Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah media Pseudomonas Agar Base Pyocyanin (PABP), King’s B agar dan cair, setrimida 0.03 %, nalidiksat 1.5 %, HNO3
pekat, gliserol, NaCl 0.9 %, alkohol 70%, dan akuades steril. Bahan yang dibutuhkan untuk kontruksi alat adalah lampu ultraviolet 366 nm portabel 4 watt, Light Emitting Diode
(LED) putih, kamera digital atau webcam (resolusi minimal 1.3 megapiksel), kaca hitam 5 mm, kaca es 3 mm, aluminium (holo got, holo kotak, daun rolling door, lis, dll), karet penyangga kaca, kabel, baterai Ni-MH 8.4 V,
Integrated Circuit LM317, transformator step down 500 mA, potensiometer 5 K , trimpot 50 K , dioda IN4002, kapasitor, resistor,
heatsink (lempeng aluminium penurun panas), rangkaian inverter DC-AC tegangan tinggi,
dan Printed Circuit Board (PCB), sakelar tekan on-off, microswitch, skrup, paku rivet 3 mm, timah, danlem plastik-panas.
Alat-alat yang digunakan, diantaranya neraca analitik, pipet mikro, jarum ose, penyedot air untuk kertas milipore, petri, kit uji biokimia, vortex, spektrofotometer, spektrofluorometer, laminar air flow cabinet, inkubator, autoklaf, dan lemari pendingin. Alat-alat yang digunakan dalam kontruksi alat adalah komputer, multitester, solder, penyedot timah, bor listrik (mata bor 3 mm dan 1 mm), pistol rivet, cutter, pinset, gergaji, gunting kawat, obeng, dan tang.
Metode Penelitian Isolasi Bakteri dan Induksi Pigmen
Air minum dalam kemasan disaring dengan kertas milipore 0.45 µm dan menggunakan alat penyedot/vakum air. Kertas
milipore ditaruh pada permukaan media
Pseudomonas Agar Base Pyocyanin (dalam petri) lalu dituangkan suplemen Cetrimide
-Nalidixic (CN). Setelah itu, petri diinkubasi 35 oC selama 24 jam atau lebih hingga hari ke tujuh. Koloni yang tumbuh diamati warnanya tanpa UV dan dengan UV 366 nm (longwave). Koloni positif P. aeruginosa
5
menjadi hampir UV (panjang gelombang: 380–200 nm) dan UV vakum (200–10 nm). Ketika mempertimbangkan pengaruh radiasi UV terhadap kesehatan manusia dan lingkungan, jarak panjang gelombang sering dibagi lagi kepada UV A (400–315 nm) yang juga disebut long wave; UV B (315–280 nm) yang juga disebut "Gelombang Medium" (Medium Wave), dan UV C (280-200 nm) juga disebut short wave (Webb 2000).
Materi yang menyerap warna lebih dari cukup menyebabkan disosiasi molekul. Energi yang cukup atau panjang gelombang cahaya yang diserap sesuai, menyebabkan terjadi transisi elektron dari satu orbital ke orbital energi yang lebih tinggi, atau dinamakan eksitasi. Elektron yang tereksitasi akan kembali ke orbital dasar melalui empat mekanisme, yaitu konversi internal, fluoresensi, sistem silang fosforesensi atau konversi internal, dan interaksi dengan molekul lain. Emisi fluoresensi mempunyai panjang gelombang yang lebih panjang dari absorbsi (Lowry dan Richardson 1987).
Aplikasi utama UV adalah sterilisasi karena sifat utama yang destruktif terhadap materi biologis. Sifat ini diperoleh dari energinya yang tinggi sesuai dengan panjang gelombangnya yang pendek. Panjang gelombang yang biasa digunakan bersifat
germicidal (untuk sterilisasi) berada pada rentang 280 dan 100, yang sering digunakan adalah 254 nm. Aplikasi lainnya untuk lampu fluorensen/neon, sistem keamanan, astronomi, spektrofotometri, marker kimia, fotokemoterapi, deteksi api, dan lain-lain.
Ultraviolet umumnya dihasilkan dari eksitasi atom raksa. Prinsip ini umum untuk semua lampu neon atau tube lamp alias lampu fluoresen. Tabung lampu berisi uap raksa dan gas inert (tidak reaktif) argon pada tekanan yang rendah, ada pula yang ditambahkan kripton. Ujung lampu dihubungkan oleh dua elektroda. Elektroda yang disebut katoda ini akan mengeksitasikan atom raksa jika diberi tegangan tinggi melalui mekanisme plasma argon. Reaksi dari eksitasi ini menghasilkan energi radiasi gelombang elektromagnetik dalam kisaran ultraviolet.
Sumber UV yang umum digunakan untuk mikrobiologi mempunyai gelombang panjang 254 untuk sterilisasi/germisidal dan 366 nm untuk induksi fluoresensi. Lampu ini bisa berupa lampu neon atau Light Emitting Diode
(LED). Lampu neon, permukaan kacanya dilapisi fosfor europium yang didoping stronsium fluoroborat (SrB4O7F:Eu2+) sehingga dapat melepaskan radiasi pada
panjang gelombang 368-371. Lampu UV yang digunakan 6 watt sudah cukup dan aman, bila lebih dari itu misalnya 15 watt diperlukan kaca pelindung.
BAHAN DAN METODE
Bahan dan AlatBahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah media Pseudomonas Agar Base Pyocyanin (PABP), King’s B agar dan cair, setrimida 0.03 %, nalidiksat 1.5 %, HNO3
pekat, gliserol, NaCl 0.9 %, alkohol 70%, dan akuades steril. Bahan yang dibutuhkan untuk kontruksi alat adalah lampu ultraviolet 366 nm portabel 4 watt, Light Emitting Diode
(LED) putih, kamera digital atau webcam (resolusi minimal 1.3 megapiksel), kaca hitam 5 mm, kaca es 3 mm, aluminium (holo got, holo kotak, daun rolling door, lis, dll), karet penyangga kaca, kabel, baterai Ni-MH 8.4 V,
Integrated Circuit LM317, transformator step down 500 mA, potensiometer 5 K , trimpot 50 K , dioda IN4002, kapasitor, resistor,
heatsink (lempeng aluminium penurun panas), rangkaian inverter DC-AC tegangan tinggi,
dan Printed Circuit Board (PCB), sakelar tekan on-off, microswitch, skrup, paku rivet 3 mm, timah, danlem plastik-panas.
Alat-alat yang digunakan, diantaranya neraca analitik, pipet mikro, jarum ose, penyedot air untuk kertas milipore, petri, kit uji biokimia, vortex, spektrofotometer, spektrofluorometer, laminar air flow cabinet, inkubator, autoklaf, dan lemari pendingin. Alat-alat yang digunakan dalam kontruksi alat adalah komputer, multitester, solder, penyedot timah, bor listrik (mata bor 3 mm dan 1 mm), pistol rivet, cutter, pinset, gergaji, gunting kawat, obeng, dan tang.
Metode Penelitian Isolasi Bakteri dan Induksi Pigmen
Air minum dalam kemasan disaring dengan kertas milipore 0.45 µm dan menggunakan alat penyedot/vakum air. Kertas
milipore ditaruh pada permukaan media
Pseudomonas Agar Base Pyocyanin (dalam petri) lalu dituangkan suplemen Cetrimide
-Nalidixic (CN). Setelah itu, petri diinkubasi 35 oC selama 24 jam atau lebih hingga hari ke tujuh. Koloni yang tumbuh diamati warnanya tanpa UV dan dengan UV 366 nm (longwave). Koloni positif P. aeruginosa
6
kehijauan. Induksi dengan UV menyebabkan fluoresensi hijau pada koloni.
Koloni positif tersebut disubkultur/diremajakan ke agar King’s B, diinkubasi 35 oC selama 48 jam. Koloni yang tumbuh, kemudian diuji biokimia dengan menggunakan kit biokimia. Koloni digores dengan jarum ose, lalu dicelupkan ke dalam 10 ml NaCl 0.9 % , larutan dikocok, kemudian diulangi hingga larutan menjadi keruh (suspensi). Sebanyak 100 µl suspensi bakteri diinjekkan ke masing-masing sumur kit, lalu diinkubasi 37 oC selama 24 jam.
Sebanyak 5 ml kultur cair bakteri P. aeriginosa ditempatkan di kuvet, lalu dianalisis panjang gelombang absorbansi dan emisinya dengan menggunakan spektrofluorometer. Absorbansinya diukur dengan memberikan radiasi cahaya putih, sedangkan emisi dengan menempatkan radiasi laser 410 nm berhadapan dengan detektor.
Setting jenis pengukuran dilakukan dengan perangkat lunak pada komputer, hasilnya berupa grafik dengan puncak panjang gelombang. Panjang gelombang emisi lampu ultraviolet juga diukur spektrofluorometer dengan menempatkan detektor berhadapan dengan lampu.
Kultur yang telah diidentifikasi diinduksi pada berbagai induser dugaan. Sebanyak 5 ml larutan disiapkan, larutan tersebut adalah King’s B, King’s B mengandung setrimida 0.03 %, King’s B mengandung nalidiksat 1.5 %, King’s B + 1 tetes HNO3, King’s B + 0.5 ml gliserol, King’s B + selulosa, dan lain-lain. Semua larutan diberi 1 inokulan bakteri, lalu diinkubasi 35 oC 24 jam. Konsentrasi daya induksi atau daya hambat ditentukan pada induser dugaan atau inhibitor yang teramati mempengaruhi produksi pigmen.
Kontruksi Alat dan Desain Program Kontruksi Alat. Sketsa alat dibuat pada kertas. Sketsa ini dimasukkan dalam komputer untuk dikontruksi ulang. Alat dikontruksi awal/prototipe dengan kardus, kemudian dikontruksi menggunakan rangka aluminium dan sekat dari papan melamin dan kaca. Komponen elektronik disketsa di atas kertas, kemudian dirakit pada Printed Circuit Board
(PCB) dan disolder menggunakan timah. Komponen tersebut adalah regulator tegangan 12 volt, regulator intensitas cahaya, inverter DC ke AC tegangan tinggi, sistem detektor panas, baterai, dan sinyal kelap-kelip (pembuang arus). Fungsi rangkaian tersebut diuji dan diperbaiki hingga berfungsi. Selanjutnya semua rangkaian elektronik
termasuk kamera diintegrasikan dalam kompartemen elektronik. Komponen tersebut diset sedemikian rupa hingga didapatkan tegangan, penerangan, dan tangkapan kamera yang sesuai.
Desain Program. Program dibuat dengan
Visual Basic 6 dan menggunakan program rutin Application Programming Inferface
(API) milik Windows. Tampilan program dibuat, lalu diberikan fungsi (kalkulasi dan perintah) dan pemicu kontrol. Fungsi dipecah dalam bentuk modul, lalu program modul dijalankan dan diujikan pada model koloni (gambar lingkaran). Kode diperbaiki dan diefektifkan, kemudian program dijalankan dan diujikan pada koloni sebenarnya. Tangkapan gambar petri dikalibrasi, setelah itu koloni pada berbagai petri dihitung dan ditentukan ketelitian dan ketepatannya.
Kalibrasi
Kalibrasi Alat. Gambar (input) bulatan kecil pada berbagai ukuran dan jarak, penggaris, dan lingkaran dibuat dan dicetak dengan printer. Sistem penerangan dihidupkan, kemudian gambar ditangkap oleh kamera dan disimpan dalam harddisk. Simpanan (output) dibandingkan dengan gambar inputnya, dalam hal keterpisahan, skala, dan distorsi.
Kalibrasi Program. Sebanyak 20 petri berisi koloni bakteri untuk pemeriksaan angka lempeng total dihitung secara manual dan dengan program penghitung koloni. Pembacaan oleh alat dilakukan dengan menaruh petri pada posisi tengah tangkapan kamera dengan posisi terbalik kemudian sistem penerangan yang terdiri atas lampu (LED) putih bawah dan atas diaktifkan. Setelah itu, gambar petri ditangkap oleh kamera, dihitung dengan program pada setting
yang sesuai. Bakteri P. aeruginosa
teridentifikasi disebar pada 6 petri berisi agar King’s B yang kemudian diinkubasi 35 oC selama 48 jam. Kultur Pseudomonas aeruginosa disebar masing-masing. Warna koloni diambil 5 kali dari salah satu petri dengan menggunakan pointer mouse
(penunjuk tetikus). Rentang warna baik merah, hijau, dan biru (jangkauan 0-255 satuan Red Green Blue (RGB)) dicatat oleh
software dan disimpan sebagai setting untuk seleksi koloni berdasarkan warna. Koloni dari tiap petri dihitung secara manual dan menggunakan program penghitung koloni. Penangkapan gambar dilakukan dengan menaruh petri pada posisi tengah tangkapan kamera dengan posisi terbalik kemudian
7
sistem penerangan UV dan lampu (LED) putih bawah diaktifkan.