SIFAT FUNGSIONAL YOGHURT SUSU KAMBING PROBIOTIK YANG
DIPERKAYA EKSTRAK BUNGA ROSELA (Hibiscus sabdariffa L)
SEBAGAI ANTIMIKROBA DAN ANTIHIPERTENSI
REZA HANIFAH
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK
CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Sifat Fungsional Yoghurt Susu Kambing Probiotik yang Diperkaya Ekstrak Bunga Rosela (Hibiscus Sabdariffa L) sebagai Antimikroba dan Antihipertensi adalah benar
karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Juli 2015
Reza Hanifah
RINGKASAN
REZA HANIFAH. Sifat Fungsional Yoghurt Susu Kambing Probiotik yang Diperkaya Ekstrak Bunga Rosela (Hibiscus Sabdariffa L) sebagai
Antimikroba dan Antihipertensi. Dibimbing oleh IRMA ISNAFIA ARIEF dan CAHYO BUDIMAN.
Susu kambing memiliki beberapa kelebihan dibandingkan dengan susu sapi. Namun susu kambing memiliki keterbatasan diantaranya adalah umur simpan yang singkat dan bau prengus. Keterbatasan tersebut dapat ditanggulangi dengan mengolah susu kambing menjadi yoghurt. Kualitas yoghurt dapat ditingkatkan dengan menambahkan bakteri probiotik dan ekstrak bunga rosela (Hibiscus sabdariffa L). Probiotik yang digunakan
dalam penelitian ini ialah Lactobacillus acidophillus IIA-2B4. Jumlah bakteri
asam laktat (BAL) dalam yoghurt dengan penambahan L. acidophilus
IIA-2B4 dengan atau tanpa ekstrak bunga rosela secara signifikan lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol. Populasi BAL yang tinggi dalam yoghurt dengan penambahan L. acidophilus IIA-2B4 dengan atau tanpa ekstrak bunga
rosela sebanding dengan pH dan viskositas yang lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol. Analisis proksimat menunjukkan bahwa penambahan L. acidophilus IIA-2B4 dan ekstrak bunga rosela secara signifikan mengurangi
kadar lemak, sedangkan kadar abu secara signifikan meningkat.
Hasil SDS-Page menunjukkan bahwa penambahan L. acidophilus
IIA-2B4 dengan atau tanpa ekstrak bunga rosela menghasilkan peptida dengan fragmen <10 kDa. Fragmen ini menampilkan aktivitas antimikroba dan antihipertensi. Uji aktivitas antimikroba menunjukkan bahwa yoghurt mampu menghambat bakteri Gram positif dan negatif dengan selektivitas yang tinggi terhadap bakteri Gram positif. Penambahan L. acidophilus IIA-2B4 dengan
atau tanpa ekstrak bunga rosela mampu meningkatkan kemampuan yoghurt untuk menghambat bakteri Gram negatif. Kemampuan ini mungkin disebabkan adanya peptida yang memiliki aktivitas antimikroba yang dihasilkan selama fermentasi oleh probiotik. Pengujian antihipertensi menunjukkan bahwa susu kambing yoghurt mampu menghambat enzim angiotensin converting (ACE) aktivitas enzim yang berperan dalam sistem Renin Angiotensin Aldosteron sebagai fungsi regulasi tekanan darah dalam tubuh manusia.
SUMMARY
REZA HANIFAH. Functional Properties of Goat Milk Yoghurt Probiotics are Enriched with Extract Roselle (Hibiscus Sabdariffa L) as antimicrobial and Antihypertensive. Supervised by IRMA ISNAFIA ARIEF and CAHYO BUDIMAN.
Goat milk has several advantages over cow milk. Despite its advantages, goat milk has limitations in term of short shelf life and goaty odor. To overcome these limitations, in this research, the goat milk was processed into yoghurt. To improve its quality, a probiotic bacterium isolated from Indonesian cattle, Lactobacillus acidophillus IIA-2B4, and roselle extract
were added to the yoghurt. Total lactic acid bacteria (LAB) in yoghurt with addition of L. acidophilus IIA-2B4 with or without roselle extract is
significantly higher compared to the control. The high population of LAB in yoghurt with addition of L. acidophilus IIA-2B4 with or without roselle
extract is proportional to the acidity of the product that promotes higher viscosity compared to the control. Proximate analysis revealed that additions of L. acidophilus IIA-2B4 and/or roselle extract significantly reduce fat
content, while ash content is significantly increased by the treatments. SDS-Page revealed that addition of L. acidophilus IIA-2B4
with/without roselle extract produces <10 kDa peptides. These fragments display remarkable antimicrobial activity and antihypertensive. Antibacterial activity assay demonstrated that goat milk yoghurt is able to inhibit both Gram positive and negative bacteria with high selectivity towards Gram positive bacteria. Addition of L. acidophilus IIA-2B4 with or without roselle
extract increases the ability of yoghurt to inhibit Gram negative bacteria. This ability might be due to the presence of peptides exhibiting antimicrobial activity produced during fermentation by probiotic. Antihypertensive demonstrated that goat milk yoghurt is able to inhibit the angiotensin converting enzyme (ACE) activity an enzyme that plays a role in the renin angiotensin aldosterone system as a function of blood pressure regulation in human body.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan
SIFAT FUNGSIONAL YOGHURT SUSU KAMBING PROBIOTIK YANG
DIPERKAYA EKSTRAK BUNGA ROSELA (Hibiscus sabdariffa L)
SEBAGAI ANTIMIKROBA DAN ANTIHIPERTENSI
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2015
Judul Tesis :Sifat Fungsional Yoghurt Susu Kambing Probiotik yang Diperkaya Ekstrak Bunga Rosela (Hibiscus Sabdariffa L)
sebagai Antimikroba dan Antihipertensi Nama : Reza Hanifah
NIM : D151130321
Disetujui oleh Komisi Pembimbing
Dr Irma Isnafia Arief, SPt, MSi
Ketua Cahyo Budiman, SPt, MEng, PhD Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan
Dr Ir Salundik, Msi
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala
atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Agustust 2014 ini ialah teknologi hasil ternak, dengan judul Sifat Fungsional Yoghurt Susu Kambing Probiotik yang Diperkaya Ekstrak Bunga Rosela (Hibiscus Sabdariffa L) sebagai Antimikroba dan Antihipertensi.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr Irma Isnafia Arief, SPt, MSi dan Bapak Cahyo Budiman, SPt, MEng, PhD selaku pembimbing. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Dwi Febriantini beserta keluarga THT dan ITP 2013 yang telah membantu selama pengumpulan data. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, adik satu-satunya, opung Eli Siregar, almarhum opung Thamrin Poeloengan, opung Masniari Poeloengan, opung Amri Djahi beserta seluruh keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Juli 2015
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL ix
DAFTAR GAMBAR x
DAFTAR LAMPIRAN xi
1 PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Perumusan Masalah 2
Tujuan Penelitian 2
Manfaat Penelitian 2
Ruang Lingkup Penelitian 2
2 METODE 3
Bahan 3
Alat 3
Prosedur Analisis Data 8
3 HASIL DAN PEMBAHASAN 8
Fitokimia Ekstrak Bunga Rosela 8
Analisis Kualitas Yoghurt Probiotik Rosela 9
Aktivitas Antimikroba Yoghurt 12
Analisis Fragmen Peptida 14
Aktivitas Antimikroba Fragmen Peptida 15
Analisis Kandungan Fragmen Peptida 16
Analisis Antihipertensi 17
5 SIMPULAN DAN SARAN 18
DAFTAR PUSTAKA 18
DAFTAR TABEL
1 Kandungan fitokimia ekstrak bunga rosela 9
2 Karakteristik fisik, kimia dan mikrobiologi yoghurt 10 3 Aktivitas antimikroba yoghurt tanpa separasi 12
4 Aktivitas antimikroba setelah separasi 15
5 Aktivitas antimikroba pada fragmen peptida 16 6 Analisis kandungan peptida menggunakan metode Lowry 16 7 Aktivitas menghambat enzim ACE pada yoghurt 17
DAFTAR GAMBAR
1 Gambaran secara umum prosedur penelitian 4
2 Profil SDS-PAGE 14
DAFTAR LAMPIRAN
1 Analisis ragam sifat fisik, kimia dan proksimat dan uji lanjut 22 2 Analisis Ragam Serta Uji Lanjut Total BAL dan Antimikroba 24
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Pangan merupakan kebutuhan pokok utama bagi manusia, karena pangan mengandung nutrisi yang dibutuhkan oleh tubuh untuk proses metabolisme. Perkembangan teknologi di bidang pangan menghasilkan inovasi yang memiliki dampak negatif dan positif bagi kesehatan manusia. Dampak negatif dari berkembangnya teknologi adalah adanya penyakit yang disebabkan oleh pangan (foodborne disease). Menurut Winarno (1997) lebih dari 90% kejadian penyakit
pada manusia disebabkan oleh pangan. Dampak positif yang disebabkan oleh berkembangnya teknologi adalah terciptanya pangan yang berfungsi untuk menjaga dan bermanfaat bagi kesehatan manusia (pangan fungsional).
Susu kambing memiliki nilai ekonomi yang lebih tinggi dibandingkan dengan susu sapi. Hal tersebut disebabkan susu kambing memiliki beberapa kelebihan seperti warna susu yang lebih putih, ukuran globula lemak yang lebih kecil (Ohiokpehai 2003) sehingga lebih mudah diserap oleh tubuh dan dapat dikonsumsi penderita lactose intolerance (Tzibuola-Clarke 2003). Kelebihan yang terdapat
pada susu kambing menyebabkan meningkatnya permintaan konsumen (Martin et al. 2003). Kekurangan susu kambing ialah masa simpan singkat dan menghasilkan
bau prengus yang kurang disukai oleh konsumen, sehingga diperlukan pengolahan pada susu kambing.
Yoghurt merupakan salah satu pengolahan yang berkembang pada susu kambing. Yoghurt dihasilkan dari proses fermentasi susu dengan kultur bakteri
Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophillus yang termasuk kedalam
bakteri asam laktat (BAL). Pengolahan susu kambing menjadi yoghurt bukan hanya
meningkatkan daya simpan dan dapat meminimalisir bau prengus. Namun, juga memiliki potensi sebagai antihipertensi. Hal tersebut disebabkan fermentasi kasein susu menghasilkan kasokinin dan laktokinin yang merupakan inhibitor ACE (Angiotensin Converting Enzyme) penyebab terjadinya hipertensi (Fitzgerald dan
Meisel 1999). Selain itu, aktivitas BAL dalam proses fermentasi menyebabkan terjadinya proteolisis yang berkontribusi dalam karakteristik yoghurt dan menghasilkan fragmen peptida. Aktivitas fragmen peptida yang dihasilkan memiliki kemampuan dalam antimikroba dan antihipertensi.
Penambahan bakteri probiotik dapat digunakan dalam kultur bakteri fermentasi yoghurt. Penambahan probiotik pada yoghurt dapat menghasilkan peptida antimikroba dan antihipertensi. Komponen organik yang bersifat antimikroba dihasilkan oleh probiotik seperti asam laktat dan bakteriosin (Vesterlund dan Ouwehand 2004). Yoghurt dengan penambahan probiotik dapat menghasilkan senyawa antimikroba serta dapat mengontrol pertumbuhan mikroba di saluran pencernaan (Commane et al. 2005). Probiotik yang digunakan dalam
penelitian ini ialah Lactobacillus acidophilus IIA-2B4. Probiotik L. acidophilus
IIA-2B4 terbukti dapat menghasilkan senyawa antimikroba dan dapat menghambat pertumbuhan bakteri patogen (Arief et al. 2015). Selain dengan penambahan
2
Ekstrak bunga rosela di beberapa Negara telah digunakan sebagai tumbuhan herbal yang berperan sebagai antihipertensi dan intestine antiseptic. Penggunaan
ekstrak rosela dalam yoghurt dapat mempertahankan kualitas fisik dan kimia selama 16 jam di suhu ruang (Adam dan Andy 2011). Selain itu, ekstrak bunga rosela mengandung aktivitas antimikroba pada Eschericia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, dan Streptococcus sanguinis (Olaleye 2007).
Aktivitas antimikroba pada ekstrak bunga rosela disebabkan oleh adanya kandungan flavonoid dan tannin (Olaleye 2007). Ekstrak bunga rosela juga memiliki kemampuan antihipertensi (Ojeda et al. 2010). Namun belum ada
penelitian terkait penambahan ekstrak bunga rosela dalam yoghurt susu kambing yang ditambahkan probiotik L. acidophillus IIA-2B4.
Perumusan Masalah
Yoghurt yang ditambahkan L. acidophillus IIA-2B4 dan ekstrak bunga rosela
merupakan hasil pengolahan fermentasi susu kambing. Yoghurt tersebut memiliki potensi yang dapat digunakan sebagai pangan fungsional yaitu sebagai antimikroba dan antihipertensi.
Tujuan Penelitian
Tujuan dari dilakukannya penelitian ini adalah mengevaluasi sifat fungsional yoghurt susu kambing dengan penambahan L. acidophilus IIA-2B4 yang diperkaya
dengan ekstrak bunga rosela sebagai antimikroba dan antihipertensi.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan memberikan manfaat berupa dihasilkannya yoghurt probiotik yang berpotensi dapat menghambat pertumbuhan mikroba patogen dan diharapkan mampu menjadi alternatif pangan pendamping bagi penderita hipertensi.
Hipotesis
Hipotesis yang diajukan pada penelitian ini adalah yoghurt probiotik susu kambing dengan penambahan ekstrak bunga rosela sebagai pangan fungsional mampu menghambat pertumbuhan mikroba dan memiliki kemampuan dalam menghambat enzim penyebab hipertensi yaitu ACE (Angiotensin Converting Enzyme).
Ruang Lingkup Penelitian
Ruang lingkup penelitian ini mencangkup dua tahap penelitian yaitu :
3 2. Penelitian Tahap II, mengevaluasi kemampuan antimikroba dan antihipertensi
pada yoghurt probiotik dengan penambahan ekstrak bunga rosela.
2
METODE
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Agustus sampai Desember 2014, di Laboratorium Mikrobiologi, dan Laboratorium Terpadu, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor. Selain itu juga dilakukan di Balai Besar Penelitian Veteriner (BBALITVET), Bogor.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah susu kambing PE (Peranakan Etawa) yang diperoleh dari unit pengolahan susu D’Farm Fakultas Peternakan IPB, dan bunga rosela diperoleh dari kelompok petani rosela yang berada di daerah Ciampea, Kabupaten Bogor. Kultur yoghurt yang digunakan adalah Lactobacillus achidophilus IIA-2B4, Lactobacillus delbruecki subsp bulgaricus RRAM-01, Streptococcus salivarius subsp thermophillus RRAM-01
yang merupakan koleksi Laboratorium Teknologi Hasil Ternak Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor. Bacillus cereus, Eschericia coli, Salmonella typhimurium dan Staphylococcus aureus, Saccharomyces cereviceae dan Aspergilus niger yang merupakan koleksi Laboratorium Balai Besar Penelitian
Veteriner. Media yang digunakan antara lain demann rogosa sharpe broth (MRSB), demann rogosa sharpe agar (MRSA), plate count agar (PCA), buffer pepton water
(BPW), mueller hinton agar (MHA) dan aquades. Bahan kimia yang digunakan
adalah akrilamid, HCl, sodium dodecyl sulfate (SDS), tetrametiletilendiamin (TEMED), amonium persulfat (APS), hippuryl-lhistidyl-l-leucine (HHL), enzim ACE, reagen Lowry dan folin.
Alat
Alat-alat yang digunakan antara lain timbangan digital, tabung reaksi, rak tabung reaksi, tabung eppendorf, botol schott, cawan petri, gelas ukur, pipet satu
mL, mikro pipet, labu erlenmeyer, biuret, inkubator, mikroskop, heater-magnetic stirrer, oven, ose, pembakar bunsen, laminar air flow, autoclave, hot plate,
pengaduk kayu, termometer, panci double wall, kompor gas, waterbath, vorteks,
sentrifuse, pH meter, aw meter, viscometer, spektrofotometer, stopwatch, filter cut off dibawah 10 kDa.
Prosedur
Persiapan penelitian meliputi pembiakan starter dan pembuatan ekstrak bunga rosela, kultur bakteri asam laktat (Lactobacillus delbruecki subsp bulgaricus
RRAM-01 dan Streptococcus salivarius subsp thermophillus RRAM-01) serta
4
untuk mengolah susu kambing menjadi yoghurt dan yoghurt probiotik. Yoghurt yang dihasilkan tersebut ditambahkan dengan ekstrak bunga rosela untuk kemudian dilakukan pengujian. Secara umum proses penelitian dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Tahapan penelitian secara umum
Pembuatan Ekstrak Bunga Rosela (Hibiscus sabdariffa L)
5 Pembuatan Yoghurt Probiotik Rosela
Susu kambing dipanaskan pada suhu 75-80 °C selama 30 menit, kemudian di dinginkan hingga suhu mencapai 37 °C. Kultur yoghurt (S. thermophillus
RRAM-01 dan L. bulgaricus RRAM-01) dan L. achidophillus IIA-2B4 ditambahkan
sebanyak 3% dari volume susu kambing, diinkubasi pada suhu 37 °C selama 18 jam sampai terbentuk koagulasi (plain yoghurt). Setelah itu ditambahkan ekstrak rosela
sebanyak 1% dari volume susu kambing (Donkor et al. 2006).
pH dan Persentase Asam Laktat
Pengukuran pH dilakukan dengan menggunakan pH meter merk Schoot Instrument (Jerman). Persentase asam laktat diukur dengan titrasi. Sampel sebanyak
10 mL ditambahkan 2 tetes (300µL) indikator phenolphtalin 1%. Kemudian
dititrasi dengan 0.1 N larutan NaOH hingga timbul warna merah muda. Jumlah asam yang diproduksi selama fermentasi yang disetarakan dengan asam laktat dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut (AOAC 2007)
Asam laktat (%) = x 100%
Analisis Proksimat, Aktivitas air (water activity/ aw) dan Viskositas
Analisis proksimat dilakukan pada yoghurt untuk mengetahui kandungan yang berada pada yoghurt. Kandungan yang diuji pada yoghurt adalah kadar air, abu, lemak dan protein (AOAC 2007). Pada yoghurt dilakukan pengukuran aktivitas air (water activity/ aw) dengan menggunakan aw meter (Novasina,
Switzerland). Viskositas yoghurt diukur menggunakan alat viskometer (Rion VT-04F, Jepang).
Total Bakteri Asam Laktat (BAL)
Sampel sebanyak 25 mL dimasukkan dalam tabung reaksi berisi 225 mL larutan Buffer Peptone Water (BPW). Selanjutnya P-1 diambil sebanyak 1 mL untuk
dilarutkan ke dalam larutan pengencer BPW 9 mL sehingga diperoleh P-2, demikian seterusnya dengan cara yang sama dilakukan sampai P-9. Pemupukan dilakukan dengan metode pour plate dimana sebanyak 1 mL sampel dari pengenceran P-6
sampai P-9 dipindahkan ke dalam cawan petri untuk kemudian dicampur dengan 15 mL media de man rogosa sharpe agar (MRSA). Cawan kemudian diinkubasi pada
6
Pengujian Aktivitas Antimikroba Yoghurt
Pengujian daya antimikroba dilakukan pada yoghurt, yoghurt yang ditambahkan ekstrak bunga rosela, yoghurt yang ditambahkan L. acidophilus
IIA-2B4 dan yoghurt yang ditambahkan L. acidophilus IIA-2B4 serta ekstrak bunga
rosela. Sampel-sampel yang diuji disentrifugasi dan diseparasi dengan cut off
dibawah 10 kDa (Milipore, USA). Selain sampel yang sudah diseparasi, sampel utuh (tanpa separasi) juga diuji kemampuan antimikroba. Pengujian antimikroba dilakukan dengan dua metode yaitu metode difusi sumur (Bintang 1993).
Metode Difusi Sumur
Bakteri uji yang digunakan diantaranya Bacillus cereus, Eschericia coli, Salmonella Typhimurium dan Staphylococcus aureus serta kapang (Aspergilus niger) dan khamir (Saccharomyces cereviceae) koleksi Balai Besar Penelitian
Veteriner (BBALITVET). Bakteri, kapang dan khamir yang diujikan berumur 24 jam. Masing-masing mikroorganisme tersebut diencerkan dalam media pengencer BPW dan dibandingkan dengan larutan 0.5 McFarland yang sebanding dengan populasi 108, dan diencerkan sebanyak 2 kali ke dalam 9 mL BPW hingga diperoleh populasi 106. Sebanyak 1 mL larutan pengencer yang telah diinokulasi mikroorganisme uji tersebut dimasukan kedalam cawan petri menggunakan pipet untuk kemudian ditambahkan muller hinton agar (MHA) sebanyak 15 mL. Setiap
cawan mewakili satu bakteri. Lubang sumur dibentuk pada media agar yang telah mengeras menggunakan tabung Durham berdiameter 6 mm sebanyak 6 sumur setiap cawan. Setiap cawan terdiri dari 3 kali ulangan dan setiap ulangan dilakukan duplo. Sebanyak 50 μL pada masing-masing sampel yoghurt yang utuh dan sudah diseparasi di masukkan ke dalam lubang sumur dan didiamkan selama ± 2 jam pada suhu sekitar 7 oC. Inkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Diameter zona penghambatan diukur dengan menggunakan jangka sorong, diukur diameternya sebanyak tiga kali ulangan di tempat yang berbeda dan hasilnya dirata-ratakan.
Analisis Fragmen Peptida dari Proses Proteolisis
Sampel yoghurt dianalisis menggunakan SDS-PAGE pada 16.5% gel
polyacrylamide untuk resolving gel dengan komposisi larutan acrylamid 30%
sebanyak 2.75 mL, buffer Tris-HCl 1.5 M pH 8.8 sebanyak 1 mL, larutan SDS 10% sebanyak 100 µL, larutan TEMED sebanyak 5 µL, larutan amonium persulfat 10% sebanyak 50 µL dan aquabidest sebanyak 1.095 mL. Stacking gel 5% dibuat dengan
komposisi yang sama, tetapi buffer yang digunakan adalah buffer Tris-HCl 0.5 M pH 6.8 dan jumLah acrylamide yang ditambahkan sebanyak 0.83 mL dan
aquabidest sebnyak 3.015 mL. Setiap sampel dicampur dengan sampel bufer yang terdiri atas 3.55 mL aquades steril, 1.25 mL 0.5 M Tris HCl pH 6.8 sebanyak 2.5 mL gliserol, 0.2 mL bromophenol blue, 2 mL SDS, dan 500 µL β-mercaptoethanol.
7
staining yang terdiri atas 1 g coomasie brilliant blue yang dilarutkan dalam, 1 L
aquadest yang mengandung etanol 50% dan asam asetat 2%. Pencucian gel dilakukan dengan merendam gel dalam larutan destaining yang dibuat dari 1 L
aquadest yang mengandung etanol 5% dan asam asetat 7%. Metode SDS-PAGE yang dilakukan merujuk pada (Laemmli 1970) dengan pembanding menggunakan marker (Thermo Scientific,Singapura).
Aktivitas Antimikroba dari Fragmen Peptida
Satu mL yoghurt probiotik dan yoghurt probiotik rosela yang telah disaring dengan menggunakan filter cut off dibawah 10 kDa, dicampurkan dengan 1 mL
bakteri E. coli dengan populasi bakteri 106 cfu/mL. Larutan tersebut kemudian
diencerkan dengan pengenceran 104 sampai 106 (untuk pengamatan 0 jam) dan diencerkan dengan pengenceran 104 sampai 108 (untuk pengamatan 24 jam). Hasil pengenceran dipindahkan kedalam cawan petri steril secara duplo kemudian ditambahkan media EMBA sebanyak 15 mL dengan metode tuang dan dihomogenkan. Cawan petri diinkubasi dengan posisi terbalik pada suhu 37 °C selama 24 jam (AOAC 2007).
Analisis Konsentrasi Fragmen Peptida
Kandungan fragmen peptida ditentukan dengan metode Lowry yang berdasar pada (Lowry 1951). Sampel yoghurt yang telah diseparasi dibawah 10 kDa sebanyak 0.05 mL ditambahkan dengan aquadest sebanyak 0.095 mL. Sampel yang sudah diencerkan ditambahkan dengan reagen Lowry. Reagen Lowry yang digunakan tersusun atas Na2CO3, Na Ktartrat dan CuSO4 didiamkan selama 10 menit. Folin sebanyak 0.5 mL ditambahkan dan didiamkan selama 30 menit. Setelah itu dimasukkan kedalam spektrofotometer dengan panjang gelombang 750 nm.
Analisis Antihipertensi
Analisis antihipertensi dilakukan dengan menggunakan ACE inhibitor berdasarkan pada Hayes et al. (2007). Substrat enzim yang digunakan adalah
hippuryl-lhistidyl-l-leucine (HHL). Sampel yang diuji diambil sebanyak 6 μl
ditambahkan pada 50 μl HHL dengan 7.6 mM untuk kemudian diinkubasi dengan suhu 37 °C selama 5 menit menggunakan waterbath. Selanjutnya ditambahkan 20
μl ACE dan diinkubasi kembali selama 5 menit dengan suhu 30 °C. Reaksi dihentikan dengan penambahan 250 μl 0.5 M HCl, dan ditambahkan etil asetat sebanyak 1.5 mL. Larutan sampel kemudian disentrifugasi dengan 2500 rpm selama 15 menit, 1 mL supernatan dipisahkan. Pengeringan menggunakan heater block dengan suhu 100 °C selama 10 menit. Sampel kemudian didinginkan di suhu
8
Aktivitas penghambatan(%) = 100 – [100 x ( – − )] Keterangan
A: Absorbansi ACE tanpa penambahan sampel B: Absorbansi sampel
C: Absorbansi sampel yang telah ditambahkan ACE D: Absobansi tanpa penambahan ACE dan sampel
Analisis Data
Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah rancangan acak lengkap (RAL) pola faktorial. Perlakukan yang dilakukan adalah (1) yoghurt susu kambing, (2) yoghurt susu kambing + Lactobacillus achidophillus IIA-2B4,
(3) yoghurt susu kambing + ekstrak bunga rosela, dan (4) yoghurt susu kambing +
Lactobacillus achidophillus + ekstrak bunga rosela. Setiap perlakuan dilakukan
sebanyak tiga kali ulangan. Analisis data penelitian menggunakan model berikut (Matjik dan Sumertajaya 2002).
Yijk = μ + αi + βj + (αβ)ij + ɛijk
Keterangan
Yij : Respon yang diamati pada perlakuan pertama ke-i, perlakuan kedua ke-j, dan ulangan ke-k
Μ : Nilai tengah umum
Αi : Pengaruh perlakuan pertama ke-i (tanpa di sentrifugasi) Βj : Pengaruh perlakuan kedua-j (disentrifugasi)
(αβ)ij : Pengaruh interaksi dari pengaruh perlakuan pertama ke-I, perlakuan kedua-j
Rosela mempunyai nama ilmiah Hibiscus sadbariffa Linn yang termasuk
kedalam family Malvaceae. Komponen bioaktif yang terdapat pada ekstrak bunga rosela dapat diketahui dengan menggunakan uji fitokimia (Lako et al. 2007). Hasil
9
Tabel 1. Kandungan fitokimia pada ekstrak bunga rosela
Zat fitokimia Hasil pengujian
Kandungan zat dalam ekstrak bunga rosel: (-): negatif, (+): positif
Komponen fitokimia secara kualitatif terdapat didalam ekstrak bunga rosela yang digunakan dalam penelitian ini. Komponen tersebut antara lain flavanoid, fenol hidrokuinon, steroid, triterpenoid dan tannin. Total fenol yang terkandung dalam ekstrak bunga rosela secara kuantitatif sebesar 0.113%, sementara itu alvanoid dan saponin tidak terdapat dalam ekstrak bunga rosela. Hal ini serupa dengan penelitian (Adedayo et al. 2012) yang menyatakan di dalam esktrak bunga
rosela keberadaan flavonoid dan tannin. Hasil pengujian (Tabel 1) menunjukkan bahwa ekstrak bunga rosela yang digunakan memiliki kemampuan sebagai antimikroba. Kelompok utama fitokimia yang berkontribusi sebagai antimikroba adalah senyawa flavonoid, fenol dan tanin (Purushotham et al. 2010). Selain itu
flavonoid yang terkandung dalam ekstrak bunga rosela dapat berkontribusi sebagai antihipertensi (Odigie et al. 2003).
Flavonoid merupakan senyawa polifenol yang menunjukkan berbagai aktivitas farmakologi. Senyawa bioaktif flavonoid yang telah diteliti dapat berperan sebagai antimikroba, flavonoid memiliki spektrum aktivitas antimikroba yang luas dengan mengurai dinding bakteri (Naidu 2000). Flavonoid juga dapat mencegah terjadinya hipertensi melalui pendekatan terhadap aktivitas ACE (Actis-Goretta et al. 2003).
Senyawa fenol memiliki aktivitas antimikroba yang bekerja melalui proses interaksi dengan sel bakteri serta proses absorpsi yang melibatkan ikatan hidrogen. Selain itu bekerja dengan mengganggu aktivitas dalam membran sitoplasma termasuk diantaranya mengganggu transpor aktif dan kekuatan proton (Schlegel dan Schmidt 1994). Tanin dapat menginaktivasi molekul di sel inang yang terdapat pada permukaan sel sehingga menyebabkan kerusakan pada polipeptida dinding sel (Cowan 1999). Kemampuan menghambat bakteri dan mencegah terjadinya hipertensi yang terdapat dalam komponen-komponen tersebut mengindikasikan bahwa ekstrak bunga rosela merupakan sumber substansi bioaktif yang memiliki manfaat sebagai antimikroba dan antihipertensi.
Analisis Kualitas Yoghurt Probiotik Rosela
Probiotik L. acidophilus IIA-2B4 diisolasi dari daging sapi lokal Indonesia
10
(Arief et al. 2015). Ekstrak bunga rosela sebanyak 1 g/mL dapat menghambat E. coli, S. typhimurium, S. aureus dan S. sanguinis (Olaleye et al. 2007). Penambahan L. acidophillus IIA-2B4 dan ekstrak bunga rosela pada yoghurt susu kambing
diindikasikan dapat berdampak positif bagi kesehatan. Hasil analisa kualitas yoghurt dapat dilihat pada Tabel 2. Yoghurt yang dihasilkan termasuk ke dalam yoghurt probiotik dan telah memenuhi Standar Nasional Indonesia.
Tabel 2. Karakteristik fisik, kimia dan mikrobiologi pada yoghurt
Parameter Uji Y YP YR YPR SNI Y: yoghurt kontrol; YR: yoghurt + ekstrak bunga rosela; YP: yoghurt + L. acidophillus IIA-2B4; YPR: yoghurt + L. acidophillus IIA-2B4 + ekstrak bunga rosela; SNI: Standar Nasional Indonesia (01-2981-2009); Huruf pada baris yang sama menunjukkan berbeda nyata pada taraf uji 5%
Tabel 2 menunjukkan bahwa total BAL pada yoghurt tidak dipengaruhi oleh pemberian ekstrak bunga rosela (P>0.05). Penambahan L. acidophillus IIA-2B4
berpengaruh nyata (P<0.05) terhadap total BAL yoghurt. Jumlah bakteri asamlaktat yang tinggi pada yoghurt disebabkan oleh nutrisi susukambing yang sesuai serta dapat memenuhi aktivitas metabolisme bakteri S. thermophilus, L. bulgaricus dan L. acidophilus IIA-2B4. Selain itu, L. acidophillus IIA-2B4 tumbuh dengan baik
pada yoghurt yang ditambahkan dengan probiotik sehingga total BAL pada yoghurt tersebut menjadi lebih banyak.
Penambahan L. acidophilus IIA-2B4 dan ekstrak bunga rosela memiliki kadar
air yang lebih besar dibandingkan dengan yoghurt (kontrol). Proses fermentasi mengakibatkan perombakan komponen-komponen total solid (kadar abu, lemak dan protein) sehingga air yang terikat pada komponen-komponen total solid terlepas (Rahman et al. 1992). Hasil penelitian mengindikasikan bahwa L. acidophilus IIA-2B4 dan ekstrak bunga rosela meningkatkan kemampuan yoghurt
11 yang ditambahkan berbentuk cair sehingga dapat meningkatkan kadar air pada yoghurt.
Tabel 2 menunjukkan bahwa dengan penambahan L. acidophillus IIA-2B4
dan ekstrak bunga rosela secara signifikan dapat merubah komponen yoghurt dalam analisis proksimat, seperti pada kadar abu dan lemak. Kadar lemak menurun dengan penambahan L. acidophillus IIA-2B4 dan ekstrak bunga rosela, sedangkan kadar
abu meningkat. Hal tersebut diindikasikan disebabkan oleh metabolisme L. acidophillus IIA-2B4 dan BAL pada yoghurt yang ditambahkan atau tanpa
penambahan ekstrak bunga rosela.
Penambahan ekstrak bunga rosela nyata meningkatkan kadar abu (P<0.05) pada yoghurt. Hal tersebut disebabkan esktrak bunga rosela menambah kandungan mineral pada yoghurt yang dihasilkan. Kadar abu produk pangan dipengaruhi oleh kandungan mineral (Winarno 1997) kandungan mineral yang tinggi dapat meningkatkan kadar abu produk. Kandungan mineral ekstrak bunga rosela terdiri atas potasium, sodium, kalsium, fosfor dan magnesium (Nzikou et al. 2011). Selain
itu proses fermentasi susu dapat meningkatkan kandungan mineral. Hal tersebut sesuai dengan penelitian Khurana dan Kanawijaya (2007) yang menyatakan bahwa kandungan mineral susu mengalami peningkatan sekitar 34% setelah proses fermentasi menjadi yoghurt. Kadar abu yang diperoleh dalam penelitian ini antara 0.80-0.96%. Kadar abu tersebut memenuhi standar yang telah ditetapkan SNI (2009). Batas kadar abu yang terdapat pada yoghurt adalah kurang dari 1.0%.
Hasil analisis ragam menunjukkan bahwa penambahan L. acidophillus
IIA-2B4 dan ekstrak bunga rosela dapat menurunkan kadar lemak. Hal tersebut disebabkan proses fermentasi yang dapat menghidrolisis lemak menjadi senyawa yang lebih sederhana. Hasil penelitian Rahman et al. (1992) menyatakan bahwa
bakteri yang termasuk kedalam bakteri asam laktat (BAL) dapat menghasilkan enzim lipase sehingga lemak terhidrolisis dan menyebabkan penurunan kadar lemak. Selain itu, penurunan terjadi disebabkan oleh lemak yang digunakan oleh BAL sebagai sumber energi dan pembentukkan flavour (Rahman et al. 1992). Hasil
penelitian juga menunjukkan bahwa penambahan ekstrak bunga rosela pada yoghurt dapat meningkatkan aktivitas enzim lipase.
Kadar protein dalam yoghurt tidak dipengaruhi oleh penambahan ekstrak bunga rosela dan L. acidophillus IIA-2B4. Kadar protein yang dihasilkan pada
yoghurt lebih besar dibandingkan dengan standar yang telah ditetapkan oleh SNI (2009) yaitu minimal 2.7%. Hal tersebut diindikasikan bahwa jumlah BAL pada yoghurt berpengaruh pada kadar protein.Yoghurt yang ditambahkan L. acidophilus
IIA-2B4 dan ekstrak bunga rosela memiliki nilai pH yang rendah (Tabel 2). Hal tersebut disebabkan BAL menghasilkan asam laktat dari proses fermentasi dengan substrat energi berupa karbohidrat. Asam laktat yang dihasilkan dari metabolisme karbohidrat dapat menurunkan nilai pH dan menimbulkan rasa asam. Nilai pH pada ekstrak bunga rosela yang digunakan sebesar 2.34. Penambahan ekstrak bunga rosela sebanyak 1% tidak mempengaruhi nilai pH pada yoghurt.
Total asam laktat berhubungan dengan nilai pH. Semakin tinggi nilai asam laktat yang dihasilkan maka semakin rendah nilai pH (Winarno dan Fernandez 2007). Hasil pengujian menunjukkan bahwa yoghurt yang ditambahkan L. acidophillus dan ekstrak bunga rosela berbeda nyata (P<0.05) pada nilai TAT
12
oleh adanya proses fermentasi pada susu yang melibatkan bakteri. Bakteri dalam proses fermentasi susu menjadi yoghurt termasuk kedalam golongan bakteri homofermentatif. Bakteri golongan tersebut dapat menghasilkan asam laktat lebih dari 85% sebagai komponen utamanya (Surono 2004).
Viskositas merupakan konsistensi (kekentalan) dari produk. Pengujian viskositas pada produk dapat menunjukkan besar kecilnya hambatan suatu cairan terhadap proses pengadukan. Tabel 2 menunjukkan bahwa penambahan ekstrak bunga rosela dan L. acidophillus berpengaruh terhadap viskositas (P<0.05).
Viskositas yoghurt dipengaruhi oleh hasil koagulasi protein kasein yang terjadi akibat penurunan tingkat keasaman selama proses fermentasi. Viskositas memiliki hubungan dengan jumlah bakteri asam laktat yang terdapat pada produk (Rahman
et al. 1992).
Aktivitas Antimikroba Pada Yoghurt Ekstrak Bunga Rosela
Sifat fungsional pada yoghurt salah satunya ialah aktivitas antimikroba yang dihasilkan dari proses fermentasi yaitu asam laktat dan bakteriosin (Vesterlund dan Ouwehand 2004). Asam laktat merusak lipopolisakarida dari membran terluar sel bakteri Gram negatif dan dapat berperan sebagai perangsang (potentiator) untuk efek bahan antimikroba yang lain (Alakomi et al. 2000). Bakteriosin merupakan
senyawa peptida yang disintesis pada ribosom oleh bakteri untuk menghambat pertumbuhan bakteri lain. Penambahan L. acidophillus IIA-2B4 dan ekstrak bunga
rosela berkontribusi dalam aktivitas antimikroba pada yoghurt. Aktivitas antimikroba pada yoghurt ditentukan dengan menggunakan metode sumur. Metode tersebut menunjukkan keberadaan aktivitas antimikroba dengan adanya zona bening di sekitar sumur. Hasil aktivitas antimikroba pada penelitian ini ditunjukkan pada Tabel 3.
Tabel 3. Aktivitas antimikroba pada yoghurt tanpa dilakukan separasi
Mikroba Diameter Zona Hambat (mm) R (mm) C (mm)
Y: yoghurt kontrol; YR: yoghurt + ekstrak bunga rosela; YP: yoghurt + L. acidophillus IIA-2B4; YPR: yoghurt + L. acidophillus IIA-2B4 + ekstrak bunga rosela; R: ekstrak bunga rosela; C: Chloramphenicol; Huruf pada baris yang sama menunjukkan berbeda nyata pada taraf uji 5%
13
L. acidophillus IIA-2B4 dan ekstrak bunga rosela memiliki zona bening yang lebih
besar dibandingkan dengan yoghurt (kontrol). Perbedaan tersebut diindikasikan terkait dengan konsentrasi zat antimikroba yang berbeda. Namun hasil pengujian ini dapat menunjukkan bahwa aktivitas antimikroba pada L. acidophillus IIA-2B4
dan ekstrak bunga rosela secara akumulasi berpengaruh terhadap kemampuan antimikroba yoghurt. Aktivitas antimikroba pada yoghurt dengan penambahan L. acidophillus dan ekstrak bunga rosela secara signifikan lebih besar dibandingkan
dengan ekstrak bunga rosela. Namun lebih rendah dibandingkan dengan antibiotik komersil (chloramphenicol).
Pengujian aktivitas antimikroba menunjukkan bahwa yoghurt probiotik yang ditambahkan dengan ekstrak bunga rosela dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji (Bacillus cereus, Eschericia coli, Salmonella typhimurium dan Staphylococcus aureus). Namun tidak dapat menghambat pertumbuhan kapang (Aspergilus niger)
dan khamir (Saccharomyces cereviceae). Tabel 3 menunjukkan bahwa aktivitas
antimikroba pada yoghurt menjadi meningkat dengan ditambahkan L. acidophillus
IIA-2B4 dan semakin meningkat aktivitas penghambatannya dengan penambahan ekstrak bunga rosela. Aktivitas antimikroba pada yoghurt dapat disebabkan oleh asam laktat dan bakteriosin (Vesterlund dan Ouwehand 2004). Komponen tersebut dihasilkan dari proses fermentasi BAL pada susu kambing dan juga penambahan probiotik (dalam penelitian ini L. acidophillus IIA-2B4). Selain itu, bahan
tambahan pada yoghurt juga dapat berdampak pada aktivitas antimikroba dalam hal ini adalah ekstrak bunga rosela. Aktivitas antimikroba pada ekstrak bunga rosela disebabkan oleh komponen fitokimia yaitu flavonoid, fenol dan tanin.
Tabel 3 menunjukkan bahwa aktivitas antimikroba dari yoghurt (kontrol) lebih sensitif terhadap bakteri golongan Gram positif dibandingkan dengan bakteri Gram negatif. Bakteri Gram negatif yaitu S. typhimurium dan E. coli dan bakteri
Gram positif yaitu S. aureus dan B. cereus. Hal tersebut disebabkan komponen
dinding sel pada golongan bakteri Gram positif lebih sederhana dan mudah terurai. Dinding sel bakteri Gram positif sebagaian besar tersusun atas peptidoglikan (90%) serta lapisan tipis asam tekoat dan asam teikuronat. Dinding sel bakteri Gram negatif disusun oleh komponen yang lebih kompleks (protein, lipoprotein dan lipopolisakarida). Selain itu Gram negatif memiliki membran luar. Membran luar tersebut tersusun atas fosfolipid dan lipopolisakarida. Membran luar pada bakteri Gram negatif dapat berperan sebagai barrier untuk senyawa-senyawa yang tidak
dibutuhkan sel (Pelczar dan Chan 2012). Penambahan L. acidophillus IIA-2B4 dan
ekstrak bunga rosela pada yoghurt menyebabkan sensitivitas antimikroba menjadi meningkat pada Gram positif dan negatif. Sensitivitas tersebut sama seperti chlorampenicol sedangkan ekstrak bunga rosela lebih sensitif pada bakteri Gram positif.
Yoghurt dengan atau tanpa penambahan L. acidophillus IIA-2B4 dan atau
tanpa ekstrak bunga rosela tidak dapat menghambat pertumbuhan kapang (Aspergilus niger) dan khamir (Saccharomyces cereviceae). Hal tersebut
mengindikasikan bahwa tidak terdapat komponen aktivitas antifungal atau konsentrasi pada komponen tersebut terlalu rendah. Beberapa BAL dilaporkan memiliki antifungal (Schnuer dan Jesper 2005). Hal tersebut mengindikasikan komponen antifungal pada yoghurt dengan atau tanpa penambahan L. acidophillus
14
Analisis Fragmen Peptida dari Proses Proteolisis
Aktivitas antimikroba pada yoghurt disebabkan oleh adanya asam laktat dan bakteriosin. Peptida yang dihasilkan dari proteolisis protein juga dapat berperan dalam aktivitas antimikroba (Atanasova dan Ivanova 2010). Pada penelitian ini kami menitikberatkan pada peptida dengan fragmen di bawah 10 kDa. Selain itu, yoghurt dengan penambahan L. acidophillus IIA-2B4 menjadi fokus dalam
penelitian ini sehingga yoghurt dengan penambahan ekstrak bunga rosela tidak diujikan. Gambar 2 menunjukkan fragmen-fragmen peptida dari yoghurt dalam penelitian ini.
Gambar 2. Profil SDS-PAGE pada Yoghurt. Yoghurt kontrol (Y). Yoghurt + L. acidophilus IIA-2B4 (YP). Yoghurt + L. acidophilus IIA-2B4 + ekstrak
bunga rosela dinotasikan dengan (YPR). Kolom M menunjukkan protein marker.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa yoghurt yang dihasilkan yaitu Y, YP dan YPR mengandung α-kasein. Hasil analisis menunjukkan pita α-kasein pada YPR lebih tipis dibandingkan dengan YP dan Y. Selain itu hasil pengujian menunjukkan tingginya produksi peptida pada fragmen dibawah 10 kDa. Hal tersebut mengindikasikan bahwa proteolisis pada yoghurt yang ditambahkan probiotik dan atau tanpa ekstrak bunga rosela lebih besar dibandingkan kontrol (Y).
Pengujian antimikroba pada fragmen peptida dibawah 10 kDa dilakukan untuk mengetahui peran peptida tersebut dalam aktivitas antimikroba. Fragmen peptida dibawah 10 kDa diisolasi dengan penyaringan menggunakan filter cut off
15
Tabel 4. Aktivitas antimikroba pada yoghurt setelah dilakukan separasi
Bakteri Diameter Zona Hambat (mm)
Y YR YP YPR
B.cereus 0.00 0.00 2.70±0.17bc 2.91±0.46bc
E.coli 0.00 0.00 0.00 0.00
S.typhimurium 0.00 0.00 2.98±0.54bc 2.99±0.42bc
S.aureus 0.00 0.00 0.00 0.00
S.cerevi 0.00 0.00 0.00 0.00
A.niger 0.00 0.00 0.00 0.00
Y: yoghurt kontrol; YR: yoghurt + ekstrak bunga rosela; YP: yoghurt + L. acidophillus IIA-2B4; YPR: yoghurt + L. acidophillus IIA-2B4 + ekstrak bunga rosela; Huruf pada baris yang sama menunjukkan berbeda nyata pada taraf uji 5%
Tabel 4 menunjukkan bahwa tidak terdapat aktivitas antimikroba pada yoghurt kontrol (Y). Hal tersebut mengindikasikan bahwa konsentrasi pada fragmen peptida dibawah 10 kDa relatif rendah untuk menghambat pertumbuhan bakteri. Penambahan ekstrak bunga rosela pada yoghurt (YR) tidak memiliki aktivitas antimikroba dimungkinkan ekstrak bunga rosela tidak berpengaruh pada proses proteolisis. Yoghurt yang ditambahkan L. acidophillus IIA-2B4 dan atau
tanpa ekstrak bunga rosela dapat menghambat bakteri B. cereus dan S. typhimurium,
tetapi tidak dapat menghambat bakteri E. coli dan S. aureus. Hal ini
mengindikasikan bahwa fragmen dibawah 10 kDa pada yoghurt berkontribusi pada aktivitas antimikroba dan konsentrasi peptida pada yoghurt tersebut dapat berpengaruh pada beberapa bakteri. Peptida berperan sebagai antimikroba pada bakteri Gram positif dengan melekat pada bagian lipoteichoic acid, membuat pori
pada dinding sel selanjutnya menimbulkan kebocoran pada sitoplasma sehingga isinya keluar. Pada bakteri Gram negatif, peptida berikatan pada bagian lipopolisakarida, membuat pori pada membran luar kemudian menimbulkan kondensasi sitoplasma (Lopez-Exposito et al. 2008).
Aktivitas antimikroba tidak terdeteksi pada E. coli dan S. aureus
dimungkinkan karena konsentrasi peptida tidak mencukupi atau tidak terdapat antimikroba. Oleh karena itu dilakukan uji konfrontasi pada fragmen dibawah 10 kDa untuk mengkonfirmasi hal tersebut.
Aktivitas Antimikroba dari Fragmen Peptida
Kurangnya konsentrasi untuk menghambat pertumbuhan bakteri yang dijelaskan sebelumnya bisa dibuktikan dengan uji konfrontasi. Uji konfrontasi dalam penelitian ini dilakukan terhadap bakteri E. coli sebagai representatif. Hasil
16
Tabel 5. Aktivitas antimikroba yoghurt dengan fragmen peptida dibawah 10 kDa terhadap populasi E. coli (log cfu/ml)
Sampel 0 jam 24 jam Kenaikan (+) atau
Penurunan (-) populasi
E. coli 8,26±0,06 10,09±0,01a (+) 1,83
YP 8,16±0,03 6,26±0,07b (-) 1,9 YPR 8,16±0,03 6,07±0,08b (-) 2,09
YP: yoghurt + L. acidophillus IIA-2B4; YPR: yoghurt + L. acidophillus IIA-2B4 + ekstrak bunga rosela; Huruf pada baris yang sama menunjukkan berbeda nyata pada taraf uji 5%
Hasil pengujian menunjukkan bahwa fragmen peptida pada YP dan YPR dibawah 10 kDa dapat menghambat pertumbuhan bakteri E.coli pada 24 jam. Hasil
tersebut menunjukkan bahwa bakteri Gram negatif terhambat oleh adanya kontribusi dari peptida dengan fragmen dibawah 10 kDa yang dihasilkan dalam proses proteolisis. Mekanisme peptida sebagai antimikroba secara garis besar dipengaruhi oleh interaksi antara peptida dengan membran bakteri yangkemudian diikuti dengan kerusakan membran,gangguan fisiologi membran seperti biosintesis dindingsel, pembelahan sel atau translokasi melewati membranuntuk berinteraksi dengan sitoplasma sel target (Hayes et al. 2006).
Analisis Kadar Fragmen Peptida
Hasil analisis fragmen peptida (Gambar 2) menunjukkan bahwa penambahan
L. acidophillus IIA-2B4 dan ekatrak bunga rosela pada yoghurt dapat meningkatkan
aktivitas proteolisis pada yoghurt. Oleh karena itu dilakukan pengujian kandungan peptida pada yoghurt yang telah mengalami separasi dibawah 10 kDa dengan menggunakan metode Lowry. Hasil yang diperoleh dapat dilihat pada Tabel 6.
Tabel 6. Analisis kadar peptida pada yoghurt yang telah diseparasi
Sampel Kadar Peptida (µg/mL)
Y 11.46 ± 0.01c
YR 11.41 ± 0.01c
YP 12.1 ± 0.04a
YPR 12.8 ± 0.02b
Y: yoghurt kontrol; YR: yoghurt + ekstrak bunga rosela; YP: yoghurt + L. acidophillus IIA-2B4; YPR: yoghurt + L. acidophillus IIA-2B4 + ekstrak bunga rosela; Huruf pada kolom yang sama menunjukkan berbeda nyata pada taraf uji 5%
Hasil pengujian menunjukkan bahwa yoghurt yang ditambahkan L. acidophillus IIA-2B4 memiliki kandungan peptida yang tinggi dibandingkan
dengan yoghurt (kontrol) dan dengan penambahan ekstrak bunga rosela. Hal tersebut disebabkan probiotik L. acidophillus IIA-2B4 dapat meningkatkan
aktivitas proteolisis protein (Afiyah et al. 2015). Selain itu hasil pengujian
17 Peptida hasil fermentasi susu mempunyai aktivitas ganda. Peptida tersebut dapat berfungsi sebagai antimikroba serta inhibitor Angiotensin-converting enzyme
(ACE) sehingga dapat digunakan untuk pencegahan dan pengobatan hipertensi (Lopez- Exposito et al. 2007). Oleh karena itu dilakukan analisis antihipertensi pada
yoghurt dengan penambahan L. acidophillus IIA-2B4 dan atau tanpa ekstrak bunga
rosela untuk mengkonfirmasi hal tersebut.
Analisis Antihipertensi
Hipertensi adalah suatu keadaan tekanan darah sistolik ≥140 mmHg dan diastolic ≥90 mmHg. Hipertensi sering disebut dengan silent killer. Hal tersebut
disebabkan penderita hipertensi mengalami penyakit tersebut tanpa gejala (asymptomatic) selama beberapa tahun dan dapat menimbulkan komplikasi.
Penyakit yang tidak menular ini telah menjadi masalah di dunia karena pravelensinya yang semakin meningkat serta berhubungan dengan penyakit kardiovaskuler, stroke dan penyakit ginjal (Actis-Goretta et al. 2003).
Angiotensin Converting Enzyme (ACE) merupakan enzim yang berperan
dalam mengatur tekanan darah dalam sistem Renin-Angiotensin (RAS) (Quiros et al. 2005). ACE mengkatalisis konversi dekapeptida angiotensin I menjadi
oktapeptida angiotensin II. ACE bekerja dengan cara melepas dipeptida pada terminal C dari angiotensin I menghasilkan angiotensin II dan asam hipurat (Actis-Goretta et al 2003). Angiotensin II menstimulasi sintesis dan pelepasan aldosteron
yang meningkatkan tekanan darah dengan menaikkan penyimpanan sodium di tubulus distal (FitzGerald dan Murray 2006). Kerja ACE dapat menimbulkan dampak yaitu tingginya tekanan darah. Penghambatan ACE adalah salah satu cara untuk menurunkan resiko terjadinya tekanan darah tinggi.
Proses fermentasi pada susu dapat menghasilkan kemampuan dalam menghambat enzim ACE (Quiros et al. 2005). Hal tersebut disebabkan pada proses
fermentasi kultur bakteri memecah protein menjadi peptida yang memiliki sifat menghambat ACE. Donkor et al. (2007) menyatakan bahwa peptida pada susu
memiliki kemampuan menghambat ACE sebesar 52% dengan nilai IC50 sebesar 12.41 µg/mL.
Kandungan peptida pada YP dan YPR lebih besar dibandingkan dengan Y dan YR (Tabel 6). Oleh karena itu analisis antihipertensi hanya dilakukan pada YP dan YPR. Konsentrasi peptida yang dibutuhkan untuk menghambat 50% kerja ACE disebut IC50. Kemampuan yoghurt dalam menghambat enzim ACE dan IC50 dapat dilihat pada Tabel 7.
Tabel 7. Aktivitas menghambat enzim ACE pada yoghurt probiotik (YP) dan yoghurt probiotik rosela (YPR)
Sampel Penghambatan ACE (%) IC50 (µg/mL)
YP 20.40±1.68a 21.48±0.01c
YPR 37.76±1.43b 13.87±0.01d
Huruf berbeda pada kolom yang sama menunjukkan berbeda nyata pada taraf uji 5%
18
menunjukkan bahwa kemampuan YPR dalam menghambat ACE lebih besar dibandingkan dengan YP. Perbedaan kemampuan dalam menghambat ACE tersebut salah satunya disebabkan oleh kandungan peptida YPR yang lebih tinggi dibandingkan dengan YP (Tabel 6). Hal ini sesuai dengan penelitian Donkor et al
(2007) yang menyatakan bahwa peptida yang dihasilkan dari proses fermentasi berperan dalam aktivitas penghambatan ACE pada yoghurt disebabkan adanya kombinasi antara S. thermophillus dan L. bulgaricus, penghambatan ACE pada
yoghurt meningkat dengan penambahan probiotik (Donkor et al. 2007). Probiotik
yang berperan dalam penelitian ini adalah L. acidophilus IIA-2B4.
Tabel 7 menunjukkan bahwa penambahan ekstrak bunga rosela pada yoghurt probiotik mempengaruhi (P<0.05) kemampuan menghambat ACE dan penambahan ekstrak bunga rosela yang digunakan berpengaruh nyata (P<0.05) pada nilai IC50. Hal tersebut disebabkan ekstrak bunga rosela secara akumulatif berkontribusi dalam menghambat ACE (Ojeda et al. 2010). Aktivitas antihipertensi
pada ekstrak bunga rosela disebabkan oleh komponen fitokimia yaitu flavonoid. Mekanisme flavonoid dalam menghambat ACE adalah menghambat pembentukkan angiotensin II (Kwon et al. 2010). Kandungan flavonoid pada
ekstrak bunga rosela yang paling berperan dalam penghambatan ACE adalah antosianin (Ojeda et al. 2010).
4
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Penambahan probiotik L. acidophilus IIA-2B4 dengan atau tanpa ekstrak
bunga rosela dapat meningkatkan aktivitas antimikroba yoghurt baik terhadap Gram positif maupun negatif serta dapat meningkatkan produksi fragmen peptida dibawah 10 kDa yang kemudian berkontribusi pada sifat antimikroba dan antihipertensi. Selain itu, kualitas fisik, kimia dan mikrobiologi yoghurt susu kambing yang ditambahkan probiotik dan ekstrak bunga rosela tersebut sesuai dengan SNI yoghurt.
Saran
Perlu adanya evaluasi mengenai pengaruh penyimpanan terhadap karakteristik secara fisik dan kimia pada yoghurt probiotik yang ditambahkan ekstrak rosela dan diperlukan uji organoleptik untuk mengetahui penerimaan konsumen terhadap yoghurt tersebut. Selain itu diperluan uji secara in-vivo
19
DAFTAR PUSTAKA
[AOAC] Association of Official Analytical Chemist. 2007. Official Methods of Analysis. Washington, DC.
[BSN] Badan Standardisasi Nasional. 2009. SNI. 01-2981-2009: Susu fermentasi.
Jakarta (ID): Badan Standardisasi Nasional.
Actis-Goretta L, Ottaviani JI, Keen CL, and Fraga CG. 2003. Inhibition of angiotensin converting enzyme (ACE) activity by flavan-3-ols and procyanidin. FEBS Lett 555:597-600
Adam MA. and Andy. 2011. Adding of roselle (Hibiscus sabdriffa Linn) flower
extract for improvement quality of yoghurt. Journal Agrisistem 7: 1858-4330. Adedayo O, Ademiluyi L, dan Ganiyu O. 2012. Aqueous Extracts of Roselle (Hibiscus sabdariffa Linn.) Varieties Inhibit a-Amylase and a-Glucosidase Activities In Vitro. J Med Food 16 (1) 2013, 88–93
Afiyah DN, Arief II dan Budiman C. 2015. Proteolytic characterization beef fermented sausage inoculated by Indonesian probiotic Lactobacillus acidophilus IIA-2C14 and Lactobacillus acidophilus IIA-2B4. Advance
Journal of Food Science and Technology (Inpress).
Alakomi HL, Skytta E dan Saarela M. 2000. Lactic acid permeabilizes gram negatif bacteria by disrupting outer membrane. Applied and Environmental Microbiology. 66 (5): 20012005.
Arief II, Betty SLJ, Made A, Kazuhito F dan Arief BW. 2015. Identification and probiotics characteristics of lactic acid bacteria isolated from Indonesian local beef. Asian Journal of Animal Science 9 (1): 25 – 36.
Atanasova J, dan Ivanova I. 2010. Antibacterial peptides from goat and sheep milk proteins. Biotechnol Equip.24:1799-1803.
Bintang M. 1993. Studi antimikroba dari Streptococcus lactis BCC2259 [disertasi].
Bandung (ID): Institut Teknologi Bandung.
Chuayana ELJ, Ponce CV, Rivera MRB and Cabrera EC. 2003. Antimicrobiology activity of probiotic from milk product. Philippine Journal Microbiology Infectious Diseases 32: 71-74.
Commane D, Hughes R, Shortt C, dan Rowland I. 2005. The potential mechanisms involved in the anticarcinogenicaction of probiotics. Mutation Research 591: 276-289.
Cowan M. 1999. Plants products as antimicrobial agents. Clinical Microbiology (12) 4: 564-582.
Donkor ON, Henriksson A, Vasiljevic T, dan Shah NP. 2006. Effectof acidification on the activity of probiotics in yoghurt during cold storage. International Dairy Journal, 16, 1181–1189.
Fitzgerald RJ, and Meisel. 1999. Lactokinins: whey protein-derived ACE-inhibitory peptidas. Nahrung43:165-167
FitzGerald RJ, Murray BA, Walsh DJ. 2004. Hypotensive peptides from milk proteins. J Nutr 134: 980S-988S.
Hayes M, Stanton C, Slattery H, O’sullivan O, dan Hill C. 2007. Casein fermentate
of Lactobacillus animalis dpc6134 contains a range of novel propeptida
20
Khuruna HK dan Kanawijaya SK. 2007. Recent trends in development of fermented milks. J Cur Nutr Food Sci 3: 91 – 108.
Kwon EK, Lee DY, Lee H, Kim DO, Baek NI, Kim YE, dan Kim HY. 2010. Flavonoid from the buds of rosa damascene inhibit the activity of 3-hydroxy-3-methylglutary-coenzyme a reductase and angiotensin I-converting enzyme. J Agric Food Chem 58:882-886
LaemmLi UK. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-85.
Lako J, Trenerry VC, Wahlqvist M, Wattanapenpaiboon N, Sotheeswaran S dan Premier R. 2007. Phytochemical flavonols, carotenoids and the antioxidant properties of a wide selection of Fijian fruit, vegetables and other readily available foods. Food Chemistry 101: 1727-1741.
Lopez-Exposito I, Amigo L dan Recio I. 2008. Identification of the initial binding sites of αs2-casein f (183-207) and effect on bacterial membranes and cell morphology. Biochim Biophys Acta. 1778 Issue 10. p. 2444-2449
Lowry OH, Roserbrough NJ, Farr AL dan Randall RJ. 1951. Protein measurement with the folin phenol reagent. Journal Biology Chemistry 193: 265-275 Martin DAB, Janer C, Pelaez C dan Requena T. 2003. Development of a fermented
goat’s milk containing probiotic bacteria. International Dairy Journal 13: 827-833.
Mattjik AA dan Sumertajaya M. 2000. Perancangan Percobaan. Jilid 1 (1). Bogor
(ID): IPB Pr.
Naidu AS. 2000. Natural Food Antimicroba System. USA: CRC Press.
Nzikou JM, Bouanga-Kalou G, Matos L, Ganongo-po FB, Mboungou-Mboussi PS dan Moutoula FE. 2011. Characteristic and nutricional evaluation of seed oil
from Hibiscuss sabdarifa L in Congo-Brazzaville. Current Research journal
of Biological Science 3(2) 141-146
Odigie LP, Ettarth RR, dan Adigun SA. 2003. Chronic administration of aqueous extract of Hibiscuss sabdariffa attenuates hypertension and reverse cardiac
hypertrophy in 2K-1C hypertensive rats. Journal of Ethnapharmacology 86 181-185
Ohiokpehai O. 2003. Processed food products and nutrient composition of goat milk. Pakistan Journal of Nutrient 2 (2): 6871, 2003.
Ojeda D, Jimenez-Ferrer E, Zamilpa A, Hererra-Arellano A, Tortoriello J, dan Alvarez L. 2010. Inhibiton of angiotensin converting enzyme activity by the
anthocyanins delphinidin and cyaniding-3-0-sambubiosides from Hibiscuss sabdariffa. Journal of Ethnopharmacology 127 (1) 7-10
Olaleye MT. 2007. Cytotoxicity and antibacterial activity of Methanol extract of
Hibiscus sabdariffa. Journal of Medicinal Plants Research 1: 9-013.
Pelezar MJ dan Chan ECS. 2007. Dasar-dasar mikrobiologi Jilid I. Terjemahan Hadioetomo RS, Imas T, Tjitrosomo SS, Angka SL. Jakarta (ID): Indonesia Press.
Purushotham KG, Arun P, Jayarani JJ, Vasnthakumari R, Sankar L, Reddy BR. 2010. Synergistic in vitro antibacterial activity of Tectona grandis leaves with
tetracycline. Int J of Phr Rsc. 2(1): 519-523.
21 Rahman A, Fardiaz S, Rahaju WP, Suliantari dan Nurwitri CC. 1992. Teknologi Fermentasi Susu. Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi. Institut Pertanian Bogor, Bogor
Schnurer J dan Jesper M. 2005. Antifungal lactic acid bacteria as bio preservatives. Trends in Food Science and Technology 16: 70–78.
Schlegel HG dan Schmidt K. 1994. Mikrobiologi Umum. Baskara T, Penerjemah. Yogyakarta: Gajah Mada University Press.
Surono IS. 2004. Probiotik Susu Fermentasi dan Kesehatan. Jakarta (ID): Tri Cipta Karya.
Tsai PJ, Melntosh J, Pearce P, Camden B dan Jordan BR. 2002. Anthocyanin and antioxidant capacity in roselle (Hibiscus sabdariffa L) extract. Food Research
International 35: 351-356.
Tziboula-Clarke A. 2003. Encyclopedia of Dairy Science. 2nd edition. Academics Press. USA: California.
Vesterlund S, dan Ouwehand AC. 2004. Antimicrobial components from lactic acid bacteria. In: S. Salminen dan A. Von Wright (Eds). Lactic Acid Bacteria, Microbiology and Functional Aspect. Marcel Dekker, Inc. London.
Winarno FG. 1997. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia
22
Lampiran 1. Analisis Ragam Sifat Fisik, Kimia dan Proksimat dan Uji Lanjut
23 Viskositas
Perlakuan N Subset untuk alpha = 0.05
1 3 2.733
2 3 3.733
3 3 3.067
4 3 3.863
Abu
Perlakuan N Subset untuk alpha = 0.05
1 3 0.957
2 3 0.91
3 3 0.892
4 3 0.884
Kadar Air
Perlakuan N Subset untuk alpha = 0.05
1 3 79.66
2 3 78.065
3 3 77.892
4 3 72.343
Lemak
Perlakuan N Subset untuk alpha = 0.05
1 3 15.732
2 3 13.793
3 3 10.862
4 3 10.383
Protein
Perlakuan N Subset untuk alpha = 0.05
1 3 3.722
2 3 3.717
3 3 3.632
24
Lampiran 2. Analisis Ragam Serta Uji Lanjut Total BAL dan Antimikroba
25
Antimikroba Yoghurt Utuh
S.aureus N Subset untuk alpha = 0.05
1 3 18.147
2 3 11.778
3 3 5.6400
4 3 2.9933
5 3 2.1833
Antimikroba Yoghurt Setelah Diseparasi
B.cereus N Subset untuk alpha = 0.05
1 3 0.0000
2 3 2.9050
3 3 2.6683
4 3 0.0000
5 3 0.0000
Antimikroba Yoghurt Setelah Diseparasi
S.thypii N Subset untuk alpha = 0.05
1 3 0.0000
2 3 2.9933
3 3 2.9800
4 3 0.0000
5 3 0.0000
Lampiran 3. Analisis Ragam Serta Uji Lanjut Kandungan Fragmen Peptida
JK db KT F P
Perlakuan 3.673 3 1.224 24.9 0.0002
Galat 3.933 8 4.917
Total 7.506 11
Perlakuan N Subset untuk alpha = 0.05
1 3 0.1147
2 3 0.1140
3 3 0.1210
26
Lampiran 4. Analisis Ragam Serta Uji Lanjut Antimikroba Fragmen Peptida
JK Db KT F P
Perlakuan 30.952 2 15.476 135 0.00
Galat 0.688 6 0.114
Total 31.641 8
Uji Tuckey
Perlakuan N Subset untuk alpha = 0.05
1 3 10.996
2 3 6.256
3 3 6.0900
Lampiran 5. Analisis Ragam Serta Uji Lanjut Penghambatan ACE
JK Db KT F P
Perlakuan 452.280 1 1.224 452.280 0.0060
Galat 63.796 4 15.949
Total 516.077 5
Uji Tuckey
Perlakuan N Subset untuk alpha = 0.05
1 3 37.763
27
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan pada tanggal 6 Desember 1990 di Bandung, Jawa Barat. Penulis adalah anak pertama dari dua bersaudara dari pasangan Bapak Abu Hanifah dan Ibu Enah Hanifah.
