PROD UKSI TERN AK TRAN SGEN I K SEBAGAI UPAYA PEN I N GKATAN
M UTU GEN ETI K TERN AK
RI STI KA H AN D ARI N I
Ju r u sa n Pe t e r n a k a n Fa k u lt a s Pe r t a n ia n Un iv e r sit a s Su m a t e r a Ut a r a
I . PEN D AH ULUAN
Berbagai m et ode unt uk produksi t em ak t ransgenik t elah dit em uk an dan dikem ukakan oleh beber apa penelit i ant ar a lain t r ansfer gen dengan m ikr oinj eksi pada pr onukleus, inj eksi pada ger m inal vesikel, inj eksi gen kedalam sit oplam a, m elalui sper m a, m elalui vir us ( sebagai m ediat or ) , dengan par t icke gun ( part icle
bom bar t m en) dan em bryonic st em cells: Diant ar a m et ode yang t elah dikem ukakan
diat as t er nyat a ber kem bang sesuai dengan kem aj uan hasil pr oduksi dan beber apa kelem ahan yang dij um pai pada m asing- m asing m et ode. Sebagai cont oh produksi t er nak t r ansgenik dengan m et ode r et r ovir al sebagai m ediat or gen yang ak an diint egrasik an m ulai digant ik an dengan m et ode lain y ang t idak m engandung resik o at au efek sam ping dar i vir us/ bakt eri. Beber apa hasil penelit ian m enunj ukkan bahw a m et ode m ikr oinj eksi DNA pada pr onukleus yang ser ing dipak ai oleh penelit i ( Kart , 1989; Bondioli, et . al., 1991; Hill et . al., 1992 ; Gagne and Sir ar d, 1995; Kubisch, et .
al., 1995; Han, et . Al, 1996; Su, et . al., 1998) .
Pr oduksi t er nak t r ansgenik diper lukan dibidang pet er nakan. Sebagai cont oh pada t er nak sapi : panj angny a int erv al generasi, j um lah anak y ang dihasilk an dan lam any a proses int egrasi gen m enj adi t idak efissien bila dilak uk an secara konvensional. Oleh kar ena it u kebem asilan pr oduksi sapi t r angenik sangat dihar apkan kar ena m em ungkinkan unt uk t er j adinya m ut asi gen secar a t iba- t iba ( pada sat u gener asi) dan lebih t er ar ah pada gen yang diinginkan. Per for m ans yang dihar apkan dar i sapi t r ansgenik adalah sapi yang m em punyai t ingkat kesubur an t inggi, efisien dalam pem anfaat an pakan , kuant it as dan kualit as pr oduksi yang lebih t inggi ser t a lebih r esist en t er hadap penyakit .
Per m asalahan pada t em ak t r ansgenik adalah r endahnya ket ur unan ( offspring) dar i t er nak t r angenik yang dihasilkan baik pada hew an penelit ian m aupun pada t er nak m am alia ( sekit ar 1- 4% ) yang nant inya, m enj adi pr ior it as peningkat an pr oduksi t ernak dibidang pet er nakan.
Rendahnya ket ur unan pada pr oduksi t em ak t r ansgenik har us dilihat dar i ber bagai fase pr oduksi, m engingat panj angny a prosedur y ang harus dilalui. Oleh k arena iru dalam m ak alah ini ak an dibahas m engenai m et ode dan pada m akalah ini.
I I . TUJUAN PROD UKSI TERN AK TRAN SGEN I K 1 . M e n in gk a t k a n pr odu k t iv it a s t e r n a k
dalam j um lah besar dalam susu dom ba t r ansgenik . Di bidang pet er nak an t r anfer gen ber t uj uan unt uk m eningkat kan produkt ivit as t er nak seper t i konver si pakan, r at aan per t am bahan babet badan, m er eduksi kandungan lem ak , m eningk at k an kualit as daging, susu, w ool secar a cepat sehingga dapat m engurangi biaya pr oduksi yang har us dit anggung konsum en ( Pur sel dan Rexr oad, 1993) . Kar akt er dar i pr odukt ivit as t er nak dikont r ol oleh sej um lah gen yang dapat dipisahkan dar i genom . Hasil pem et aan genom dar i suat u spesies t er nak m em bant u dalam pem ilihan sat u at au beber apa gen yang diinginkan dan m engunt ungkan secara ekonom i.
Beber apa gen yang m em punyai pat ensi unt uk pem bent ukan t er nak t ransgenik
a . Gr ow t h H or m on ( GH )
Sum ber : Pur sel dan r exr oad ( 1993)
kont r ol t et api kandungan lem aknya lebih r endah. ( Nancar r ow et . al 1991) Pada dom ba t ransgenik hilangny a lem ak t ubuh dapat m engak ibat kan hiper glisem ia dan glkosur ia ( Rexr oad et . al., 1991) . Peningkat an GH m engakibat kan sej um lah pat ologis t er m asuk degener at if ginj al. Pada babi peningkat an GH m engakibat kan gast r ic ulcer s dan infert ilit as ( Eber t et . al., 1991) .
Gam bar 1. Per bedaan rat aan per t um buhan, efisien pakan dan t er nak kar kas pada babi t r ansgenik ( pur sel,1990) .
Gam bar 2. Rat aan per sent ase lem ak int r am uskular ( Nancar r ow , 1991)
b. Gr ow t h H or m on Re le a sin g Fa ct or ( GRF) .
Dom ba dan babi t ransgenik t elah diproduksi dengan m enggunakan sekuens pr om ot or MT dan ALB. Hanya 14% dom ba dan 29% babi yang dapat m engekspresikan gen MT- hum an gr ow t h hor m on r eleasing fact or ( hGRF) ( Pur sel
et .al. 1990) .Konsent r asi GRF pada plasm a babi t r ansgenik sekit ar 130 - 380 pg/ m l
[image:3.612.193.446.171.330.2] [image:3.612.190.448.377.543.2]Tabel 2. Konsent r asi GRF dan GH pada kont r ol dan hGRF pada babi dan dom ba t r angenik
Pigs Sheep Horm one
Cont rol MT- hGRF ALB- hGRF Cont r ol MT- hGRF ALB- GRF GRF < 20 130 - 380 400 - 8000 < 30 502 264- 683
GH 14 ± 5 11 - 16 8 - 11 5 5- 43 30- 50 Sum ber : Pur sel dan Rexr oad ( 1993)
c. I n su lin lik e Gr ow t h Fa ct or I ( I GF I )
Em pat babi dan 7 sapi t r ansgenik dipr oduksi dengan m em asukkan gen I GF I ( Hill et al.1992) , t er nyat a hanya hanya sat u babi yang dapat m engekspr esikan peningkat an level I GF I .
d. St im u la t ion of m u scle de v e lopm e n t
Sut r ave et .al., ( 1990) m elapor kan bahw a t ikus m am pu m engekpr esikan gen ayam cSK! yang secar a phenot ip m enunj ukkan adanya hiper t r opi pada ot ot dan m er eduksi lem ak t ubuh. Gen yang dit r ansfer kedalam t ikus m engandung pr om ot or
Mouse Sar com a Vir us ( MSV) LTR yang difusikan unt uk m engakt ifkan cSKI cDNA.
Pr oduk dar i gen yang dit r ansfer adalah pr ot ein yang m engandung 448 asam am ino y ang berada dalam int i- int i ot ot . Gen cSKI t elah dicobakan dot r ansfer pada genom e babi ( Pur sel et . al., 1992) . Hasilnya m enunj ukkan perbedaan phenot ip diant ar a t em ak y ang diuj i ant ara lain hipert r opi ot ot pada pundak dan paha.
Pr oduksi w ool j uga m enj adi pr ior it as pada dom ba. Cyst ein m er upakan asm am ino yang m em punyai per an pant ing dalam pr oduksi w ool. Nam un penam bahan
Cy st ein t idak dapat m eningkat kan pr oduksi w ool kar ena degr adasi r um en.
Dilapor kan Dam ak ( 1996) dom ba t r ansgenik m engekspr esikan I GF I dapat m eningkat kan ber al wool. Gen yang dit r ansfer m engandung pr om ot or ker at in t ikus yang t er ikat pada I GF I cDNA. Su et al., ( 1998) m engem ukakan dom ba t r ansgenik hasil induksi gen cDNA I GF I yang dikendalikan oleh pr om ot or ker at in t ikus dapat m eningkat kan 17% pr oduksi wool dibanding dengan saudar a seinduk yang nont r ansgenik.
2 . M e n in gk a t k a n k e se h a t a n t e r n a k
Aplik asi dari t ek nologi t ransgenik j uga digunak an unt uk m em perbaik i kesehat an t er nak. Beber apa pendekat an dilakukan unt uk m eningkat kan r esist ensi t er nak t erhadap suat u penyakit dan pem bent ukan ant ibodi.
Resist ensi penyakit bisa t er j adi secar a alam i m aupun induksi ant ibodi. Tikus m engandung gen allel aut osom dom inan Mx1 yang t ahan t er hadap vir us influenza. I nt er fer on m enst im ulasi pr oduksi pr ot ein Mx yang m enj adi pr om ot or ket ahanan t erhadap infek si v irus. Pada sapi t ransgenik I m m unoglobin A ( lgA) t erdet ek si dalam ser um sekit ar 650 µg/ m l. Pada dom ba t r ansgenik I gA dij um pai pada lim posit .
3 . Bior e a k t or u n t u k pr odu k - pr odu k biom e dis
a . H u m a n a lph a 1 a n t i t r ipsin ( h a AT)
Weight et . al., ( 1991) m elapor k an t ingginya konsent rasi hαAT pada susu dom ba t r ansgenik. Konsent r asinya ber kisar 1.5 - 37.5 g/ l. Dom ba set elah ber pr oduksi t idak m enunj ukkan sym t om p. Akt ivit as dar i hαAT y ang t elah dipur ifik asi dar i susu dom ba m enghasilkan t r ansgenik sam a dengan hαAT pada plasm a dar ah m anusia. Bila m anusia defisiensi ak an hαAT m aka akan m ender it a em physem a. hαAT dapat diekst r aksi dar i plasm a dar ah m anusia, t et api kar ena kebut uhan unt uk pasien cukup besar ( 200 g per t ahun) m enj adi t idak m encukupi dan m ahal.
b. H u m a n La ct ofe r in ( h LF)
Kr im penfor t et . al. ( 1991) lelah ber hasil m em pr oduksi t em ak t ransgenic
dengan kom posis pr om ot or αSI casein dan sekuens hLF. Meade et al., ( 1990) m ent r ansfer αSI casein 15 kbp dapat diekspr esikan pada j ar ingan spesifik t ikus t r ansgenie. Gen αSI casein dapat j uga didet eksi pada j ar ingan plasent a pada sapi per ah dan hanya m enghasilk an hlF pada saat lakt asi.
c. H u m a n Pr ot e in C
Velander et a.al ( 1992) m engiduksikan cDNA pr ot ein C m am m ae ( hPC) k edalam WAP unt uk m em produk si babi t ransgenic. Babi ini m enghasilk an susu y ang m engandung lebih dar i 1 g hPC/ lit er susu. Akt ivit as biologi dar i hPC r ekom binan ekuivalen dengan pr ot ein C dar i plasm a m anusia. Pr ot ein C m engandung per an dalam r egulasi hem ost asis. Bila t ubuh defisiensi prot ein C akan m engalam i t rom bosit
( int r av askular blood clot s) . Pr ot ein C ber per an dalam m encegah pem bekuan dar ah.
Kebut uhan set iap t ahun 96 kg dan m enj adi pr oyek di Am er ik a.
d. Tissu e Pla sm in oge n Act iv a t or ( TPA)
Pr om ot or WAr t ikus digunakan unt uk m engespr esikan beber apa hTPA cDNA pada kam bing t r ansgenik. Ebert et al., ( 1991) m engem ukakan bahw a TPA m er upakan agen ant i pem bekuan dar ah, digunakan unt uk pasien yang m engalam i ser angan j ant ung. Konsent r asinya sangat r endah dij um pai pada susu dan ekspr esi hTPA t idak ber pengar uh pada produksi susu dan kesehat an kam bing t r ansgenik . Kam bing t r ansgenic t elah dipr oduk si dengan pr om ot or 13 casein yang diikut kan dalam WAP dan m enghasilk an konsent r asi hTPA yang lebih t inggi. Kam bing m engalam i agalact ic set elah beranak dan ini m erupak an hasil ek spresi y ang spesifik .
e . H u m a n H a e m oglobin
Haem oglobin m er upakan pr ot ein biom edik yang t idak dapat disint esa oleh kelenj ar m am m ae t et api dapat dipr oduksi oleh j ar ingan lain dar i t em ak t r ansgenic dan ber ada dalam dar ah ( Sw anson et al., 1992 t elah m em pr oduksi t iga babi t r ansgenic yang m engandung gen α dan β globin. Hasil m enunj uk an 15% dar i sel dar ah m er ah m engandung hHG pada hem oglobin babi. Hem oglobin dapat diekst r aksi dar i sel- sel dar ah m er ah baik dar i m anusia m aupun babi k em udian dipisahkan dengan krom at ografi. Hem oglobin m ur ni dapat dim odifikasi secar a kim ia yait u dengan cara polim er isasi. Pr oduksi hH dar i t em ak t r ansgenik digunakan nt uk t r ansfusi dar ah.
I I I . TEKN I K TRAN FER GEN
al., 1990) . Met ode yang dikem ukakan Dish Gar don ( 1994) ant ar a lain:
m enggunakan sper m a sebagai m edia t r ansfer gen, m ikoinj eksi pada pr onukleus, dengan m enggunakan par t icle gun ( Par t icle bom bar dm ent , m edia vir us, inj eksi pada
ger m inal vesicle, inj eksi pada sit oplasm a oosit ( Gam bar 3 ) .
Gam bar 3. Kem ungkinan m et ode t ransfer gen pada sapi ( Gar don,1994)
Ber bagai m et ode diat as akan dibahas dibaw ah ini sat u persat u y ait u :
1 . Spe r m a t oz oa se ba ga i pe m ba w a ge n .
Sperm at ozoa m erupak an sarana seluler y ang spesifik dirancang unt uk m ent r ansfer DNA asing kedalam oosit . Met ode sper m a sebagai m edia t r anfser gen dit em ukan oleh Br acket t di Am er ika Ser ikat . Penem uan ini m enar ik m inat penelit i dari I t alia ( Gandolfi et . al., 1989) . Mer eka m endem onst r asikan sel sper m a t ikus yang berasal dar i epididim is sebagai v ek t or unt uk m em baw a gen asing k edalam oosit . Pengik at an gen oleh sperm a secara opt im al bila sperm a dalam k eadaan m ot il dan konsent rasi DNA cukup t inggi. Br inst er et . al., ( 1989) m elapor kan penelit ian t r ansfer gen dengan sper m a sebagai m edia m enghasilkan seekor t ikus t r ansgenik dar i 1300 t ikus yang dicoba. Di New Zealand, Pet er non et . al.,( 1990) m engem ukakan wakt u yang t epat unt uk r esor psi DNA set elah dilak uk an k apasit asi t er hadap sper m a. Di Canada Gagne et . al 1991) dengan m enggunakan elekt ropor asi m enunj ukkan DNA asing dapat st abil didalam sper m a dan lebih m engunt ungkan kar ena dapat m engur angi t r aum a ak ibat m ikr o inj eksi ( Gam bar 4) . Di Aust r alia, Ar kinson et . al., ( 1991) m endem onst r asikan sper m a sapi dapat m engikat DNA asing m eskipun keber hasilannya cukup r endah.
[image:6.612.164.458.129.284.2] [image:6.612.154.459.531.697.2]Yang sangat m enar ik adalah pengikat an ant ar a sper m a dan DNA t idak t er j adi secar a acak . Dalam beberapa spesies m oluk el DNA m elekat pada sat u lokasi dibagian belakang akr osom kepala sper m at ozoa. Seper t inya t er dapat suat u r esept or pada bagian belakang akr osom yang ber fungsi sebagai m edia int erak si ant ara DNA dengan sel sper m a.
Cair an sper m at ozoa diduga m engham bat perm iabilit as m em br an sel sper m a dengan DNA. Ber dasar kan pengam at an sperm a hasil ej ak ulasi lebih perm iabel dibanding sperm a dari epididim is ( Pinker t , 1994) . Didukung oleh penelit ian pada m am alia m enunj uk kan bahw a spennat ozoa yang diej akulasik an m em ilik i sifat im perm iabel t erhadap DNA asing k ecuali j ik a sem inal plasm a dihilangk an.
2 . M ik r oin j e k si pa da pr on u k le u s
Kem am puan genet ik t er nak secar a nyat a dapat dim anipulasi m elalui pem bedahan m ikr o pada em br io st adium aw al ( em br io sat u sel) . Per t am a sekali m et ode m ikr oinj eksi dilakukan oleh Gur don ( 1963) pada t elur am phibi dengan m enginj eksikan sit oplasm a kedalam zygot , nam un hasilnya t idak ber pengar uh pada per kem bangan em br io selanj ut nya. Kem udian dicoba lagi dengan car a m enginj eksi m RNA pada oosit am phibi, t er nyat a m am pu m engkode pept ida. Penelit ian- penelit ian lain m ulai m enyusul dengan m enggunakan hew an labor at or ium t er ut am a em br io m encit dan selanj uynya ber kem bang pada em brio m am alia ( Pinker t , 1994) .
Pada m am alia dialoprkan aleh Sr eenan dan Mc Ev oy et . al., ( 1989) dar i 11 r esipien dilahir kan dua puluh sapi yang t idak m enunj ukkan int egr asi gen. I nj eksi m olek ul DNA k edalam pronuk leus j uga sek aligus m em pelaj ari t ransk ripsi dan k ont rol t ranslasi selam a perkem bangan em brio. Beber apa penelit ian m enunj ukkan bahw a pada em br io st adium aw al m am pu m ent r anskrip gen baru y ang diinj ek sik an k edalam pr onukleus ( Hill, et . al, 1992) . Met ode m ikr oinj eksi DNA pada pr onukleus dapat dilihat pada Gam bar 5. DNA langsung diinj ek sikan pada pr onukleus j ant an dengan kandungan 200 - 500 copi susunan gen.
Kem udahan m ikr oinj ek si pada beber apa spesies sangat ber var iasi : pada t ikus r elat if lebih m udah dibanding pada em br io sapi kar ena oosit m engandung lem ak. Pada em brio sapi m ik roinj eksi DNA pada int i sulit dilak uk an bila t idak dilak uk an dibaw ah m ikr oskop : Differ ent ial I nt er fer ence cont r ast m ycr oscopy ( DI G) . Zy got har us disent r ifugasi pada t ube 2 m l m ik rosent rifus selam a 8 m enit dengan kecepat an 15.000 9 ( Kay et . al, 1991; Brem el et . al, 1996) . Selam a sent r ifugasi gr anula lem ak akan m igr asi pada sat u sisi em br io sat u sel dan pronukleus m enem pat i pada posisi dit engah em br io. Keber hasilan pem isahan kom ponen selular dit andai dengan visualisasi pr onukleus ( Kar l, 1989 ; Wall, 1996) . Han et . al ( 1996) m elakukan penelit ian dengan konsent r asi DNA 4 /µg/ m l dalam buffer 10 m M t r isHCI ( pH 8) dan
kecepat an 15.000 g ( Eppendor f m icr ocent r ifuge) . Mat er i DNA langsung diinj eksikan pada pronuk leus dengan selang w ak t u 21 - 25 j am set elah fert ilisasi, hasil penelit ian m enunuj kkan 4.4% ( 131/ 2931) em br io yang diinj eksi dapat ber kem bang m enj adi blast osit ( Tabel 3) .
Tabel 3. Perk em bangan em brio sat u sel sapi set elah inj ek si DNA
No. of em br yos inj ect ed
No. of em br yos Surv iv ing ( % ) a
No. of em br yos Cleav ing ( % )b
No. of em br yos To blast ocyst s ( % )C 2931 2505 ( 85.5) 1804 ( 72.0) 131 ( 5.2) Sum ber : Han et . al., ( 1996)
Penelit ian lain dilak uak an oleh Jura et . al., ( 1994) , m at er i DNA yang diinj eksikan bGH- M8 pada 639 zygot . Penam pakan pronukleus dilakukan dengan sent r ifugasi 14.000 g selam a 5 m enit . Hasil penelit ian m enunj ukkan per sent ase em br io yang ber kem bang m enj adi blast osit vs kont r ol ( 69,6 vs 34,5) . .
Kr im penfor d et . al., 1991 m enghasilkan duo sapi t r ansgenik dar i 2470 oosit yang dikoleksi. Hanya 1154 yang m enunj ukan pr onukleus dan diinj eksi dengan DNA. 287 em br yo hat ching ( 28% ) don 129 em br io dit r ansfer pada 99 r esipien, 19 ekor anak sapi lahir dan hanya 2 ekor sapi yang ber hasil ( 1,55% dar i em br yo yang dit r ansfer ) .
Pinker t ( 1994) m engem ukakan bahw a beber apa fakt or dapat m em pengar uhi k eberhasilan m ek roinj ek si DNA pada pronuk leus ant ara lain:
1. I nt egrasi fragm en DNA linier lebih efisien dibandingk an DNA y ang super coil.
2. Buffer unt uk m ikr oinj eksi t er ut am a pH ( disar ankan 10 m M Tr is, pH 7.4
dengan 0.1 0.3 m M EDTA.
3. Mikr oinj eksi DNA pada pr onukleus j ant an lebih efisien dibandingkan dengan pr onukleus bet ina.
4. Mikr oinj eksi DNA pada pr onukleus lebih efisien dibandingk an dengan inj eksi pada sit oplasm a.
3 . I n j e k si ge n pa da ge r m in a l v e sik e l
Visualisasi dar i pr onukleus pada sapi sangat sulit dan per t u per t ak uan k husus y ait u sent rifugasi. Pada m et ode ini penam pak an germ inal v esik el m esk i agak sulit m enent uk an w akt unya t api penelit ian di Polandia ber hasil dilakukan oleh Jur a et . al. ( 1990) dengan dim ana DNA dilar ut kan dalam lar ut an buffer dan diinj eksikan pada m at ur e oesit . Gagne et . al., ( 1991) m elapor kan bahw a inj eksi pada germ inal vesik el bisa m enj adi alt ernat if bila dit em uk an w akt u y ang t epat unt uk inj ek si dan ini spesifik unt uk set iap spesies.
4 . I n j e k si ge n pa da sit opla m a
Beber apa penelit i m engem ukakan kem ungkinan inj eksi DNA kedalam sit oplasm a. Galli et . al., 1991 m elakukan m et ode ini pada sapi, dom ba dan babi y ait u inj ek si DNA pada st adium berbeda y ait u pada oosit dan zygot , dan hasil y ang diper oleh sangat r endah per sent senya. I nj eksi gen pada sit oplasm a banyak dilak uk an pada ik an.
5 . Pa r t icle gu n
keunt ungan yait u m udah dit angani dengan sat u kali t em bakan akan m enghasilk an beber apa sasar an , par t ikel dapat m encapai sasar an yang lebih dalam dan dapat digunakan pada ber bagai m acam j ar ingan ( Pot r ykus, 1996) .
6 . V ir u s se ba ga i m e dia
Seper t i pada m ikr oinj eksi DNA, int egr asi gen pada v ieur lebih cepat k ar ena kem am puannnya m ent r anskr ipsi gen. Efekt ivit as penggunaan vir us t elah dicoba pada em br io t ikus pada sapi per t am a sekali dilakukan oeh Kim et . al., ( 1993) dengan Murine Leuk em ia Virus ( MLV) . I nfek si t idak hanya pada t r yphect oder m t api sam pai I CM. Kubisch et . al., ( 1995) m enginduksikan m at er i DNA yang m engandung pr om ot or SV40 at ao pb Act inLacZ yang dikendalikan oleh bakt er i bet a galat osidase. Pada sapi per ah induksi gen bGH t er bukt i dapat m eningkat kan pr oduksi susu sebanyak 18% ( Kar 1, 1989) . Transkr ipsi j aringan spesifik m am m ae dari Mouse
Mam m ar y Tum or Virus ( MMTV) dapat m enghasilk an susunan Long Ter m inal Repeat
( LTR) pada genom . Gen dengan st r ukt ur c- m yc yang ber ikat an dengan pr om ot or MMTV dan diinduk sikan pada em brio t ik us m enghasilk an t ik us t ransgenik y ang m engalam i adenocar cinom a pada m am m ae.
I V . PROSED UR PROD UKSI SAPI TRAN SGEN I K
Pr oduksi sapi t r ansgenik sangat t er gant ung pada kualit as em br io sat u sel yang akan di inj eksi. Bila em br io diper oleh secar a in vivo m aka pr osedur diaw ali dengan super ovulasi t er nak donor ( unt uk m endapat kan banyak em brio) ,koleksi zigot ( em br io sat u sel) , m ikr o inj eksi DNA pada em brio, k ult ur em brio sam pai fase blast osis , dit r ansfer pada t em ak r esipien dan diper oleh sapi t r ansgenik ( Bondioli
et .al., 1991) .
Pada produk si em brio secara in v it ro dim ulai dengan k olek si oosit . Oosit diaspir asi dar i folik el ber diam et er 2 - 5 m m dengan m enggunakan j ar um ber ukur an 18 G. Oosit dicuci dengan 3 kali dengan m edium aspir asi 10 m M TALP- HEPES dan TCM- 199 ( dengan gar am Eagle's dan L glut am in) dit am bah dengan 0.3% BSA dan 2 m M NaHC03, sedangkan unt uk I VM digunakan TCM 199 yang t elah diim buhi dengan horm on FSH dan est radiol. Kult ur oosit dilak uk an selam a 22 - 24 j am dalam ink ubat or suhu 39°C dan 5% CO2. Sper m at ozoa yang akan digunakan unt uk
fer t ilisasi diper siapkan dengan m et ode sw im - up dan konsent r asi akhir sper m at ozoa 1.6 x 106/ m l sper m a m ot il ( Rexr oad and Har old, 1994) .
I VF dilak uk an dalam m edium BSA, set elah 18 j am dihar apkan t elah t er j adi fert ilisasi, k em udian div ort ex selam a 2 m enit dalam 2 m l m edium TALF- HEPES. Pada t ahapan selanj ut nya m ikr o inj eksi DNA. Han .et . al., ( 1996) m elak ukan penelit ian dengan fr agm en pBLi ( 5,5 Kb) yang m engandung pr om ot or gen β casein, lact ofer in
dan SV40. Met ode yang digunakan m ikr oinj eksi pada nukleus, diaw ali dengan penam pakan pr onukleus yang j elas dan em br io sat u sel t elah bebas dari kum ulus oophor us. Set elah disent r ifugasi dalam m ikr osent r ifuse ( 15000 G) selam a 7 m enit , em brio diinj ek si dengan larut an y ang m engandung DNA t epat pada pronukleus yait u sekit ar 21- 25 j am set elah insem inasi buat an. Pem bengkakan pr onukleus m engindik asik an k eberhasilan inj ek si m at eri DNA, Hasil penelit ian Han, et . al, ( 1996) m enunj uk kan r at aan zigot hasil lVF yang diij eksi dengan DNA 85,5% m engalam i pem bengkak an pr onukleus ( set elah sat u j am inj eksi DNA) . Rat aan em br io sapi yang ber kem bang m enj adi 2 - 8 sel 72,0% ( 1804/ 2505) dan yang m am pu m em bent uk blast osit sekit ar 5,2% ( 131/ 2505) .
Tahapan selanj ut ny a kult ur dar i em br io hasil inj eksi DNA. Ada 2 car a yang bisa dilak uk an yait u m elalui induk perant ara ( int er m ediat ed host ) m aupun in vit r o dengan
m enem ukan kem bali 56% em br io yang t elah dit r ansfer dan 50% dar i yang dit em ukan dapat ber kem bang sam pai fase blast osis. Tuj uh har i set elah t r ansfer lebih dar i separ uhnya ber kem bang m enj adi elongat ed bast ocyt s, car a kedua yait u dengan
in Vit r o cocult ur e, ant ar a lain dengan m enggunakan sel - sel gr anulosa ( Got o, et . al 1992) dan sel- sel ov iduct ( Bondioli, et . al 1991) . Pada aw alnya par a penelit i
m engkult ur em br io yang t elah diinj eksi DNA dengan m edium GR1aa ( Rosenkrans, 1993) , t et api hasil penelit ian m enunj uk r endahnya em br io hasil inj eksi yang ber kem bang m enj adi blast osit . Pada per kem bangan selanj ut nya m edium kult ur em br io m engar ah pada co- kult ur yang ber asal dar i r ingan fibr oblast . Got o, et . al ( 1992) m engem ukakan bahw a dengan m enggunakan co- kult ur : rat aan per kem bangan em br io yang t elah diinj eksi DNA sam pai t ahap blast osit m eningkat dar i 4% ( 4/ 98) m enj adi 11% ( 12/ 108) . Hal lain yang per lu diper hat ikan adalah per iode kult ur dar i em br io sapi y ang t elah diinj ek si DNA" Monson, et . al., ( 1992) m em per oleh r at aan kebunt ingan t inggi dar i em br io sapi yang t elah dik ult ur selam a 7 har i. Hal yang sam a dilakukan oleh Han, et . ( 1996) j uga m em per oleh hasil r at aan kebunt ingan t er t inggi dar i em brio sapi y ang dik ult ur selam a 7 har i dibandingkan dengan em br io r ang dikult ur selam a 8 har i ( Tabel 4) .
Tahapan t er akhir adalah t r ansfer em br io sapi pada t er nak r esipien. Em br io yang t elah ber kem bang m em bent uk blast osit baik secara in v iv o ( m elalui induk per ant ar a) m aupun yang dikult ur secar a in v it r o dit r ansfer pada t er nak r esipien yang t elah disinkr onisasi sebelum nya i( Eyest one, 1999) . Penelit ian yang dilakukan Han, et . al., ( 1996) dengan car a m engklasifikasikan blast osit yang ber kem bang m enj adi 4 gr ade ( hanya kualit as fair - ex celent ) dan dit r anfer pada t er nak resipien. Rat aan k ebunt ingan y ang diperoleh dari t r anfer blast osis dapat dilihat pada Tabel 5.
Tabel 4. Rat aan Kebunt ingan dari Blast osis Sapi Hasil lnj ek si DNA y ang Dik ult ur Secar a in Vit r o
Day of Cult ur ea No. of em br yos t ransferred
No. of em br yos / Recipient s
Pr egnancy rat e ( % )
Day 6 Day 7 Day 8 11 29 19 1/ 11 10/ 29 7/ 19 9.0 34.5 36.8 Sum ber : Han, et . al., ( 1996)
[image:10.612.90.525.549.660.2]Rat aan kebunt ingan yang diper oleh dar i em br io yang t elah diinj eksi DNA yang dikult ur selam a 6 dan 7 har i secar a st at ist ik t idak m enunj ukkan per bedaan nyat a. Dat a- dat a yang dit unj ukkan t idak m ener angkan lebih lanj ut j um lah ket ur unan t rangenik yang dihasilk an dari sej um lah em brio hasil inj ek si DNA.
Tabel 5. Rat aan Kebunt ingan sapi ber dasarkan kualit as Blast osit yang Diinj eksi DNA Em brio Qualit y No. of em bry os
t ransferred
No. of em br yos / Recipient s
Pr egnancy rat e ( % )
Ex cellent Good Fair Tot al 25 28 6 59 10/ 25 7/ 28 1/ 6 18/ 59 40.0 25.0 16.7 30.5 Sum ber : Han , et ,al ( 1996)
sebagai per ant ar a kem udian dit r ansfer pada t er nak r esipien. I dent ifik asi gen yang yang diinj eksikan dilakukan pada ket urunan t er nak t r ansgenik dengan PCR, dilanj ut kan dengan analisa DNA yang ber int egr asi unt uk m enget ahui kem am puan t r anskr ipsi dar i m RNA dan produksi pr ot ein. Eyest one ( 1999) m engem ukakan bahw a pr oduksi sapi- sapi t r ansgenik secar a invit r o dapat m er eduksi biaya- sekit ar 50 - 60% bila dibandingkan dengan aplikasi pem uliaan secar a konvensional.
Pada per kem bangan selanj ut nya t elah dikem ukakan keber hasilan gener asi t ernak t ransgenik m elalui t ransfer som at ik int i pada dom ba ( Schiek e, et . al., 1997) dan sapi ( Cibelli, et . al., 1998) . Pendekat an t eknologi ini selangkah lebih m aj u sebagai upaya m eningkat kan efisiensi pr oduksi t em ak t r ansgenik . Penguj ian per for m ance dar i gener asi per t am a dan kedua t er nak t r ansgenik dengan m et ode t r ansfer int i som at ik t elah dilakukan oleh Su, et .al.,( 1998) . DNA yang diinj eksikan m engandung gen I GF- I cDNA yang t er ikat pada pr om ot or ker at in t ikus. Hasil penelit ian m enunj uk kan adanya peningkat an pr oduksi dan kualit as w ool.
Gam bar 7. : Pr oduk Sapi Tr ansgenik dengan Met ode Tr ansfer int i Som at ik ( Niem ann and Kues,2000)
[image:12.612.170.442.90.549.2]sehingga sangat m em ungkinkan hanya gen- gen yang diinginkan yang akan m engalam i fusi dan ber kem bang m enj adi blast osit . Kar ena gen- gen yang diingink an t elah div er ifik asi pada t ahap aw al m aka ekspr esi gen set elah fusi lebih opt im al dan m em buka peluang lain yait u pem buat an kloning sebelum blast osit dit r ansfer pada t er nak r esipien sehingga baik secar a kualit as dan kuant it at if ket ur unan t ernak t r ansgenik lebih m eningkat .
V . D ETEKSI TERN AK TRAN SGEN I K
I nt egr asi dan ekspr esi gen yang dit ranfer dapat dilihat det eksi m elalui 3 t ahapan :
1 . D e t e k si k on st r u k si ge m de n ga n Sou t h e r n blot An a ly sis
Pada saat t er nak lahir , DNA langsung diisolasi dar i j aringan at au darah spesim en. Sulit unt uk m endet eksi DNA yang m em punyai ber at m olekul t inggi. I solasi DNA dilakukan dengan r et r ik si enzim endonuklease dengan elekt r ofor esis gel agar ose unt uk m em isahkan fr agm ent DNA. DNA dit r ansfer pada nit r oselulosa at au m em bran nilon. ( Gam bar 8) . Peny aring dihibridisasi dengan probe y ang dilabel dengan radioak t if. Pelabelan fragm ent DNA dilakukan dengan dUTP. Genom e DNA dapat dibaca 10 - 16 j am set elah dit ansfer secar a lengkap pada nit r oselulosa.
2 . N or t h t e m Blot An a ly sis
Met ode ini digunakan unt uk m enget ahui konst r uk si RNA yang m em punyai barat m olek ul lebih basar. Analisa dilak uk an dengan cara isolasi RNA dari j _r ingan yang m em punyai ekspr esi gen yang paling t inggi. Unt uk m endapat kan RNA dilak uk an dengan denat urasi prot ein oleh guanidinium isot hiocy anat . Elek t roforesis RNA dilakukan dengan gel agar ose at au dit r eat m ent dengan Dim et hylsulfoxide ( DMSO) kem udian dit r ansfer pada nit r oselulosa at au sar ingan nilon ,dan selanj ut ny a sam a dengan pengam at an pada Sout hern Blot Analysis. Pem banding yang digunakan pr im er yang m engadung j um lah, st r ukt ur dan rat aan dar i sint esis RNA S1 nuklease.
3 . Tr a n la t ion An a ly sis
Tr anskr ipsi dar i int egr asi gen dapat diuj i dengan analisa t r anslasi, biasanya pr oduk yang dihasilk an RNA adalah prot ein. Beber apa t es kolor im et r i dapat digunakan unt uk m engukur kuant it as pr ot ein. Analisa dengan m et acle elekt r oforesis gel agar ose yang diw ar nai dengan Com m assie blue. Teknik lain adalah t r anfer pr ot ein pada nit r oselulose at au sar ingan nilon kem udian dilakukan West er n Blot Analysis. Unt uk kepent ingan klinik ser ing dilakukan ELlSA unt uk m engukur ekspr esi gen ( Br em , 1989) .
1. I nt egr asi dar i gen yang dit r ansfer ada pada sem ua sel- sel som at ik. 2. Tr ansm isi dar i gen yang dit r ansfer st abil pada sem ua ket ur unan 3. Ekspr esi dar i gen yang dit r ansfer DNA> m RNA > pr ot ein.
4. Akt ivit as biologi dar i pr ot ein hasil ekspr esi gen yang dit r ansfer .
V I . KESI M PULAN
Dar i ur aian bahasan diat as m aka dapat disim pulkan bahwa :
1. Pem bent ukk an t ernak t r ansgenik m er upakan salah sat u car a m ut asi gen secar a t iba- t iba pada sat u gener asi dan t er konsent rasi pada gen yang diingink an.
2. Tuj uan pem bent ukan t em ak t ransgenik bisa dikaukan dengan ber bagai m et ode yait u m eningkat kan pr odukt ivit as t er nak t r ansgenik , m eningkat k an r esist ensi penyakit pada t er nak dan yang paling popular adalah sebagai bior eakt or pr oduk- pr oduk biom edis.
3. Met ode t r anfer gen yang ser ing digunakan unt uk pem bent ukan t er nak
t r ansgenik adalah m ik roinj eksi DNA pada pr onukleus dan dengan m ediat or spem at ozoa.
4. Analisis t erhadap int egrasi gen y ang dit ransfer dapat dilak uk an analisa
Sout her n Blot ( unt uk DNA) , Nor t her n Blot Analysis ( unt uk RNA) dan West er n Blot Analysis unt uk pr ot ein yang dihasilk an.
D AFTAR PUSTAKA
Bondioli, KR, M.E. West husin dan C.R Looney 1990. Pr oduct ion of ident ical bovine offspr ing by nuclear t r ansfer . Ther iogenology. 33 : 165 - 174.
Bondioli,K.R, Bier y, KA., Hill, KG., Jones, KB. and De Mayo, F.G., 1991. Pr oduct ion of Tr ansgenic Cat t le by Pronuklear I nj ect ion in " Transgenic Anim als. pp. 265 - 273.
Br em el, RD. 1996. Pot ent ial Role of Tr ansgenesis in Dair y Pr oduct ion and Relat ed Ar eas. Ther iogenology., 45 : 51 - 56.
Bonst er , RL. , E. P. Sandgr en, RD. Palm it er . 1989. No sim ple solut ion for m aking t r ansgenic m ice. Cell. 59 : 239 - 241.
Cibelli, J.B.[ et .al] 1998. Cloned Calves Product fr om Nonquisencent Fet al Fibr oblast . Science 28. 1256 - 1258.
Eber t , K, M. [ et .al] . 1991. Tr ansgenic pr oduct ion of a var iant of hum an t issue t ype plasm inogen act ivat or in goat m ilk . Biol. Technology. 9 : 835.
Ey est one, W.H., 1999. Product ion and Breeding of Transgenic Cat t le Using in Vit ro Em br yo Pr oduct ion Technology. Ther iogenology , 51 : 509 - 517.
Gagne. M.B., F. Pot her dan M.A. Sir ar d. 1991. Effect of m icroinj ect ion in in vit ro m at ur ed bovine oocyt es on in vit r o developm ent of em br yos. Biol of r epr oduct ion 44 : 76.
Gagne, M. and Sir ar d M., 1995. Nuclear I nj ect ion of Bovine Oocyt es aft er I n Vit r o Mat ur at ion. J. Repor t . Fer t il. 4 1 : 211 - 212.
Galli.,C D.J. Pow el dan RM. Moor. 1991. St abilit y of DNA inj ect ed in oocyt e and em br yos of dom est ic anim al. Pr oc. Abst r . 6: 24.
Gor don I . 1994. Labor at or y Pr oduct ion of cat t le em br yos. Cab I nt er nat ional Walingfor d.
Got o, K., I w ai, N., Takum a, Y. and Nakanishi, Y., 1992. Co Cult ur e of I n Vit r o Fer t ilized Bovine Em br yos w it h Differ ent Cell Monolayer s. J. Anim . Sci. 70: 1449 -1453.
Gr aham , F.L. dan A. J. van der B.E. 1973. A new t echnique for t he assay of inefect ivit y of hum an adenovir us 5 DNA. Vir ology. 52 : 456 - 467.
Gur don, JP., 1963. Pr onuclear Tr ansplant at ion in Am phibia and t he I m por t ance of St able Nuclear Changes in Prom ot ing Cellular Differ ent iat ion. J. Biol. Rep. 233: 177 -182.
Han, Y.M.[ et .al] 1996. Fact or s affect ing in vivo viabilit y of DNA inj ect ed Bovine Blast ocyst s Pr oduced in vit r o. Ther iogenology. 46 : 764 - 778.
HiI I , K. G.[ et .al] . 1992. Product ion of t r ansgenic cat t le by pr onuclear inj ect ion. Ther iogenology. 37 : 222.
Jur a, J. [ et .al] 1990. I n vit r o m at ur at ion of bovine oocyt e follow ing buffer m icroinj ect ion int o germ inal v esicle or cy t oplasm . Theriogenology . 33 : 93.
Jur a, J.[ et .al] 1994. I n vit r o and in vivo developm ent of bovine em br yos fr om
zygot es 2 - cell em br yos m icr oinj ect ed w ilt exogenous DNA.
Kar l, M.E., 1989. Gene t r ansfer t hr ough em br yo m icr oinj ect ion in Anim al Biot echnology. Ox for d. pp: 233- 249.
Kay, GW. HW. Haw k, RA. Wat t em an dan RJ. Wall. 1991. I dent ificat ion of pronuclei in in v it ro fert ilized cow em bry os. Anim al biot echnology . 2 : 45 - 59.
Krim perforf P.[ et .al] 1991 Generat ion of: t ransgenic dairy cat t le using in v it r o em br yo pr oduct ion. Biot ecnology. 9: 844 - 847.
Kubisch , H.M., MA Lar son, H. Funahashi dan RM. Rober t , 1995. Pr onuclear Visibilit y, Dev elopm ent and Transgene Ex presion in I VM/ I VF Porcine Em bry os. Theriogenology . 44 : 391- 396.
Muligan, RC., B.H. How ar d dan P. Ber g. 1979. Synt hesis of r abit α globin in cult ured m onkey kidney cells follow ing inj ect ion w it h a SV40 α globin reconbinant genom e. J. Biol. Chem . 277: 108- 111.
Nancar r ow , C.D[ et .al] 1991. Expression and Physiology of per for m ance r egulat ing genes in t ransgenic sheep. J. Reprod. Fert il. 43 : 277.
Niem ann, H. and W.A. Kues, 2000. Tr ansgenic Uvest ock : Pr em ises and Pr om ises. J. Anim . Repr od. Sci. 60 : 277 - 293.
Palm it er , RD., G. Nor st edt , RE. Ham m er and K.L. Br inst er , 1983 Met hallot hionein Hum an GH fusion Gene St im ulat e Gr ow t h of Mice. Anim . Sci. 809 - 814.
Pinker t , CA, 1994. Tr ansgenic Anim al Technology. A Laborat or y Handbook. Academ ic Pr ess. San Diego. pp : 339 - 354.
Pot r ykus, I . 1996. Gene t r ansfer t o plant s: Assesm ent and Prepect ives. Physiol. Plant . 79: 125- 134.
Pur sel, V.G., RE, Ham m er , D.J. Bold, RD. Palm it er dan RL Br inst er . 1990. Genet ic engineering of sw ine: I nt egr at ion, expr ession and ger m line t r ansm ission of gr ow t g r elat ed genes. J. Repr od. Fer t il. 41 : 77.
Pur sel, V.G. dan Rexr oad, C.E, 1993. St at us of r ecear ch w it h t r ansgenik far m anim al. J. Anim . Sei. 71 : 10 - 19.
Pur sel V.G.[ et .al] 1992. Tr ansfer of cSKI gene int o sw ine t o enhance m uscle developm ent . Ther iogenology. 37 : 278.
Rexr oad, C.E. [ et .al] 1991. Tr ansfer in and album in dir ect ed expr ession of gr ow t h relat ed pept ides in t ransgenic sheep. J. Anim . Sci. 69: 2995.
Rexr oad C.E. and Har old W., 1994. Pr oduct ion of Tr ansgenic Rum inant s. I n Tr ansgenic Anim al Technology. Pp : 344 - 345.
Rosenkr ans, C.F[ et .al] 1993. Developm ent of Bovine Em bryos I n Vit r o as Affect ed by Ener gy Subst r at es. Biol. Repr od. 49 : 459 462.
Schnieke A.E., A.J. Kind, W.A. Rit chi, 1997. Hum an Fact or Tr ansgenic Sheep Pr oduced by Tr anfer of Nuclei fr om Tranfect ed Fet al Fibr oblast . Anim . Sci. 278 : 2130 - 2132.
Sr eenan J.M., dan Mc Evoy T.G., 1989 Met hodology of gen t m asfer and far m anim al and fish Ther iogenology . 41 : 7.
Su. N.Y.[ et .al] 1998. Wool pr oduct ion in t r ansgenic sheep: Result from fir st gener at ion adult and second gener at ion lam b. Anim . Biot ech. 9 : 135- 147.
Sut r ave, P.A., M. Kelly dan S.H. Hughes 1990. SKI can cause select ive gr ow t h of scelet al m uscle in t ransgenic m ice. Gans and Developm ent ,4: 1462.
Velander, W[ et .al] 1992. High lev el ex pression in t he m ilk of t ransgenic sw ine using t he cDNA encoding hum an prot ein C. Pr oc. 89 : 2003.
Wall, RJ., 1996. Tm asgenic livest ock: Progr ess and pr opect for t he fut ur e. Ther iogenology. 45 : 57 - 58.
