RANCANG BANGUN PENGHITUNG KOLONI SELEKTIF
BERDASARKAN PIGMEN FLUORESEIN PADA
Pseudomonas aeruginosa
SUYONO
PROGRAM STUDI BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
ABSTRAK
SUYONO. Rancang Bangun Penghitung Koloni Selektif Berdasarkan Pigmen
Fluoresein pada
Pseudomonas aeruginosa
. Dibimbing oleh AE ZAINAL
HASAN, I MADE ARTIKA, dan M. MAMAN R.
Bakteri
Pseudomonas aeruginosa
bersifat patogen, mudah tumbuh dalam
media sederhana, dan masuk Standar Nasional Indonesia (SNI) 2006 untuk air
minum dalam kemasan. Bakteri ini dapat diidentifikasi dengan uji genetik,
biokimia, dan induksi pigmen. Uji genetik dan biokimia memerlukan prosedur
yang rumit, berbeda dengan induksi pigmen. Pigmen ini merupakan sinyal
biologis yang dapat menunjukkan keberadaan bakteri. Bakteri
Pseudomonas
aeruginosa
dapat menghasilkan pigmen fluoresein yang membedakannya dari
bakteri selain genusnya dan piosianin dari spesies lain dalam genus
Pseudomonas
.
Tujuan penelitian ini untuk klarifikasi metode cepat tersebut terhadap isolat
P.
aeruginosa
lokal dan desain penghitung koloni untuk membantu kuantifikasi
selektif terhadap koloni bakteri berfluoresensi ini. Bakteri lokal diisolasi dari air
minum dengan penyaringan
milipore
0.45 µm, lalu diuji biokimia dengan
menggunakan kit, dan induksi pigmen. Kuantifikasi koloni didukung oleh alat
penghitung koloni, terdiri atas perangkat keras dan program. Program dibuat
dengan
Visual Basic
dengan metode
plotting
(merajah) 24 bit menggunakan
pointer
(penunjuk) dan metode kuantifikasi menggunakan simulasi sel. Uji
biokimia menunjukkan tingkat kepercayaan
P. aeruginosa
97% dan nitrase
negatif. Panjang gelombang absorbansi fluoresensinya 370 nm, sedangkan
emisinya 508 nm. Ketepatan kuantifikasi koloni 88.93% menggunakan metode
ABSTRACT
SUYONO. Design of Selective Colony Counter Based Fluorescein Pigment of
Pseudomonas aeruginosa
. Under the direction of AE ZAINAL HASAN, I MADE
ARTIKA, and M. MAMAN R.
RANCANG BANGUN PENGHITUNG KOLONI SELEKTIF
BERDASARKAN PIGMEN FLUORESEIN PADA
Pseudomonas aeruginosa
SUYONO
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Program Studi Biokimia
PROGRAM STUDI BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul Skripsi : Rancang Bangun Penghitung Koloni Selektif Berdasarkan Pigmen
Fluoresein pada
Pseudomonas aeruginosa
Nama
: Suyono
NIM
: G44104023
Disetujui
Komisi Pembimbing
Ir. H.A.E. Zainal Hasan, M.Si Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc
Ketua Anggota
Ir. M. Maman R, M.App.Sc
Anggota
Diketahui
Dr. drh. Hasim, DEA
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala nikmat dan
anugerah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah yang berjudul
Rancang Bangun Penghitung Koloni Selektif Berdasarkan Pigmen Fluoresein
pada
Pseudomonas aeruginosa
. Penelitian ini telah dilaksanakan dari bulan Maret
sampai Desember 2008 di Laboratorium Biokimia IPB. Penelitian ini terlaksana
berkat bimbingan Ir. H.A.E. Zainal Hasan, M.Si, Dr. Ir. I Made Artika,
M.App.Sc, yang mendukung penelitian bermuatan bioinformatika ini.
Terima kasih penulis ucapkan kepada drh. Sulistiyani, M.Sc., Ph.D yang
telah memberikan kuliah mengenai interaksi sel sehingga mengilhami metode
simulasi sel untuk menghitung koloni bakteri. Terima kasih penulis sampaikan
kepada Ir. M. Maman R, M.App.Sc yang menjembatani penulis dengan Balai
Besar Industri Agro dalam melakukan penelitian. Terima kasih penulis kepada
laboran Biokimia atas semua bantuannya. Ucapan terima kasih juga penulis
sampaikan kepada teman-teman seperjuangan di lab (Dedy, Indra, Fitri, Faridha,
Aswan). Terima kasih kepada teman-teman biokimia 41 atas kebersamaan dan
kekompakannya hingga ke pentas penelitian ini.
Penghargaan tinggi penulis sampaikan kepada orang tua, adik, dan kakak
tercinta atas dorongan semangat, kesabaran, dan bantuan langsungnya. Penulis
merasa banyak kekurangan, baik pada substansi penelitian maupun penulisannya.
Hasil yang didapat lebih banyak karena keberuntungan daripada usaha. Oleh
karena itu, penulis meminta kritikan yang membangun penyempurnaan karya
ilmiah ini. Semoga karya ini bermanfaat bagi para pembaharu bioinformatika,
bioanalisis, dan bioinstrumentasi yang merupakan multidisiplin biokimia.
Bogor, Maret 2009
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Pemangkat, Kalimantan Barat pada tanggal 18 Mei
1984 dari ayahanda Dji Fuk Sin dan ibunda Then Siu Kheng. Penulis merupakan
anak ketiga dari 6 bersaudara. Tahun 2004 penulis lulus dari SMU Negeri 1 Bogor
dan tahun yang sama lulus seleksi masuk Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui
jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) pada Program Studi Biokimia,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA).
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah mengikuti kegiatan Praktik
Lapangan di Laboratorium Mikrobiologi, Balai Besar Industri Agro, Bogor
selama periode Juli sampai Agustus 2007 dengan judul Uji Angka Lempeng,
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR ... viii
DAFTAR LAMPIRAN ... viii
PENDAHULUAN ... 1
TINJAUAN PUSTAKA
Hitungan Cawan ... 1
Bakteri
Pseudomonas aeruginosa ...
2
Media Selektif
Pseudomonas
... 2
Antibakteri ... 4
Ultraviolet ... 4
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat ... 5
Metode Penelitian ... 5
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi dan Induksi Bakteri ... 7
Kontruksi Alat ... 9
Desain Program ... 11
SIMPULAN DAN SARAN ... 15
DAFTAR PUSTAKA ... 16
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Isolasi
P. aeruginosa
pada
kertas
milipore
0.45 µm ... 7
2 Pigmen fluoresein
P. aeruginosa
... 7
3 Pigmen piosianin ... 7
4 Fluoresein pada koloni ... 8
5 Emisi fluoresensi kultur cair bakteri
P. aeruginosa ...
9
6 Kotak foto petri ... 9
7 Tampilan program ... 11
8 Ketepatan hitungan program terhadap koloni
P. aeruginosa
dengan
metode warna terpasang ... 15
9 Ketepatan hitungan program terhadap koloni
P. aeruginosa
dengan
metode
sampling
warna ... 15
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Tahapan penelitian ... 19
2 Isolasi
P. aeruginosa
dan uji biokimia ... 20
3 Pengukuran fluoresensi dengan spektrofluorometer ... 21
4 Koloni bakteri dengan metode cawan sebar ... 22
5 Ketepatan dan ketelitian hitungan koloni ... 24
6 Kalibrasi skala gambar tangkapan kamera ... 27
7 Pengaturan penerangan ... 28
8 Tampilan alat dan program ... 29
9 Rangkaian komponen elektronik ... 31
1
PENDAHULUAN
Teknik konvensional penentuan jumlah bakteri adalah plate count atau angka lempeng. Prosedur ini dilakukan dengan menghitung koloni yang mewakili pertumbuhan satu sel dari bakteri yang dibiakkan dalam media pengkayaan. Hitungan koloni umumnya didapatkan secara manual. Kerumitan terjadi bila jumlahnya lebih banyak dari 300 koloni atau berukuran kecil. Kerumitan bertambah lagi jika koloni perlu perlakuan khusus seperti induksi fluoresensi dengan ultraviolet (UV), contohnya kuantifikasi sekaligus konfirmasi koloni Pseudomonas aeruginosa. Bakteri P. aeruginosa mempunyai syarat nutrisi yang sederhana sehingga dapat tumbuh pada air destilata. Oleh karena itu, bakteri ini masuk syarat mutu Standar Nasional Indonesia (SNI) untuk air minum dalam kemasan tahun 2006.
Paparan UV diperlukan untuk menyeleksi atau konfirmasi bakteri ini, artinya metode ini merupakan deteksi cepat. Hitungan selektif terhadap koloni berfluoresen ini menjadi lebih sulit karena perlu studio gelap dan sumber UV. Masalah juga terjadi saat penanda hitungan/spidol tidak bisa digunakan karena sulit masuk ke studio tersebut. Kesulitan ini karena studio berukuran kecil, sehingga cahaya dapat masuk jika tangan atau spidol dimasukkan. Selain itu, paparan UV yang mungkin berbahaya jika terpapar dalam waktu lama.
Galat laboran atau manusia menjadi sulit dihindari dan akan membesar jika tidak ada hitungan ulang. Oleh karena itu, diperlukan alat bantu yang dapat menjadi referensi perhitungan atau mempermudah dengan cara memperbesar atau memberikan tanda. Alat tersebut adalah colony counter (penghitung koloni), tetapi dioperasikan secara manual, artinya masih tergantung pada manusia. Sejalan dengan perkembangan dunia elektronik, lahirlah komputer yang menjadi alat bantu dan otomatisasi rutinitas manusia. Otomatisasi utama yang berasal dari komputer sarat keakuratan, ketelitian, dan kecepatan sehingga memperbaiki analisis. Selain itu, komputer juga memberikan kemudahan dalam penyimpanan informasi dan akses database
Sisi keunggulan dari komputer bila dipadukan dalam kehidupan kerja manusia dapat mengurangi aspek human error.
Sekarang, komputer memainkan peranan penting dalam desain, eksekusi, dan analisis penelitian. Komputer tidak mengubah pikiran peneliti atau metodenya, formulasi hipotesis,
falsifikasi teori dan model, tetapi mempengaruhi dinamika perkembangan laboratorium modern. Komputer dapat menghitung jumlah sel dalam petri, menghitung besar inti sel tumor ginjal melalui mikroskop, merekam aktivitas listrik isolat sel syaraf terduga pada penyakit sakit kepala kronik, dan membaca sekuen informasi dari elektroforesis gel yang telah dilabel dengan radioaktif (Buehler dan Rashidi 2005).
Tujuan penelitian ini untuk deteksi cepat koloni selektif-fluoresensi P. aeruginosa
dengan kontruksi perangkat keras dan lunak yang menghubungkan analisis laboratorium dengan komputer. Deteksi cepat ini juga akan diklarifikasi dengan memakai isolat lokal pada media referensi, media modifikasi, dan penginduksinya lainnya. Media referensi adalah Pseudomonas base penginduksi piosianin yang ditambahkan suplemen CN (Cetrimide-Nalidixic). Media modifikasinya adalah King’s B. Faktor penginduksi yang akan ditinjau adalah panjang gelombang absorbansi fluoresensi dan emisi, suplemen antibakteri, dan bahan tambahan lain di luar referensi.
Hipotesis penelitian adalah otomatisasi hitung koloni dengan komputer dapat menjadi alat bantu yang meningkatkan ketelitian, ketepatan, dan kemudahan perhitungan bakteri selektif-fluoresen P. aeruginosa. Manfaat penelitian ini secara khusus untuk memberikan kemudahan bagi laboran dalam menghitung koloni yang perlu paparan ultraviolet dan secara umum untuk merintis pengembangan instrumentasi laboratorium di Indonesia.
TINJAUAN PUSTAKA
Hitungan Cawan
Metode hitungan cawan merupakan cara yang akurat untuk menentukan jumlah mikrob karena hanya sel yang masih hidup yang dihitung. Selain itu, beberapa jenis mikrob dapat dihitung sekaligus dan dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikrob. Bakteri harus dapat tumbuh dalam medium padat dan membentuk koloni yang kompak dan jelas (tidak menyebar) dan memerlukan persiapan waktu inkubasi relatif lama sehingga pertumbuhan koloni dapat dihitung (Adiprabowo 2008).
2
akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat langsung dihitung menggunakan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode hitungan cawan dapat dibedakan atas dua cara yaitu metode tuang (pour plate) dan metode permukaan (surface/spread plate).
Dalam metode hitungan cawan, sampel yang diperkirakan mengandung lebih dari 300 sel/ml memerlukan pengenceran sebelum ditumbuhkan di dalam cawan petri. Setelah inkubasi akan terbentuk koloni pada cawan tersebut dalam jumlah yang masih dapat dihitung, dimana jumlah yang terbaik adalah diantara 30-300 koloni. Pengenceran biasanya dilakukan secara desimal yaitu 1:10, 1:100, 1:1000 dan seterusnya, atau 1:100, 1:10000, 1:1000000 dan seterusnya. Larutan yang digunakan untuk pengenceran dapat berupa larutan NaCl 0.9% dan bufer fosfat. Jumlah koloni dalam contoh yang dihitung atau koloni/ml yaitu jumlah koloni per cawan dikali faktor pengenceran (Adiprabowo 2008). Metode ini umum dilakukan untuk berbagai bakteri, dan lebih condong ke angka lempeng total (ALT). Angka total ini menyatakan kuantitas berbagai jenis bakteri mesofil aerob. Metode ALT untuk menumbuhkan bakteri mesofil aerob pada media yang mendukung pertumbuhan mikroorganisme secara luas. Hal ini karena media yang digunakan mengandung nutrisi standar yang tidak selektif dan dapat dimetabolisme banyak bakteri, sesuai dengan SNI yaitu Plate Count Agar (PCA) . Media ini diadaptasikan untuk bakteri yang hidup membutuhkan/tahan oksigen dan berada sekitar suhu kamar.
Bakteri Pseudomonas aeruginosa
Bakteri Pseudomonas aeruginosa adalah bakteri gram negatif, aerob, berbentuk bulat dengan diameter 0.5-0.8 µm, dan banyak ditemukan pada air, tanah, daerah lembab. Nama bakteri ini dapat ditelaah, yaitu “pseudo” artinya semu, “monas” artinya unit tunggal, “ae” artinya tua, dan “ruginosa” artinya berkerut atau tidak rata. Bakteri ini adalah patogen manusia. Hampir semua strain motil dengan satu flagel. Bakteri ini ditemukan di alam berada di biofilm terikat dengan beberapa permukaan atau berbentuk plangton, sebagai organisme uniseluler, dan aktif berenang, bahkan merupakan perenang tercepat (Kenneth 2008).
Isolat bakteri dapat membentuk tiga tipe koloni. Isolat dari tanah dan air membentuk koloni kecil dan kasar. Contoh klinik membentuk satu atau dua bentuk halus, yaitu
tampak seperti telur goreng, besar, tepi yang rata, dan terelevasi. Bentuk lainnya sering didapat dari sistem respirasi dan ekskresi urin membentuk lendir, yang merupakan produksi alginat. Bentuk halus dan mucoid memainkan peranan dalam virulensi (Kenneth 2008).
Medium sederhana yang biasa digunakan untuk kultur P. aeruginosa di laboratorium adalah asetat sebagai sumber karbon dan amonium sulfat sebagai sumber nitrogen. Faktor pertumbuhan organik tidak diperlukan dan bakteri ini dapat menggunakan lebih dari 75 bahan organik untuk tumbuh. Bakteri ini tahan pada kadar garam dan pewarna yang tinggi, antiseptik lemah, dan antibiotik umum. Antibiotik yang efektif melawan bakteri ini adalah aminoglikosida (gentamisin, amikasin, tobramisin), kuinolon (siprofloksasin and levofloksasin, tetapi tidak moksifloksasin), cephalosporins (seftazidim, sefepim, sefpirom, tetapi tidak cefuroksim, ceftriakson, cefotaksim), dan lain-lain. Semua antibiotik tersebut semuanya harus diinjeksikan kecuali fluorokuinolon. Sebaliknya, bakteri ini tahan terhadap nalidiksat hingga 15 µg/ml asam nalidiksat. jumlah ini sudah mampu menghambat sebagian besar flora mikrob (Goto dan Enomoto 1970).
Strain bakteri ini memproduksi tiga macam pigmen solubel, yaitu pigmen fluoresen, piorubin, dan piosianin. Produksi pigmen ini terutama bila ditumbuhkan pada media kurang besi. Piosianin referensi dari nanah biru yang merupakan karakteristik infeksi yang diakibatkan bakteri ini. Bakteri ini menyebabkan infeksi pada sistem urin, respirasi, dermatitis, gastrointestinal, komplikasi AIDS, dan menjangkiti luka bakar parah dan kanker . Waktu inkubasi bakteri ini biasanya 24-72 jam dan tumbuh optimum pada suhu 37oC. Bakteri ini mampu tumbuh pada suhu 42oC, berbeda dengan
Pseudomonas fluorecent (Atlas 1984).
Media Selektif Pseudomonas
3
pigmen piosianin).
Komposisi media menurut buku manual perusahaan Merck KGaA 2002 untuk menginduksi piosianin (tipe P) dalam satu liter air adalah pepton 20 g, MgCl2 1.4 g,
K2SO4 10.0 g, agar-agar 12.6 g , dan gliserol
10 ml. Komposisi tipe F adalah adalah pepton dari kasein 10.0 g, pepton dari daging 10.0 g, MgSO4 1.5 g, K2HPO4 1.5 g, agar-agar 12.0
g, dan gliserol 10 ml. Pepton mendukung pertumbuhan spesies Pseudomonas dalam spektrum luas. Media tipe P ini mengandung nutrisi untuk pembentukan piosianin dan/atau piorubin mereduksi fluoresein. Tipe F untuk pembentukan fluoresein dan menghambat pembentukan piosianin dan/atau piorubin. Kedua media ini dapat digunakan secara simultan sehingga mempercepat deteksi
Pseudomonas dan membedakannya
berdasarkan kemampuan yang berbeda dari beberapa strain. Strain ini ada yang dapat hanya membentuk piosianin, beberapa yang lain hanya materi fluoresein, dan yang lain lagi kedua zat warna, piosianin dan piorubin.
Bakteri Pseudomonas aeruginosa tumbuh pada agar tipe P membentuk koloni yang dikelilingi warna kuning hingga kehijauan karena menghasilkan fluoresein, warna biru hingga kehijauan saat piosianin dihasilkan dan merah hingga kehitaman saat piorubin dihasilkan. Fluoresein yang dihasilkan akan terlihat hijau terang (berfluoresensi) saat dipapari UV. Blazefick et al. (1973) mengatakan P. aeruginosa atipikal negatif piosianin tetapi positif fluoresein dapat dibedakan dari P. fluorecens dan P. putida. Brodsky dan Nixon (1973) melaporkan fluoresensi koloni P. aeruginosa dalam cahaya ultraviolet mengikuti pertumbuhan pada agar MacCONKEY sehingga dapat dieksploitasi untuk menyediakan tes cepat P. fluorecens dan P. putida yang tidak berfluoresensi dan hanya sedikit tumbuh pada media ini.
Media ini mengalami perkembangan dan modifikasi oleh Brown dan Lowbury (1965) sehingga sekarang digunakan untuk isolasi dan diferensiasi P. aeruginosa dari berbagai material (bakteri lain). Nama media ini menjadi Pseudomonas Selective Agar Base.
Medium ini direkomendasikan oleh States Pharmacopeia XXIII (1995) dan European Pharmacopeia II dan ini ekuivalen dengan spesifikasi medium di dalam DIN Norm 38411. Modifikasi medium ini dengan penambahan agen aktif permukaan atau surfaktan cetrimide (cetyltrimethylammonium bromide). Senyawa ini adalah antibakteri yang
menghambat sebagian besar pertumbuhan flora mikrob bersama/terintegrasi. Lowburry dan Collins (1955) menyatakan 0.3 g/l zat ini menghambat organisme terintegrasi secara memuaskan dan mengurangi interferensi dengan pertumbuhan P. aeruginosa. Produksi pigmen tidak dihambat bila ditumbuhkan dengan medium ini.
Hal lain yang perlu diketahui adalah komposisi media. Komposisi media agak berbeda dengan komposisi sebelumnya, yaitu pepton dari gelatin 20.0 g, MgCl2 1.4 g,
K2SO4 10.0 g,
N-cetyl-N,N,N-trimethylammoniumbromida (cetrimide) 0.3, dan agar-agar 13.0. Preparasi media ini dengan membentuk suspensi campuran 44.5 g dalam 1 liter (pH: 7.0 ± 0.2 pada 25 °C) air lalu ditambah 10 ml gliserol dan diautoklaf. Koloni P. aeruginosa akan memproduksi pigmen kuning kehijauan (piosianin) dan berfluoresensi di bawah sinar UV. Tes lebih lanjut sebaiknya dilakukan untuk identifikasi lanjut (Hugh dan Leifson 1953).
Media ini kembali ditingkatkan selektifitasnya sehingga tidak perlu tes lanjut dalam menentukan jumlah bakteri yang terkandung dalam contoh. Media ini bernama agar Pseudomonas C-N. Huruf C menyatakan
cetrimide dan N menyatakan nalidixic acid
(nalidiksat). Perubahan ini tampak dari penambahan senyawa nalidiksat sebagai antibakteri. Goto dan Enomoto (1970) merekomendasikan penambahan asam nalidiksat 15 µg /ml untuk menambah inhibisi flora terintegrasi. Medium ini direkomendasikan oleh DIN/EN 12780 untuk deteksi dan penentuan jumlah P. aeruginosa
dalam air dengan menggunakan membran filtrasi. Metode ini juga dapat dipakai pada contoh padat yang telah diencerkan.
Preparasi lain yang perlu diperhatikan adalah formulasi media, penyimpanan, respon positif, dan konfirmasi. Komposisi media ini adalah pepton dari gelatin 16.0 g, hidrolisat kasein 10.0 g, K2SO4 10.0 g, MgCl2 1.4 g,
agar-agar 11.0 g. Semuanya dalam 1 liter air, ditambah 10 ml gliserol dan suplemen CN (50 mg setrimida dan 3.75 mg nalidiksat). K2SO4
dan MgCl2 mendukung pembentukan pigmen
koloni. Setelah dituangkan dalam petri media ini akan tampak bersih dan bening dan dapat disimpan 4 minggu 2-8 oC, tetapi jangan sampai menjadi cair (saat suhunya 45-50oC selama 4 jam. Waktu inkubasi contoh adalah 44 ± 4 jam pada 36 ± 2°C. Semua koloni yang berwarna biru-hijau dapat dipastikan
4
berwarna biru-hijau tetapi berfluoresensi dengan cahaya UV adalah bakteri yang diduga sebagai P. aeruginosa, oleh karena itu perlu dikonfirmasi dengan larutan asetamid. Semua koloni merah-coklat yang tidak berfluoresensi juga terduga P. aeruginosa, konfirmasi dengan tes oksidase, larutan asetamid, dan media King’s B.
Metode identifikasi dengan induksi ultraviolet ini juga diterapkan pada deteksi cepat E. coli tetapi dengan senyawa aktif yang berasal dari luar, yaitu MUG. Paparan sinar ultraviolet yang digunakan juga 365 nm. Metode ini adalah metode lembaga AOAC yang diadaptasikan ke dalam FDA. Metode ini didasarkan pada bakteri E. coli yang mempunyai enzim spesifik -glukuronidase (GUD) yang tidak dimiliki bakteri enterik lainnya. Enzim ini dapat memecah 4-metilumbeliferil -D-glukuronida (MUG). Reaksi ini membebaskan 4-metilumbeliferil (MU) yang menyebabkan berfluoresensi bila dipapari cahaya ultraviolet. Penelitian Moberg
et al. menunjukkan pembacaan fluoresensi setelah 24 jam inkubasi memberikan keakuratan dalam memprediksi E. coli dan dapat mengidentifikasi tube positif E. coli
sekitar 83-95%. Setelah 48 jam inkubasi, 96-100% tube positif E. coli dapat diidentifikasi (Szabo et al. 1986).
Antibakteri
Antibakteri adalah zat yang dapat mengganggu pertumbuhan atau metabolisme bakteri. Antibakteri disebut juga antibiotik. Antibakteri dapat dibedakan menjadi dua jenis berdasarkan aktivitasnya, yaitu antibakteri yang menghambat pertumbuhan bakteri (bakteriostatik) dan membunuh bakteri (bakterisidal). Beberapa bahan yang mengandung aktivitas antibakteri diantaranya adalah fenol, alkohol, halogen, logam berat, deterjen, aldehida, dan kemosterilisator gas (Pelczar dan Chan 1988).
Mekanisme antibakteri dalam mengendalikan bakteri ada beberapa macam, yaitu memecah dinding sel, mengubah permeabilitas sel, mendenaturasi protein sel, menghambat kerja enzim, dan menghambat sintesis asam nukleat protein (Pelczar dan Chan 1988). Mekanisme tersebut sesuai kelompok bahan antibakteri yang digunakan. Kelompok alkohol bekerja dengan mendenaturasi protein dan merusak membran sel. Kelompok halogen (fluor, iodium, dan klor) bekerja dengan cara menginaktifkan enzim dan protein.
Selektifitas media Pseudomonas didukung oleh inhibitor pertumbuhan bakteri lain. Ada yang bersifat desinfektan atau antibiotik. Salah satunya adalah cetrimide/setrimida. Setrimida adalah senyawa yang umum digunakan sebagai desinfektan untuk isolasi selektif Pseudomonas aeruginosa dari campuran flora mikrob (Harper dan Cawston 1945). Senyawa ini berbentuk kristal putih, titik leleh 235oC, dan disebut juga alkiltrimetilamonium bromida, HTAB, atau CTAB. Nitrogen pusatnya bergabung dengan empat radikal organik dan satu radikal asam. Radikal tersebut dipersiapkan untuk membentuk agen alkilasi. Senyawa ini telah diuji dosis toksisnya pada tikus secara oral dengan nilai LD50 410 mg/kg. Senyawa ini juga bersifat antifungi, bersama 1-hidroksifenazin telah diteliti dapat digunakan untuk melawan pulmonary candidiasis oleh Kerr et al. (1999). Campuran senyawa ini pada media agar dengan konsentrasi rendah dari 0.1%-0.03% untuk pertumbuhan optimal
P. aeruginosa.
Selain setrimida, selektifitas isolasi bakteri
P. aeruginosa juga ditingkatkan dengan antibiotik nalidixic/nalidiksat. Asam nalidiksat merupakan antibiotik kuinolon. Senyawa ini mempunyai merek dagang Neggram dan Wintomylon. Asam ini efektif melawan bakteri gram positif dan negatif. Konsentrasi rendah zat ini menyebabkan bakteriostatik, saat konsentrasi tinggi menyebabkan bakterisidal. Nalidiksat terutama digunakan untuk infeksi sistem urin yang disebabkan oleh Escherichia coli,
Proteus, Shigella, Enterobacter, dan
Klebsiella. Zat ini digunakan juga untuk regulasi divisi bakteri. Senyawa ini selektif dan reversibel memblokir replikasi DNA pada bakteri tertentu. Asam nalidiksat ini menghambat subunit girase DNA dan menginduksi pembentukkan relaksasi kompleks analog (Anonim 2008).
Ultraviolet
5
menjadi hampir UV (panjang gelombang: 380–200 nm) dan UV vakum (200–10 nm). Ketika mempertimbangkan pengaruh radiasi UV terhadap kesehatan manusia dan lingkungan, jarak panjang gelombang sering dibagi lagi kepada UV A (400–315 nm) yang juga disebut long wave; UV B (315–280 nm) yang juga disebut "Gelombang Medium" (Medium Wave), dan UV C (280-200 nm) juga disebut short wave (Webb 2000).
Materi yang menyerap warna lebih dari cukup menyebabkan disosiasi molekul. Energi yang cukup atau panjang gelombang cahaya yang diserap sesuai, menyebabkan terjadi transisi elektron dari satu orbital ke orbital energi yang lebih tinggi, atau dinamakan eksitasi. Elektron yang tereksitasi akan kembali ke orbital dasar melalui empat mekanisme, yaitu konversi internal, fluoresensi, sistem silang fosforesensi atau konversi internal, dan interaksi dengan molekul lain. Emisi fluoresensi mempunyai panjang gelombang yang lebih panjang dari absorbsi (Lowry dan Richardson 1987).
Aplikasi utama UV adalah sterilisasi karena sifat utama yang destruktif terhadap materi biologis. Sifat ini diperoleh dari energinya yang tinggi sesuai dengan panjang gelombangnya yang pendek. Panjang gelombang yang biasa digunakan bersifat
germicidal (untuk sterilisasi) berada pada rentang 280 dan 100, yang sering digunakan adalah 254 nm. Aplikasi lainnya untuk lampu fluorensen/neon, sistem keamanan, astronomi, spektrofotometri, marker kimia, fotokemoterapi, deteksi api, dan lain-lain.
Ultraviolet umumnya dihasilkan dari eksitasi atom raksa. Prinsip ini umum untuk semua lampu neon atau tube lamp alias lampu fluoresen. Tabung lampu berisi uap raksa dan gas inert (tidak reaktif) argon pada tekanan yang rendah, ada pula yang ditambahkan kripton. Ujung lampu dihubungkan oleh dua elektroda. Elektroda yang disebut katoda ini akan mengeksitasikan atom raksa jika diberi tegangan tinggi melalui mekanisme plasma argon. Reaksi dari eksitasi ini menghasilkan energi radiasi gelombang elektromagnetik dalam kisaran ultraviolet.
Sumber UV yang umum digunakan untuk mikrobiologi mempunyai gelombang panjang 254 untuk sterilisasi/germisidal dan 366 nm untuk induksi fluoresensi. Lampu ini bisa berupa lampu neon atau Light Emitting Diode
(LED). Lampu neon, permukaan kacanya dilapisi fosfor europium yang didoping stronsium fluoroborat (SrB4O7F:Eu2+)
sehingga dapat melepaskan radiasi pada
panjang gelombang 368-371. Lampu UV yang digunakan 6 watt sudah cukup dan aman, bila lebih dari itu misalnya 15 watt diperlukan kaca pelindung.
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah media Pseudomonas Agar Base Pyocyanin (PABP), King’s B agar dan cair, setrimida 0.03 %, nalidiksat 1.5 %, HNO3
pekat, gliserol, NaCl 0.9 %, alkohol 70%, dan akuades steril. Bahan yang dibutuhkan untuk kontruksi alat adalah lampu ultraviolet 366 nm portabel 4 watt, Light Emitting Diode
(LED) putih, kamera digital atau webcam (resolusi minimal 1.3 megapiksel), kaca hitam 5 mm, kaca es 3 mm, aluminium (holo got, holo kotak, daun rolling door, lis, dll), karet penyangga kaca, kabel, baterai Ni-MH 8.4 V,
Integrated Circuit LM317, transformator step down 500 mA, potensiometer 5 K , trimpot 50 K , dioda IN4002, kapasitor, resistor,
heatsink (lempeng aluminium penurun panas), rangkaian inverter DC-AC tegangan tinggi,
dan Printed Circuit Board (PCB), sakelar tekan on-off, microswitch, skrup, paku rivet 3 mm, timah, danlem plastik-panas.
Alat-alat yang digunakan, diantaranya neraca analitik, pipet mikro, jarum ose, penyedot air untuk kertas milipore, petri, kit uji biokimia, vortex, spektrofotometer, spektrofluorometer, laminar air flow cabinet, inkubator, autoklaf, dan lemari pendingin. Alat-alat yang digunakan dalam kontruksi alat adalah komputer, multitester, solder, penyedot timah, bor listrik (mata bor 3 mm dan 1 mm), pistol rivet, cutter, pinset, gergaji, gunting kawat, obeng, dan tang.
Metode Penelitian
Isolasi Bakteri dan Induksi Pigmen
Air minum dalam kemasan disaring dengan kertas milipore 0.45 µm dan menggunakan alat penyedot/vakum air. Kertas
milipore ditaruh pada permukaan media
Pseudomonas Agar Base Pyocyanin (dalam petri) lalu dituangkan suplemen Cetrimide
-Nalidixic (CN). Setelah itu, petri diinkubasi 35 oC selama 24 jam atau lebih hingga hari ke tujuh. Koloni yang tumbuh diamati warnanya tanpa UV dan dengan UV 366 nm (longwave). Koloni positif P. aeruginosa
6
kehijauan. Induksi dengan UV menyebabkan fluoresensi hijau pada koloni.
Koloni positif tersebut disubkultur/diremajakan ke agar King’s B, diinkubasi 35 oC selama 48 jam. Koloni yang tumbuh, kemudian diuji biokimia dengan menggunakan kit biokimia. Koloni digores dengan jarum ose, lalu dicelupkan ke dalam 10 ml NaCl 0.9 % , larutan dikocok, kemudian diulangi hingga larutan menjadi keruh (suspensi). Sebanyak 100 µl suspensi bakteri diinjekkan ke masing-masing sumur kit, lalu diinkubasi 37 oC selama 24 jam.
Sebanyak 5 ml kultur cair bakteri P. aeriginosa ditempatkan di kuvet, lalu dianalisis panjang gelombang absorbansi dan emisinya dengan menggunakan spektrofluorometer. Absorbansinya diukur dengan memberikan radiasi cahaya putih, sedangkan emisi dengan menempatkan radiasi laser 410 nm berhadapan dengan detektor.
Setting jenis pengukuran dilakukan dengan perangkat lunak pada komputer, hasilnya berupa grafik dengan puncak panjang gelombang. Panjang gelombang emisi lampu ultraviolet juga diukur spektrofluorometer dengan menempatkan detektor berhadapan dengan lampu.
Kultur yang telah diidentifikasi diinduksi pada berbagai induser dugaan. Sebanyak 5 ml larutan disiapkan, larutan tersebut adalah King’s B, King’s B mengandung setrimida 0.03 %, King’s B mengandung nalidiksat 1.5 %, King’s B + 1 tetes HNO3, King’s B + 0.5
ml gliserol, King’s B + selulosa, dan lain-lain. Semua larutan diberi 1 inokulan bakteri, lalu diinkubasi 35 oC 24 jam. Konsentrasi daya induksi atau daya hambat ditentukan pada induser dugaan atau inhibitor yang teramati mempengaruhi produksi pigmen.
Kontruksi Alat dan Desain Program Kontruksi Alat. Sketsa alat dibuat pada kertas. Sketsa ini dimasukkan dalam komputer untuk dikontruksi ulang. Alat dikontruksi awal/prototipe dengan kardus, kemudian dikontruksi menggunakan rangka aluminium dan sekat dari papan melamin dan kaca. Komponen elektronik disketsa di atas kertas, kemudian dirakit pada Printed Circuit Board
(PCB) dan disolder menggunakan timah. Komponen tersebut adalah regulator tegangan 12 volt, regulator intensitas cahaya, inverter DC ke AC tegangan tinggi, sistem detektor panas, baterai, dan sinyal kelap-kelip (pembuang arus). Fungsi rangkaian tersebut diuji dan diperbaiki hingga berfungsi. Selanjutnya semua rangkaian elektronik
termasuk kamera diintegrasikan dalam kompartemen elektronik. Komponen tersebut diset sedemikian rupa hingga didapatkan tegangan, penerangan, dan tangkapan kamera yang sesuai.
Desain Program. Program dibuat dengan
Visual Basic 6 dan menggunakan program rutin Application Programming Inferface
(API) milik Windows. Tampilan program dibuat, lalu diberikan fungsi (kalkulasi dan perintah) dan pemicu kontrol. Fungsi dipecah dalam bentuk modul, lalu program modul dijalankan dan diujikan pada model koloni (gambar lingkaran). Kode diperbaiki dan diefektifkan, kemudian program dijalankan dan diujikan pada koloni sebenarnya. Tangkapan gambar petri dikalibrasi, setelah itu koloni pada berbagai petri dihitung dan ditentukan ketelitian dan ketepatannya.
Kalibrasi
Kalibrasi Alat. Gambar (input) bulatan kecil pada berbagai ukuran dan jarak, penggaris, dan lingkaran dibuat dan dicetak dengan printer. Sistem penerangan dihidupkan, kemudian gambar ditangkap oleh kamera dan disimpan dalam harddisk. Simpanan (output) dibandingkan dengan gambar inputnya, dalam hal keterpisahan, skala, dan distorsi.
Kalibrasi Program. Sebanyak 20 petri berisi koloni bakteri untuk pemeriksaan angka lempeng total dihitung secara manual dan dengan program penghitung koloni. Pembacaan oleh alat dilakukan dengan menaruh petri pada posisi tengah tangkapan kamera dengan posisi terbalik kemudian sistem penerangan yang terdiri atas lampu (LED) putih bawah dan atas diaktifkan. Setelah itu, gambar petri ditangkap oleh kamera, dihitung dengan program pada setting
yang sesuai. Bakteri P. aeruginosa
teridentifikasi disebar pada 6 petri berisi agar King’s B yang kemudian diinkubasi 35 oC selama 48 jam. Kultur Pseudomonas aeruginosa disebar masing-masing. Warna koloni diambil 5 kali dari salah satu petri dengan menggunakan pointer mouse
(penunjuk tetikus). Rentang warna baik merah, hijau, dan biru (jangkauan 0-255 satuan Red Green Blue (RGB)) dicatat oleh
7
sistem penerangan UV dan lampu (LED) putih bawah diaktifkan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi dan Induksi Bakteri
Bakteri lokal yang diisolasi dari air minum dalam kemasan yang beredar lokal. Isolasi menggunakan prosedur penyaringan dengan kertas milipore karena kuantitas bakteri yang kecil pada air minum, terutama yang dalam kemasan. Ukuran pori kertas milipore yang digunakan adalah 0.45 µm sesuai dengan prosedur SNI 1992 yang masih berlaku sampai sekarang. Kertas milipore ditaruh pada agar Pseudomonas Base Pyocyanin (PBP). Koloni P. aeruginosa berwarna biru kehijauan dan akan berfluoresensi kehijauan bila dipapari ultraviolet 366 nm (Gambar 1).
Selektifitas media didukung pula oleh penambahan suplemen antibiotik Cetrimide Nalidixic (CN). Bakteri yang didapat lalu diuji biokimia dengan menggunakan kit yang terdiri atas uji oksidase, nitrat, lisin, ornitin, H2S, glukosa, manitol, silosa, Orto-Nitro
Phenol Galaktosidase (ONPG), indol, urease, Voges Proskauer, sitrat, gelatin, malonat, inositol, sorbitol, ramnosa, sukrosa, laktosa, arabinosa, adonitol, rafinosa, salisin, dan arginin. Hasil kombinasi uji biokimia menunjukkan bakteri lokal ini menunjukkan tingkat kepercayaan P. aeruginosa sebesar 97%, tetapi ada hasil uji yang tidak biasa, yaitu negatif nitrase. Spesies ini umumnya positif nitrase.
Pigmen fluoresein berwarna hijau dan berfluoresensi jika dipapari ultraviolet (Gambar 2), sedangkan piosianin berwarna biru. Oleh karena itu, koloni P. aeruginosa
berwarna biru kehijauan dan berfluoresensi kehijauan saat dipapari ultraviolet (UV)
longwave. Koloni positif tersebut kemudian dimurnikan dengan subkultur ke media King’s B. Media ini merupakan media referensi untuk pertumbuhan bakteri genus Pseudomonas dan mendukung pembentukkan pigmen.
Gambar 1 Isolat P. aeruginosa pada kertas
milipore 0.45 µm.
(a) (b)
Gambar 2 Pigmen fluoresein P. aeruginosa: (a) tidak dipapari UV dan (b) dipapari UV.
Modifikasi media tersebut dimaksudkan untuk melihat induksi pigmen dengan media selain Pseudomonas Base Pyocyanin (PBP) dan memudahkan analisis faktor penginduksi. Faktor penginduksi lebih mudah diamati dengan mengeliminasi perkursor atau induser yang telah ada dalam paket referensi (PBP dan suplemen CN). Walaupun induksi warna gagal, tetapi pemurnian bakteri dengan media King’s B masih tetap dapat dilakukan. Hal ini karena bakteri murninya sudah diperoleh dari koloni tunggal yang terbentuk di media agar PBP dan bakteri dapat tumbuh pada media agar King’s B disertai produksi pigmen hijau. Pertumbuhan bakteri di media ini sudah terlihat pada inkubasi selama 24 jam.
Piosianin adalah marker/penanda yang dapat membedakan P. aeruginosa dengan bakteri berfluoresen lain, misalnya P. fluorecens. Pigmen fluoresein berhasil terinduksi pada King’s B (cair), sedangkan piosianin hanya terinduksi (positif) pada subkultur pertama. Pigmen piosianin mewarnai suspensi bakteri sehingga berwarna biru, sedangkan pigmen fluoresein mewarnai suspensi dengan warna hijau (Gambar 3). Piosianin dihasilkan saat bakteri yang dibiakkan pada King’s B berasal dari isolat paling awal dalam isolasi, yaitu dari media agar PBP. Kelarutan piosianin pada kultur cair ini tidak stabil, berbeda dengan fluoresein. Piosianin akan terpisah dan berada di permukaan bila didiamkan cukup lama. Gambar 3 Pigmen piosianin: positif
8
Piosianin tidak dihasilkan oleh bakteri saat subkultur kedua pada media King’s B. Hal ini menunjukkan ada bahan penginduksi piosianin pada media PBP, tetapi tidak dimiliki media King’s B. Hal ini diduga dari ion keberadaan ion tertentu, sesuai dengan pernyataan Frank dan DeMoss (1959), bahwa produksi piosianin dapat terjadi selama media tumbuh mengandung konsentrasi ion fosfat yang rendah dan cukup ion sulfat . Komposisi media PBP mengandung garam sulfat, tetapi tidak mengandung senyawa atau garam fosfat. Hal ini berbeda dengan King’s B yang mengandung komposisi garam fosfat (K2HPO4).
Fluoresein juga akan hilang jika kultur didinginkan atau disimpan dalam lemari pendingin (-4 oC) dan tidak dihasilkan bila kultur tersebut disubkultur lagi dari kultur yang lama. Peristiwa ini terlihat pada Gambar 4, satu koloni P. aeruginosa pada sebelah kanan petri tidak menghasilkan pigmen fluoresein atau tidak berfluoresensi. Fluoresein akan muncul lagi bila disegarkan terlebih dahulu dalam media cair yang mengandung bufer. Media cair yang digunakan adalah King’s B cair, karena komposisinya sederhana dan memiliki bufer untuk spesifikasi pertumbuhan Pseudomonas. Media ini juga digunakan untuk mengencerkan bakteri, bukan dengan NaCl 0.9 % karena dapat menghambat pembentukkan fluoresein. Hal ini diduga karena inhibisi oleh ion Cl-.
Induksi piosianin tidak berhasil dilakukan hanya dengan media King’s B saja. Oleh karena itu, induksi dilanjutkan dengan menambahkan bahan tertentu bersama media King’s B. Penambahan bahan ini diharapkan dapat menjadi induser atau mencekam bakteri. Induksi piosianin dengan penambahan setrimida 0.03% (300 ppm) dan kelipatannya, nalidiksat 1.5%, campuran keduanya, HNO3,
media berselulosa, gliserol berlebih.
Gambar 4 Fluoresein pada koloni: terinduksi (kiri) dan tidak (kanan).
Alasan penggunaan bahan-bahan tersebut, yaitu setrimida telah dilaporkan dapat menginduksi piosianin, sedangkan nalidiksat bersama setrimida diberikan sebagai suplemen penginduksi piosianin pada isolasi pertama (positif piosianin). Senyawa HNO3 menjadi
pertimbangan karena isolat lokal ini negatif nitrase dan piosianin dihasilkan dari isolat pertama setelah dikultur beberapa hari. Hal ini juga sesuai dengan prinsip adanya penggunaan oksigen terlarut dalam air untuk proses nitrasi (BOD tingkat 2, menghasilkan NO-3). Selulosa menjadi pertimbangan karena digunakan pada isolasi air minum, yaitu pada kertas milipore. Penambahan bahan-bahan tersebut gagal menginduksi piosianin, tetapi fluoresein berhasil terinduksi.
Setrimida tidak menginduksi fluoresein pada isolat lokal ini. Hasil percobaan menunjukkan bahwa fluoresein belum tentu terbentuk pada King’s B cair pada beberapa kali ulangan. Walaupun demikian, sudah jelas setrimida tidak menginduksi piosianin pada isolat lokal ini. Setrimida dan nalidiksat juga dapat menginhibisi pertumbuhan bakteri ini bila kadar berlebih. Dua kali lipat kadar referensi setrimida atau 2 x 0.03 % ternyata mampu menghambat bakteri ini hingga kultur cair tidak terlihat keruh.
Induksi dengan menggunakan bahan tambahan tidak berhasil, lalu muncul dugaan induksi berupa cekaman atau interaksi dari atau bersama bakteri asing. Penelitian akhirnya dilanjutkan dengan memberikan cekaman bakteri asing. Bakteri tersebut adalah kontaminan yang tumbuh pada kultur petri P.
aeruginosa sebelumnya dan bakteri
Escherichia coli. Selain itu, ketahanan bakteri ini dikecilkan dengan memberikan perlakuan setrimida dan mengecilkan jumlah bakteri dengan pengenceran sampai 10-3. Semua perlakuan tersebut dilakukan terhadap bakteri
P. aeruginosa (lokal) dalam lima ml King’s B cair. Hasil yang diperoleh menunjukkan piosianin tidak terinduksi pada semua perlakuan, berbeda dengan fluoresein. Tahap induksi ini tidak dilanjutkan lagi hingga pengujian pengaruh ion fosfat dan sulfat terhadap produksi pigmen piosianin dan fluoresein.
Radiasi ultraviolet (UV) diperlukan untuk menginduksi pigmen fluoresein agar dapat berfluoresensi. Panjang gelombang ultraviolet (UV) untuk menginduksinya adalah 366 nm
(longwave) sesuai dengan prosedur
9
absorbansi kultur terinduksi (menghasilkan pigmen fluoresein) dengan menggunakan spektrufluorometer. Pengukuran dilakukan pada berbagai panjang gelombang, artinya energi eksitasi berupa radiasi cahaya putih. Hasilnya berupa tampilan puncak yang menunjukkan nilai absorbansi pada panjang gelombang tertentu. Panjang gelombang absorbansi ditentukan dari proyeksi titik puncak ke sumbu horizontal. Hasil pembacaan menunjukkan ada banyak puncak antara panjang gelombang 359 dan 371 nm. Ada juga puncak di atas rentang panjang gelombang ultraviolet, yaitu 409 nm.
Energi utama dari fluoresensi berasal dari absorbansi cahaya panjang gelombang pendek. Cahaya panjang gelombang pendek mempunyai energi yang tinggi dan rentang ini masuk ultraviolet. Hal inilah yang mendasari induksi fluoresensi dengan ultraviolet. Induksi utama diyakini berada pada panjang gelombang daerah ultraviolet, yaitu 370 nm. Panjang gelombang yang direferensikan berada pada panjang gelombang 366 nm. Hal ini menjelaskan panjang gelombang 366 nm mungkin sudah menjadi standar di pasaran. Selain itu, mungkin juga sulit menemukan atau memodifikasi lapisan pendar (biasanya senyawa fosfor) yang dapat menghasilkan panjang gelombang pada panjang gelombang selain 366 nm atau sesuai spesifikasi tertentu.
Sumber cahaya UV adalah lampu tube lamp/neon empat watt dan terdapat di pasaran sebagai pendeteksi marker-fluoresen perangko. Walaupun demikian, perlu dilakukan klarifikasi terhadap dugaan panjang gelombang lampu UV yang akan dipakai pada alat karena tidak ada spesifikasi panjang gelombang yang tertera pada kemasan. Panjang gelombang lampu ini diperiksa dengan spektrofluorometer dengan hasil berupa tampilan puncak emisi pada berbagai panjang gelombang secara kontinyu. Puncak tertinggi merupakan panjang gelombang sumber cahaya. Adanya getaran harmonik menyebabkan interferensi sehingga terjadi rentang panjang gelombang yang lebar. Rentang panjang gelombang emisi lampu ini antara 364-367 nm. Nilai 366 nm masuk dalam rentang nilai tersebut sehingga sudah sesuai referensi. Panjang gelombang tersebut tidak bersifat germisidal karena masuk UV
longwave yang energinya yang kecil.
Emisi fluoresensi juga dibaca dengan spektrofluorometer, tetapi menggunakan radiasi penginduksi fluoresensi pada satu panjang gelombang. Sumber radiasi berupa laser, namun yang tersedia di laboratorium
hanya panjang gelombang 410 nm. Panjang gelombang ini masih dekat rentang ultraviolet atau masuk ultraviolet longwave sehingga masih dapat menginduksi fluoresensi. Hasilnya berupa grafik (Gambar 5) dengan sumbu vertikal menunjukkan kuat emisi cahaya (satuan counts/hitungan), sedangkan sumbu horizontal menyatakan panjang gelombang (satuan nanometer). Panjang gelombang emisi didapatkan dari proyeksi titik puncak dengan sumbu horizontal. Puncak tertinggi menunjukkan panjang gelombang emisi 508 nm.
Gambar 5 Emisi fluoresensi kultur cair bakteri P. aeruginosa.
Kontruksi Alat
Petri yang akan diproses dengan komputer, memerlukan alat untuk menangkap gambar. Alat ini adalah kotak foto-petri yang memiliki kamera dan sistem pencahayaan (Gambar 6). Alat dikontruksi dengan rangka dari aluminium. Bahan ini dipilih karena tahan karat dan ringan. Selain itu, juga karena sudah mempunyai bentuk sehingga tidak perlu diberi bentuk estetis dan tidak perlu diberikan rel penyangga sekat (kaca atau papan). Rangka ini ditutupi dengan papan melamin untuk mengisolasi kamera dari cahaya luar dan memantulkan kembali cahaya yang berasal dari dalam. Bagian pintu dan beberapa bagian ditutupi kaca hitam agar bagian dalam tampak dari luar, terutama untuk memantau penerangan ultraviolet.
10
Alat ini tersusun atas lima kompartemen, dari atas ke bawah yaitu kompartemen penyimpan barang tambahan (seperti compact disc program, kertas kalibrasi, terminal listrik dan lain-lain), penyimpan kabel, sistem elektronik, ruang foto, dan kompartemen pembaur cahaya. Kompartemen pembaur cahaya berfungsi untuk mendapatkan cahaya yang merata di belakang gambar petri.
Sistem elekteronik, terdiri atas regulator tegangan 12 volt (V), regulator intensitas cahaya, inverter DC ke AC tegangan tinggi, sistem detektor panas, baterai, dan sinyal kelap-kelip (pembuang arus). Sistem ini berdiri sendiri, tidak berhubungan dengan komponen elektronik komputer kecuali kamera. Sistem regulator tegangan mempunyai komponen utama satu Integrated Circuit (IC) LM317 dan dua kondensator. Keduanya berfungsi menstabilkan tegangan. Selain itu, LM317 mengatur daya keluaran yang dapat diatur melalui potensiometer 5 K?. Sistem ini mendapatkan daya dari transformator step down tegangan 12 V dengan arus 500 mA dan disearahkan oleh dioda D4001. Sistem inverter DC–AC tegangan tinggi merupakan penyusun utama sistem UV. Tegangan tinggi ini digunakan untuk mengeksitasikan gas argon di dalam tabung. Tegangan yang terukur di atas 1000 volt (V), melebihi batas pembacaan alat sehingga pembacaan tegangan dihentikan.
Sistem pengaman panas berisi komponen elektronik yang dibuat untuk mengantisipasi suhu tinggi pada IC regulator LM317 yang berakibat merusak. Antisipasi berupa respon pengaktifan sistem alarm berupa buzzer dan kipas yang akan mendorong udara untuk menghembus heatsink IC LM317. Kipas ini mempunyai spesifikasi tegangan listrik input sebesar 12 V dan arus input sebesar 0.11 ampere sehingga kipas ini menyerap daya sebesar 12 x 0.11 = 1.32 watt. Regulator cepat panas karena pemakaian daya berlebihan yang dialirkan ke sistem lain terutama pada inverter lampu UV.
Inverter ini berfungsi menghasilkan tegangan tinggi dalam bentuk gelombang bolak balik. Tegangan regulator yang telah diset oleh potensiometer sehingga tegangan listrik input pada inverter sebesar 8.5 V. Tegangan ini diubah oleh sistem inverter sehingga tegangan listrik lebih dari 1000 V. Daya sumber UV juga diefisiensikan dengan memberikan sakelar, sehingga lampu UV akan menyala ketika pintu kotak foto petri tertutup. Hal ini juga mengantisipasi radiasi UV secara pada pemakai alat.
Sistem lain yang dibuat adalah baterai. Sistem ini berfungsi menyediakan waktu tambahan pemakaian alat terutama menghidupkan sistem penerangan. Selain itu, juga mengantisipasi kehilangan arus tiba-tiba yang berbahaya bagi alat. Sistem ini terdiri atas penghambat arus dan pengalih panas yaitu transistor D313 yang telah dipasangi
heat sink. Baterai yang digunakan adalah NiMH 8.4 V, 125 miliampere-hours (mAH). Jenis baterai ini mempunyai efek memori level, maksudnya kapasitas penyimpanan akan berkurang jika diisi tetapi tidak langsung digunakan. Oleh karena itu, sistem ini tidak dibuat untuk menyimpan arus untuk sistem utama penerangan.
Alat ini dipasangi sensor panas dan sensor cahaya. Sensor panas menggunakan komponen elektronika yang dinamakan
Negative Temperature Coefficient (NTC), sedangkan sensor cahayanya adalah Light Dependent Resistor (LDR). Sensor NTC merupakan resistor yang koefisien resistensi dapat berubah secara berbanding panas dengan respon panas. Nilai perubahan panasnya tergantung NTC yang dipakai, pada penelitian ini NTC yang dipakai 100D-9. Resistensi awal NTC ini adalah 100 ? dan akan mengalami pengecilan bila suhu meningkat. Komponen LDR merupakan
resistor yang mengalami perubahan resistensi berbanding lurus dengan respon cahaya. Komponen ini dipasang pada unit webcam untuk menangkap cahaya lingkungan lalu memberikan respon penerangan penyangga/tambahan. Lingkungan yang kurang cahaya akan menyebabkan sistem memberikan penerangan melalui LED pijar putih dan berlaku sebaliknya bila lingkungan terang. Respon penerangan ini kurang stabil atau terlalu sensitif sehingga LED berpijar dengan intensitas yang sering berubah.
Sensor panas dihubungkan dengan sistem komparator pada IC timer sehingga dapat mengaktifkan sistem lain atau mematikannya, dalam hal ini buzzer dan kipas. Sensor panas yang menerima ransangan panas akan menurunkan resistensinya terhadap listrik sehingga tegangan pada komparator bawah (pin 2) jatuh mendekati 1/3 tegangan penuh maka sistem akan mengalirkan listrik ke
11
0.292 watt dan aktif dengan serapan daya 0.648 watt.
Gambar yang ditangkap oleh kamera web mempunyai perbesaran yang berubah-ubah atau disebut distorsi. Gambar di tengah mengalami perbesaran sekitar 19 %. Semakin ke ujung perbesaran menurun, hingga perbesaran yang terukur 0.08% pada ujung kiri dan 0.06% pada ujung kanan. Jarak dua objek yang masih dapat dipisahkan dengan baik oleh kamera minimal 0.1 cm. Ukuran objek yang masih dapat ditangkap jelas juga minimal 0.1 cm. Fokus alat distabilkan dengan pengaturan jarak lensa terhadap objek dengan pengetriman lensa kamera. Kamera distabilkan dengan pencahayaan yang cukup sehingga tidak timbul noise berupa bintik-bintik yang tidak stabil. Sumber cahaya berasal dari Light Emitting Diode (LED) berpijar dengan warna putih. Komponen Light Emitting Diode (LED) di pasaran tidak selalu putih murni, kadang ditemukan sedikit berwarna biru.
Lampu LED ini diatur oleh sistem sensor cahaya dan sistem regulator daya. Sistem sensor cahaya tidak stabil dalam mengatur daya yang diberikan kepada LED, oleh karena itu LED lain ditambahkan dan diatur oleh regulator tegangan. Regulator tegangan mampu meredam gejolak listrik yang tidak stabil dan mematikan LED dengan meredupkannya perlahan-lahan. Peredupan cahaya agar kamera tidak kehilangan cahaya secara tiba-tiba yang dapat menyebabkan kerusakkan. Sistem pencahayaan yang bergantung pada sensor cahaya juga dipasang untuk menyangga sistem pencahayaan kamera. Sistem ini menjamin agar latar tidak gelap dan sedikit perubahan cahaya yang tiba-tiba. Jika sistem ini tidak dipasang, maka akses kamera sering terputus atau disebut
hang.
Penerangan tidak menyebar secara merata, baik LED maupun UV. Hal ini karena pembauran cahaya yang kurang sempurna, walaupun sudah diberikan lapisan baur. Lapisan baur merupakan lapisan tembus cahaya dengan permukaan yang kasar, yaitu plastik laminating atau berwarna putih yaitu, sedotan. Pembauran terutama diusahakan terjadi di dalam planar baur pada kompartemen terbawah. Kompartemen ini berisi delapan LED yang dikemas dengan sedotan putih (mirip lampu tabung), pemantul cahaya samping (aluminium foil), reflektor bawah (melamin), dan ditutupi oleh kaca es yang berfungsi sebagai pembaur cahaya. Selain itu penerangan tidak merata karena
LED mempunyai intensitas penerangan yang berbeda dibandingkan LED lain dan kurangnya sumber cahaya dari berbagai arah.
Desain Program
Program dibuat dengan bahasa pemrograman Visual Basic. Kode program diklasifikasikan menjadi modul dan form
(bentuk) berdasarkan tempatnya ditulis. Modul adalah objek tempat penyimpan perintah atau fungsi program. Modul merupakan kode instan yang dapat direferensikan untuk keperluan program lain. Modul tidak tervisualisasi saat program dijalankan, berbeda dengan form merupakan bentuk visual yang biasa disebut windows
(jendela). Bentuk ini selain menyimpan fungsi juga menyimpan respon atau kejadian. Respon ini didefinisikan sebagai ransangan dari pengguna program, baik berupa penekanan tombol, gerakan penunjuk tetikus, pemilihan
list/daftar atau centang dan lain-lain yang mengaktifkan kode/perintah tertentu. Kode akan langsung dieksekusi jika ada di dalam jendela dan dipanggil terlebih dahulu jika ada di dalam modul tertentu.
Modul tersebut perlu dideklarasikan terlebih dahulu. Modul yang digunakan ada tiga, yaitu scan, selektor, dan link. Modul scan berfungsi sebagai komunikator yang dapat mengakses kamera web sehingga dapat mentransfer tangkapan gambar. Tangkapan ini diset dengan kecepatan 30 gambar/detik dengan ukuran 640 x 480 piksel. Modul selektor berfungsi mengintegralkan piksel, menghitung, dan menyaring objek berdasarkan ukurannya. Modul link berfungsi untuk “cropping” gambar, yang berguna untuk mengisolasi gambar petri dari lingkungannya serta membentuk tampilan. Jendela hanya terdiri atas satu jendela dengan tujuh tombol kontrol, tiga scrollbar, dua kotak teks, dan dua tombol pilihan (Gambar 7). Tampilan dibuat sederhana agar mudah digunakan oleh pengguna program.
12
Spesifikasi perangkat lunak/program sebagai berikut. Kebutuhan program, diantaranya sistem operasi Windows, Read
Access Memory (RAM) minimal 256
megabyte, Universal Serial Bus port
kecepatan tinggi, dan memori harddisk lebih dari 2 megabyte. Program dibuat dalam bentuk file (fail) eksekusi berekstensi (inisial fail di akhir) ”exe” berukuran 296 kilobyte.
Akses piksel pada gambar dapat dilakukan dengan beberapa cara. Akses paling cepat menggunakan pointer (penunjuk), yaitu penyimpan/penunjuk alamat piksel. Alamat piksel ini disimpan dalam bentuk variabel data berdimensi dua, yaitu kolom dan baris. Tiap kelipatan tiga kolom mewakili satu piksel karena ketiga urutan tersebut masing-masing menyatakan informasi warna biru, hijau, dan merah. Pembacaan piksel dimulai dari ujung kiri bawah.
Data piksel yang masuk rentang warna yang sesuai dengan spesifikasi koloni, disimpan dalam variabel kolom. Piksel gambar yang diambil hanya bagian petri, sedangkan bagian lain tidak dan dijadikan sebagai latar berwarna merah. Kontrol proses ini oleh submodul ”fokus” dalam modul ”cropping” Proses dilanjutkan dengan mengintegrasikan data piksel dengan fungsi ”integral” dalam modul ”selektor”. Data tiap satuan integral atau objek difragmentasi ulang hingga sesuai urutan kolom piksel. Rasio panjang-lebar rangka kotak objek (yang memuat objek) dihitung untuk menentukan orientasi bentuk kasar. Kode penentuan rasio ada dengan modul ”orien” yang terdapat pada modul ”selektor”
Ada tiga metode yang telah digunakan untuk menghitung koloni, yaitu mencari rentang warna tertentu, rekayasa warna, dan simulasi sel. Metode simulasi sel merupakan pendekatan yang menekankan pengenalan bentuk dalam mengenali bentuk. Metode ini sebagai pendekatan terhadap karakteristik sel bakteri dalam membentuk koloni berbentuk bulat di petri. Metode ini digunakan karena keberhasilannya yang mampu menjelaskan ketidakpastian koloni bila hanya ditentukan dari spesifikasi warnanya.
Program komputer mampu mengenali bentuk koloni karena ditanamkan rumus lingkaran. Rumus ini difleksibelkan lagi dengan kemampuannya yang mampu berekspansi seperti radar atau medan, mengenali tumbukkan, dan memberikan nilai bentuk lingkaran yang difungsikan dari tumbukan. Fleksibilitas ini penting karena
gambar koloni yang ditangkap oleh kamera mempunyai perbedaan ukuran jari-jari dan gradasi warna. Selain itu, fleksibilitas ini menghasilkan nilai probabilitas/kemungkinan terhadap objek tertentu dalam gambar. Probabilitas ini adalah konsep ketidak-pastian, sebuah konsep yang dipakai dalam menentukan bentuk orbital dalam membentuk konfigurasi elektron. Konsep ini menghasilkan nilai derajat kesempurnaan lingkaran pada objek melalui proses pembacaan permukaan luar (kulit) objek. Nilai kemungkinan ini diperlukan karena koloni bakteri tidak selalu berbentuk lingkaran sempurna dan dapat saling tumpang tindih.
Objek yang digunakan dengan metode simulasi sel dinamakan “rad”. Rad dinamakan demikian sebagai pertimbangan dari tiga karakteristiknya, yaitu radikal, radial, dan radar. Nama ini diambil dari kata radikal, karena sifat objek ini seperti sel kanker yang dapat tumbuh tidak terkontrol jumlahnya dan mampu berekspansi luas. Sifat ini ditanamkan karena mampu mendekati karakteristik sel bakteri yang dapat tumbuh pada substrat yang sesuai. Radial mencerminkan bentuk objek ini yang lingkaran, sedangkan radar adalah kemampuan yang dimiliki objek ini dalam memindai atau berinteraksi dengan lingkungan atau matriks objek lain dalam dunia digital.
Lingkaran yang dihasilkan dalam gambar mempunyai keterbatasan bentuk bila semakin kecil, bahkan prosesor komputer akan mengorientasikan rumus lingkaran sebagai bentuk ketupat bila jari-jari berukuran dua piksel. Substrat yang dikenal oleh rad dianalogikan sebagai warna spesifik yang didefinisikan dengan sistem red green blue
(RGB) atau 24 bit. Warna spesifik ini dalam rentang warna yang mempunyai deviasi
default/biasa (±) 15 satuan warna pada skala 0-255 RGB. Karakteristik lain yang dimiliki rad adalah warnanya yang terdiri dari dua warna analogi dari dua lapis membran sel. Karakteristik ini membuat sesama rad tidak saling menembus saat bertumbukkan.
13
gelombang radar untuk mengenali bentuk lingkungannya (objek dalam gambar). Selain itu, rad juga bersifat mobil, bahkan dapat bersatu dengan sesama rad. Penyatuan ini analogi dari “fusi” yang terjadi jika dua atau lebih koloni tumpang tindih. Fusi tidak terjadi jika tumpang tindih terjadi hanya pada sebagian kecil badan koloni, bisa dianalogikan sebagai hibridisasi. Hal ini merupakan suatu definisi yang melengkapi kemampuan prosesor untuk mencerna satu integral objek gambar sebagai beberapa koloni yang tumpang tindih. Kemampuan ini didapatkan dari pengenalan kulit terluar/permukaan bentuk/objek gambar.
Rad mempunyai inti lingkaran yang berisi informasi warna selektif koloni, selanjutnya disebut gen warna. Gen warna mempunyai nilai warna spesifik koloni yang diperoleh dari serapan saat rad tumbuh atau berpindah. Nilai ini adalah puncak warna yang merupakan nilai tengah rentang warna serapan. Rad bersifat dinamis dalam berpindah dan berekspansi karena mampu menerima deviasi warna sampai toleransi tertentu terhadap gen warna. Nilai ini terpasang default/tersetting pada toleransi 60 satuan RGB dari warna gen mutlak. Toleransi ini dapat diubah oleh pengguna program dengan menggeser
scrollbar daya ekspansi. Rad adalah objek radikal karena nilai gen warna dapat berubah. Walaupun demikian, ada batas perubahan gen yang dapat diterima sehingga rad tidak tumbuh di luar rentang warna koloni. Batas perubahan gen sama dengan nilai toleransi (60), tetapi terdeviasi yang dari nilai gen warna relatif.
Objek ini dibuat tumbuh berpindah dan berekspansi dalam dimensi matriks. Dimensi matriks adalah dimensi duplikat kanvas/kotak gambar yang bersifat semu (tidak terlihat) dan terbentuk dari memori byte (bita) yang tersusun dalam kolom dan baris. Dimensi ini tidak menyimpan warna piksel, tetapi eksitasi nilai dari nol hingga dua. Eksitasi nilai menjadi satu menyatakan piksel yang masuk rentang warna seleksi (substrat tumbuh rad). Eksitasi ini selanjutnya (menjadi bernilai dua) merupakan daerah yang telah atau gagal ditumbuhi rad setelah objek tersebut diproses. Daerah tereksitasi dua ini merupakan daerah inhibisi bagi rad yang lain untuk tumbuh, analogi dari antibiotik.
Kronologis simulasi sel ini berjalan seperti berikut. Piksel dengan rentang warna tertentu dimasukkan dalam suatu variabel sekuensial dan piksel matriks tereksitasi sesuai alamat piksel kanvas. Eksitasi ini mengubah variabel
bita matriks dari nol menjadi bernilai satu. Variabel sekuensial akan diintegrasikan sehingga membentuk satu objek utuh, lalu alamat piksel terintegrasi ini disimpan dalam variabel integrasi. Isi variabel terintegrasi adalah alamat piksel yang menginterpretasikan bentuk gambar/objek, sekaligus sebagai media tumbuh rad. Banyaknya variabel integrasi menyatakan banyaknya jumlah objek. Rasio panjang-lebar objek dihitung untuk menentukan dugaan bentuk koloni tahap satu. Jika rasio objek lebih dari 0.6 dan kurang dari 1.3 maka program akan menyatakan objek sebagai bentuk dugaan koloni tunggal tahap satu. Jika kulit terluar rad dideteksi mempunyai rasio jumlah piksel di luar toleransi dan keliling lingkaran lebih dari 0.9 maka objek gambar dinyatakan sebagai sebagai dugaan koloni tunggal tahap dua.
Kedua tahap dugaan yang terpenuhi menyebabkan rad diinisiasikan hanya pada titik tengah objek di dalam dimensi matriks. Jika salah satu tahap dugaan tidak diakui, maka objek tersebut akan ditumbuhi rad yang merambat melalui kulit terluar dengan metode spin. Walaupun demikian, tidak semua rad tersebut dapat terekspresi, hanya yang mempunyai rasio jumlah piksel di luar toleransi dan keliling lingkaran lebih dari 0.45. Bila dua rad atau lebih saling overlap
dengan jarak pusat keduanya sama atau lebih dari jari-jari rad terbesar, maka semua rad yang overlap tersebut akan terekspresi pada kanvas. Jika tidak, maka yang terekspresi hanya yang mempunyai rasio terbesar, sedangkan yang lain disimulasikan mengalami apoptosis.
Program dapat memberikan pernyataan salah terhadap objek. Objek ini dianggap koloni karena menghasilkan kemungkinan yang besar pada perhitungan komputer. Hal ini karena ada kesamaan warna atau pantulan yang sifatnya menginterferensi koloni. Interferensi koloni dapat terjadi karena refreksi sinar pada petri di ujung kiri dan kanan, distribusi cahaya yang tidak merata, dan difusi pigmen. Koloni yang dihitung pada angka lempeng ada yang telah direkayasa warnanya untuk menghasilkan bentuk yang jelas atau kontras. Gambar petri yang telah direkayasa ada pada empat urutan terakhir petri angka lempeng total (ALT). Rekayasa warna tersebut dilakukan oleh sistem di dalam kamera bukan oleh program penghitung koloni.
14
gambar hingga mengenalinya sebagai koloni. Parameter tersebut ada yang sudah terpasang/set secara permanen dan ada yang bisa diedit oleh pengguna program. Parameter yang sudah terpasang secara permanen adalah deviasi warna (diset 15 satuan RGB) untuk integrasi warna, distribusi probabilitas (diset nol), kesalahan-resolusi lingkaran /eksit (nilai difungsikan sistem), rasio piksel asing dan piksel kulit lingkaran rad (diset 0.9 untuk koloni tunggal dan 0.45 untuk koloni tumpang tindih), inhibitor nilai terang (diset tidak bekerja), dan banyaknya medan yang dilepaskan saat rad bertumbukkan (diset tiga). Parameter yang dapat diedit adalah nilai toleransi/deviasi warna yang dapat diterima rad dalam berekspansi, rentang warna koloni, dan jari-jari rad yang tidak mengalami apoptosis.
Bentuk gambar dan warna dalam rentang tertentu akan dikenali komputer sebagai sebuah kemungkinan bahwa objek tersebut adalah koloni. Kemungkinan ini didapatkan dari beberapa parameter. Penentuan suatu bentukkan sel dapat juga diperjelas dengan rekayasa warna dari gambar aslinya. Rekayasa ini dapat dilakukan dengan setting alat atau program penghitung koloni. Rekayasa dengan program, diantaranya terang dan kontras. Rekayasa dibuat dengan membuat daftar warna dari variabel array dengan satu dimensi berukuran 0-255. Nilai elemen difungsikan dari nilai urutan elemen. Nilai terang diperoleh dengan meningkatkan ketiga nilai warna primer melalui pengalian. Nilai kontras diperoleh dengan memperbesar simpangan ketiga warna dari nilai tengah rentang warna, yaitu 127 ˜ 255 / 2.
Metode seleksi koloni difungsikan dari rentang warna tertentu, yaitu metode tunjuk warna (rentang warna terbatas pada koloni yang ditunjuk), warna terpasang (warna cuplikan telah disampling sebelumnya), dan metode sampling (mengambil warna cuplikan langsung). Metode unjuk warna dilakukan dengan mengarahkan ujung penunjuk mouse
ke salah satu koloni, maka daerah yang masuk dalam rentang warna yang terdeviasi 15 satuan dari warna yang ditunjuk akan menjadi substrat bagi pertumbuhan rad. Metode warna terpasang menggunakan rentang warna global, yaitu warna yang mewakili keseluruhan koloni dan sudah terpasang konstan/tetap yaitu pada rentang warna merah 80-200, hijau 170-245, dan biru 140-220. Warna tetap ini telah diperoleh dari proses pengambilan cuplikan warna dari lima koloni. Proses selanjutnya akan sama dengan metode tunjuk
warna, bedanya hanya rentang warna yang lebih luas/mewakili metode ini. Demikian pula dengan metode sampling (mengambil cuplikan) warna, tetapi penentuan rentang warna diawali dengan mengambil cuplikan warna menggunakan fungsi dari sel simulasi (rad) yang telah dimodifikasi. Modifikasi ini untuk mengambil rentang warna area yang telah ditumbuhi rad.
Ketelitian dan ketepatan program diuji terhadap koloni model dan nyata (bakteri di petri). Model koloni berbentuk lingkaran dengan satu warna tertentu, berbagai ukuran, ditempatkan tidak beraturan, dan ada yang dibuat overlap (menimpa lingkaran lain) dengan jarak yang sesuai sehingga masih dikenali terpisah. Algoritma program diperbaiki hingga menghasilkan kecepatan, ketelitian, dan ketepatan yang tinggi. Ketelitian yang dihasilkan 100%. Ketepatan yang dihasilkan tinggi, terutama pada model yang ada sedikit overlap, bahkan 100% pada model yang tidak ada overlap. Setelah didapatkan hitungan yang memuaskan, selanjutnya program digunakan terhadap koloni sebenarnya/bakteri.
Hitungan program dapat kurang dari hitungan manual (dianggap sebagai hitungan sebenarnya). Hitungan ini masih dapat dikoreksi secara semimanual. Koreksi ini dilakukan dengan menunjuk koloni yang belum ditumbuhi rad (lingkaran dengan batas hitam dan berisi warna putih), hingga muncul rad baru dan penambahan nominal kuantifikasi bertambah. Koreksi kuantifikasi secara matematis atau dengan statistik belum dilakukan karena belum ditemukan model rumusan koreksi yang sesuai. Walaupun demikian, pengamatan hasil hitungan dengan metode tunjuk warna mendekati setengah dari hitungan manual.
Pengamatan tersebut menunjukkan adanya hubungan keduanya yang dapat menjadi dasar dalam merumuskan koreksi. Hal ini juga dipertegas dengan membuat regresi hubungan hitungan manual dan alat. Persamaan regresi yang dihasilkan y = 0.522.x -2.094, dengan R2 sebesar 0.942. Hal ini menunjukkan adanya hubungan linear. Faktor pemetaan hitungan alat (x) terhadap hitungan manual dalam bentuk perkalian sebesar 0.522. Nilai setengah ini sesuai dengan dugaan pengamatan. Hubungan ini belum diteliti lanjut dengan statistik sehingga belum bisa dijadikan sebagai model koreksi.
15
bisa negatif, namun dalam rerata tidak dimasukkan karena dianggap tidak sahih. Nilai negatif ini timbul karena nilai simpangan antara hitungan alat dan nilai sebenarnya (hitungan manual) melebihi nilai mutlak kebenaran. Ketepatan yang kecil sudah diprediksikan sebelumnya dari penerangan cahaya tidak sempurna. Hal ini berupa penerangan yang tidak merata dan pemantulan cahaya putih oleh kaca petri yang berisi koloni yang juga berwarna putih. Selain itu, juga karena kurangnya zoom<
