouda produksi lokal maupun impor yang dilalulintaskan melalui perdagangan internasional.
DAFTAR PUSTAKA
Acha PN, Szyfrez B. 2003. Zoonoses and Communicable Diseases Common to Man and Animals. Ed ke-3. Washington DC (US): PAHO Pr.
Adams MR, Moss MO. 2008. Food Microbiology. Ed ke-3. Guildford (GB): RSC Pub.
Adzitey F, Huda N. 2010. Listeria monocytogenes in foods: incidences and possible control measures. Afr J Microbiol Res. 4(25):2848-2855.
Anonim. 2013. Learn more about 7 most popular cheeses [internet]. [diunduh 2013 Februari 25]. Tersedia pada: http://www.foodworldnews.com/articles/1381/20120327/learn-more-7-popular-cheeses.htm#page2.
Baek SY. 2000. Incident and characterization of Listeria monocytogenes from domestik and Imported Foods in Korea. J Food Prot. 63:86-189.
Bal’a MFA, Jamilah I, Mrshall DL. 1998. Attachment of Aeromonas hydrophyla
