STUDI KANDUNGAN DAN IDENTIFIKASI FUKOSANTIN DARI TIGA
JENIS RUMPUT LAUT COKELAT (S
argassum cinereum, Sargassum
echinocarpum dan Sargassum filipendula) DARI PADIKE TALONGO
SUMENEP MADURA
Kartini Zailanie*) dan Hari Purnomo
*) Faculty of Fisheries and Marine Science, Brawijaya University, Malang, East Java-Indonesia 65145
ABSTRACT
The purpose of this research is to determine the fucoxanthin content of (Sargassum cinereum, Sargassum echinocarpum and Sargassum fi lipendula) by the use of High Performance Liquid Chromatography (HPLC) methods based on the peak area of fucoxanthin and spectroscopic method based on Seely et al. (1992). The content of fucoxanthin was analyzed using UV 1700, UV-Visible spectrophotometer (Shimadzu, Kyoto) and then calculated by Seely et al. equation in mg/g dry weight ± SE unit. HPLC analysis was carried out with a model LC-20AD (Shimadzu, Kyoto) equipped with a column temperature controller and a SPD-M20A photodiode array detector, using a 250 mm × 4.6 mm i.d Shim-pack VP-ODS, C 18 protected with its guard column. Analysis of pigments was performed according to modifi ed Hegazi et al. (1998) method. Peak area of fucoxanthin on HPLC chromatogram was detected at 450 nm. polycystum. While the order of fucoxanthin content using HPLC method, identifi cation using FTIR and weigh mol using LC-MS Key words: brown seaweeds, fucoxanthin content, HPLC,FTIR. and LCMS, spectroscopic
PENGANTAR
Perairan Sumenep di wilayah timur Pulau Madura memiliki sejumlah spesies rumput laut cokelat yang belum dibudidayakan dan dikembangkan secara optimal. Rumput laut cokelat yang telah teridentifi kasi adalah genus Sargassum (Sargassum cinereum Sargassum fi lipendula, Sargassum echinocarpum),
Fukosantin merupakan karotenoid utama yang terdapat dalam rumput laut cokelat (Haugan et al., 1995) dan diperkirakan lebih dari 10% dari total produksi karotenoid alami (Matsuno, 2001). Fukosantin memiliki ikatan alenik yang khas dan 5,6-monoepoksida dalam molekulnya berperan terhadap kekhasan struktur fukosantin. Fukosantin memiliki berbagai macam pengaruh yang menguntungkan dalam kesehatan manusia, antara lain yaitu: anti karsinogenik (Kim et al., 1998), mekanisme kematian sel pada sel kanker (Okuzumi et al., 1990), anti peradangan (Shiratori et al., 2005), antioksidan (Nomura et al., 1997), antiobesitas (Maeda et al., 2005) dan sebagainya.
Prosedur yang sederhana dan cepat dalam proses ekstraksi kuantitatif pigmen fotosintetik dari rumput laut cokelat telah dikembangkan oleh Seely et al. (1992). Hegazi et al. (1998) telah berhasil mengembangkan prosedur pemisahan pigmen, menggunakan KCKT fase terbalik dan pendeteksian diode array, yang sesuai untuk analisis dan identifikasi bermacam-macam pigmen fotosintetik yang ada dalam rumput laut. Berdasarkan latar belakang di atas, maka tujuan penelitian ini adalah untuk menentukan
kandungan fukosantin dari Sargassum cinereum Sargassum ecinocarpum, Sargassum fi lipendula, menggunakan metode KCKT berdasarkan luas puncak fukosantin dan secara spektroskopi berdasarkan metode Seely et al. (1992).
BAHAN DAN CARA KERJA
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah 3 jenis rumput laut cokelat, yaitu: Sargassum cinereum, Sargassum echnocarpum Sargassum fi lipendula yang diperoleh dari Desa Padike Ponjuk, Pulau Talango, Sumenep, Madura.
Preparasi Sampel
Sampel dicuci dengan air laut untuk menghilangkan kotoran, selanjutnya sampel ditiriskan dengan menggunakan kain dan dimasukkan ke dalam kantong polyback hitam. Selama perjalanan, sampel disimpan dalam cool box yang berisi es. Sampel disimpan dalam freezer sebelum perlakuan selanjutnya.
Kandungan Fukosantin Metode KCKT
Sampel rumput laut cokelat dipotong kecil-kecil,
kemudian ditambahkan CaCO3 sebagai agen penetral dan
ditumbuk sampai halus menggunakan mortal. Sampel diekstraksi menggunakan pelarut aseton selama 20 menit, kemudian fi ltrat yang diperoleh dipekatkan menggunakan rotary evaporator dan dikeringkan dengan gas argon (UHP).
Ekstrak kasar pigmen rumput laut cokelat dianalisa menggunakan KCKT LC-20AD (Shimadzu, Kyoto) yang dilengkapi dengan oven untuk mengatur suhu kolom dan photodiode array detektor SPD-M20A, menggunakan kolom Shim-pack VP-ODS C-18 yang dilindungi dengan guard column. Analisa pigmen dilakukan berdasarkan metode Hegazi et al. (1998) yang telah dimodifikasi. Pigmen dielusi dengan kecepatan alir 1 mL/min pada suhu 30 ˚C dengan sistem elusi gradien dari campuran metanol, aseton dan larutan amonium asetat (1 M). Ekstrak kasar pigmen kering dilarutkan dalam aseton dan difi ltrasi menggunakan membran fi lter (0,2 μm, Nilon), kemudian sebanyak 20 μL ekstrak pigmen diinjekkan ke KCKT.
Spektroskopi
Sampel rumput laut cokelat dipotong kecil-kecil,
kemudian ditambah CaCO3 sebagai agen penetral dan
ditumbuk sampai halus menggunakan mortal. Sampel diekstraksi berdasarkan metode Seely et al. (1992). Ekstrak
kasar pigmen kering untuk fraksi X1 dilarutkan dalam
campuran pelarut DMSO dan air (4:1, v/v), sedangkan
fraksi X2B dilarutkan dalam campuran pelarut aseton,
metanol dan air (3:1:1, v/v). Absorbansi pada 480, 582, 631
dan 665 nm untuk fraksi X1 dan pada 470, 581, 631 dan 664
nm untuk fraksi X2B diukur menggunakan spektrofotometer
UV-Tampak, UV-1700 PharmaSpec (Shimadzu, Kyoto).
Kandungan fukosantin (g/L) untuk fraksi X1 dan fraksi X2B
dihitung berdasarkan persamaan berikut ini:
X1 = (A480 – 0.722 (A631 + A582 – 0.297 A665) – 0.049
A665)/130
X2B = (A470 – 1,239 (A631 + A581 – 0.300 A664) – 0.0275
A664)/141
Kandungan total fukosantin dihitung dengan
menjumlahkan kandungan fukosantin dari fraksi X1 dan
fraksi X2B.
Analisa Data
Data kandungan fukosantin dengan metode spektroskopi dianalisa menggunakan statistika sedehana dengan 3 kali pengulangan dan selang kepercayaan 95% untuk mengitung SE. Luas puncak fukosantin pada kromatogram KCKT dideteksi pada panjang gelombang 450 nm.
HASIL
Identifikasi Fukosantin dengan KCKT
Hasil identifi kasi fukosantin dengan menggunakan kromatogram KCKT seperti pada gambar 1. Sedangkan
pada gambar 2 terlihat pola spektrum isomer isomer fukosantin dengan waktu tambat 10,06 menit.
λ = 450 nm Fukosantin Standar
10,06
Waktu tambat / min
17,23 A 0 50 100 150 200 250
Ekstrak pigmen (S. filipendula)
10,08 In te n sit as / m A U B 0 50 100 150 200 250 Fukosantin standar +
Ekstrak pigmen (S. filipendula)
10,06 C 0 20 40 60 80 0 50 100 150 200 250
Gambar 1. Kromatogram KCKT fukosantin standar (A), ekstrak pigmen kasar Sargasum filipendula (B) dan Ko-Kromatografi antara fukosantin standar dan ekstrak pigmen kasar (C) yang dideteksi pada panjang gelombang 450 nm.
Panjang gelombang / nm In te n sit as / m A U TR = 10.06 min 451 400 500 600 0 25 50 75
Gambar 2. Pola spektrum isomer trans fukosantin pada waktu tambat 10,06 menit.
Hasil Identifikasi Pigmen Fukosantin Dengan Spektrofotometri FTIR
Gambar 3 menunjukkan fukosantin dengan Gamma photometric FTIR. Berikut ini pada tabel 1 adalah hasil ekstrak fukosantin dari Fucus serratus dan Sargassum fi lipendula.
Tabel 1. Hasil ekstrak fukosantin dari Fucus serratus dan Sargassum filipendula
No. Gugus Fungsi Vmax (cm–1) (A) Vmax (cm–1) (B) 1. OH 3483 3462 2. CH 3030-2856 2923, 2853 3. Allene 1930 1930 4. C=O, ester 1732 1742 5. C=C terkonjugasi 1654 1650 6. CH2 1607, 1576, 1530, 1471, 1456 1527, 1459 7. C-O, asetat 1335, 1261, 1245 – 8. C-O-C 1032 1031 9. C=C,Trans disubstitusi 1201, 1175, 1157, 1071, 1053, 958 959 Keterangan:
(A) = V max (cm–1) ekstrak Fukosantin (Fucus serratus) menurut Haugan et al., (1992).
(B) = Vmax (cm–1) ekstrak Fukosatin (Sargassum filipendula) berdasarkan uji FTIR yang dilakukan di laboratorium Kimia Farmasi Universitas Airlangga Surabaya.
Sedangkan berat molekul fukosantin dengan LC-MC seperti pada Gambar 4.
399.2 699.4 999.6 1299.8 1600.0 Mass (m/z) 0 255.3 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % Intensity
Mariner Spec /150:154 (T /7.51:7.71) -105:131 (T -7.51:7.71) ASC=>NR(2.00)[BP = 658.8, 255]
658.77 640.80 660.72 642.79 582.87 1338.50 291.30 681.23 1010.01 163.47 419.71
Gambar 4. Berat molekul Fukosantin dengan LC- MS: Mariner Biospectrometry O C HO O O OH O H H H H H H H H H H O C HO O O OH O H H H H H H H H H H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 19 10 11 12 13 20 14 15 15' 14' 13' 12' 11' 10' 9' 8'1 7' 6' 1' 17' 16' 2' 3' 4' 5' 18' 16 17 20' 19' 18 1.62;1.37 3.95 1.80;1.55 1.26 6.20 2.44 2.44 2.21 2.43 1.64;1.39 3.17 4.81 1.80;1.55 1.29 0.99 0.99 3.16;2.91 2.0 1.18 1.18 2.21 7.01 6.01 6.23 6.22 6.51 6.51 6.51 6.51 6.51 6.51 O C HO O O OH O H H H H H H H H H H
Gambar 5. Prediksi Nilai geseran kimia Senyawa 1 Chemical Formula C42H58O6
Exact Mass: 658.42 Molecular Weight 658.91
m/z: 658.42 (100.0%)
Tabel 2. Nilai Geseran Kimia Senyawa 1 dan Fucoxanthine (CDCl3. 500 MHz) No 1H-NMR (?, m, Hz)Fucoxanthin 1H-NMR (?, m, Hz)Senyawa 1 2 1,36 (1H, dd, J = 8,7; 14,2) 1,49 (1H, dd, J = 14,2) 3 3,80 (1H, m) 3,85 (1H, m) 4 1,77 (1H, dd, J = 8,7; 14,2) 2,29 (1H, dd, J = 2,9; 17,8) 1,67 (1H, dd, J = 9,5; 14,5) 2,21 (1H, m) 7 2,59, 3,64 (2H, d, J = 20,4) 10 7,14 (1H, d, J = 12,8) 7,36 (1H, d, J = 11,5) 11 6,58 (1H, m) 6,76 (1H, t, J = 11,5) 12 6,66 (1H, t, J = 12,8) 6,74 (1H, d, J = 11,5) 14 6,40 (1H, d, J = 11,6) 6,38 (1H, d, J = 11,5) 15 6,67 (1H, m) 6,86 (1H, t, 11,5) 16 1,37 (3H, s) 1,37 (3H, s) 17 0,95 (3H, s) 0,95 (3H, s) 18 1,34 (3H, s) 1,34 (3H, s) 19 1,80 (3H, s) 1,86 (3H, s) 20 1,98 (3H, s) 2,0 (3H, s)
No 1H-NMR (?, m, Hz) Fucoxanthin 1H-NMR (?, m, Hz) Senyawa 1 2' 1,41 (1H, dd, J = 10,4; 14,9) 2,00 (1H, dd, J = 2,9; 14.9) 1,37 (1H, m) 2,17 (1H, m) 3' 5,37 (1H, tt, J = 8,8; 12,0) 5,39 (1H, tt, J = 8,0; 11,6) 4' 1,53 (1H, dd, J = 10,4, 14,9) 2,29 (1H, dd, J = 2,9, 17,8) 1,45 (1H, m) 2,20 (1H, m) 8' 6,04 (1H, s) 6,07 (1H, s) 10' 6,12 (1H, d, J = 11,6) 6,18 (1H, d, J = 11,5) 11' 6,71 (1H, t, J = 12,0) 6,69 (1H, t, J = 11,5) 12' 6,34 (1H, d, J = 11,6) 6,50 (1H, d, J = 11,5) 14' 6,26 (1H, d, J = 11,6) 6,34 (1H, d, J = 11,5) 15' 6,71 (1H, t, J = 12,0; 14,2) 6,82 (1H, dd, J = 11,5, 15,3) 16' 1,37 (3H, s) 1,07 (3H, s) 17' 1.06 (3H, s) 0,92 (3H, s) 18' 1,34 (3H, s) 0,99 (3H, s) 19' 1,80 (3H, s) 1,34 (3H, s) 20' 1,98 (3H, s) 1,98 (3H, s) 3'-OAc, -CH3 2,03 (3H, s) 2,03 (3H, s) 3'-OAc, -C=O
Hasil rata-rata kandungan fukosantin terdapat dalam tabel 2.
Tabel 3. Kandungan fukosantin (mg/g sampel basah ± SE) 3 jenis rumput laut cokelat
Ulangan
Kandungan Fukosantin (mg/g sampel basah)
S. filipendula S. cinereum S. echinocarpum
1 0,1844 0,1548 0,1514 2 0,1870 0,1731 0,1537 3 0,2157 0,1668 0,1682 Rata-rata 0,1957 0,1649 0,1578 SE 0,0432 0,0231 0,0226 PEMBAHASAN
Identifikasi Fukosantin dengan KCKT
Identifi kasi fukosantin dalam ekstrak pigmen kasar rumput laut cokelat dapat dilakukan dengan cara ko-kromatografi antara fukosantin standar dan ekstrak kasar pigmen pada analisa menggunakan KCKT. Kromatogram KCKT fukosantin standar, ekstrak kasar pigmen dari Sargasum fi lipendula dan ko-kromatografi antara fukosantin standar dan ekstrak kasar pigmen yang dideteksi pada
panjang gelombang 450 nm dapat dilihat pada Gambar 1. Kromatogram KCKT fukosantin standar terdapat 2 puncak pada waktu tambat 10,06 dan 17,23 menit yang memiliki intensitas atau luas yang berbeda. Serapan maksimum puncak ke-1 pada 451 nm (Gambar 2) sedangkan puncak ke-2 yaitu pada 443 nm. Hal ini sesuai dengan penelitian Hegazi et al., (1998) yaitu puncak ke-2 pada 443 nm fukosantin memiliki serapan maksimum pada 452 nm dalam pelarut KCKT. Kemudian menurut Weedon & Moss (1995) menyatakan bahwa karotenoid alami sebagian besar terdapat secara dominan dalam bentuk isomer trans.
Ko-kromatografi dilakukan untuk mengidentifi kasi puncak fukosantin pada kromatogram KCKT ekstrak kasar pigmen rumput laut cokelat. Puncak pada waktu tambat 10,06 dan 17,23 menit, kromatogram KCKT hasil ko-kromatografi antara fukosantin standar dan ekstrak kasar pigmen, menunjukkan kesamaan waktu tambat, pola spektra dan serapan maksimum setiap puncaknya pada kromatogram fukosantin standar. Peningkatan intensitas yang nyata pada kedua puncak tersebut juga diamati setelah ekstrak kasar pigmen ditambah dengan fukosantin standar. Berdasarkan hasil ko-kromatografi pada kromatogram KCKT maka 2 puncak pada waktu tambat 10,06 dan 17,23 menit pada ekstrak kasar pigmen Sargassum fi lipendula adalah isomer trans fukosantin dan campuran antara isomer cis fukosantin, secara berturut-turut. Kedua puncak ini akan digunakan untuk menentukan kandungan fukosantin berdasarkan luas puncak fukosantin pada ekstrak kasar pigmen rumput laut cokelat.
Berdasarkan hasil pengukuran kromatografi cair – spektrum massa (LC-MS) guna menentukan berat molekul (BM), menunjukkan bahwa senyawa ini masih merupakan campuran 2 senyawa, namun kompenen utamanya (78%) mempunyai BM 658,77. Berdasarkan studi pustaka diketahui bahwa pada algae, brown algae, freshwater algae, and diatoms, sebagai contoh Fucus virsoides, Polysiphonia nigrescens, Copomenia peregrina, Phaeodactylum tricornutum, Ceramium rubrum dan seaweed Hijikia fusiformis diketahui mengandung fukosantin yang mempunyai BM 658,917. Berdasarkan hal tersebut senyawa 1 adalah fukosantin dan dikenal juga dengan nama fukosantol.
Untuk konfirmasi struktur molekul senyawa 1
maka dilakukan pengukuran spektrum 1H-NMR, yang
memberikan signal yang spesifi k baik nilai geseran kimia maupun bentuk signalnya. Berdasarkan hasil pengukuran
1H-NMR dalam pelarut CDCl
3 (500 MHz) menunjukkan
adanya 10 metil dalam bentuk singlet (s) seperti pada Tabel
1, adanya gugus asetil (CH3 2,05 (s),–CO–) yang muncul
pada 6,07 (s, H-8'), serta 10?1 proton metin (=C–H) dalam
bentuk singlet pada proton (H) dari suatu ikatan rangkap (H–C=). Disamping itu adanya nilai geseran 3,65 kimia yang cukup downfi eld dari suatu metin hidrokdi (H–C–OH) yaitu pada (m, H-3) dan 5,39 (tt, J = 8, 11,5 Hz, H-3'). Berdasarkan hasil tersebut dan dibandingkan dengan nilai geseran kimia dari fukosantin (Tabel 1) maka senyawa 1 benar merupan fukosantin.
Kandungan Fukosantin
Penentuan kandungan fukosantin dari tiga jenis rumput laut cokelat yang terdapat di perairan Madura dilakukan dengan 2 jenis metode yaitu metode KCKT dan spektroskopi. Kandungan fukosantin dengan metode KCKT dianalisa berdasarkan luas puncak fukosantin pada kromatogram KCKT yang dideteksi pada panjang gelombang 450 nm.
Kandungan fukosantin 3 jenis rumput laut cokelat, Sargassum fi lipendula, Sargassum cinereum dan Sargassum echinocarpum yang dianalisa secara spektroskopi berdasarkan metode Seely et al. (1992) dapat dilihat pada tabel 2. Selain itu pada tabel tersebut menunjukkan rata-rata kandungan fukosantin dari 3 kali ulangan beserta nilai SE dengan selang kepercayaan 5%. Untuk mempermudah pembandingan kandungan fukosantin.
Hasil penelitian memberikan kesimpulan bahwa kandungan fukosantin yang tertinggi S. filipendula 0,1844; S.cinereum 0,1548; S.echinocaropum 0,1514. Dari kromatogram KCKT fukosantin standar terdapat 2 puncak pada waktu tambat 10,06 dan 17,23 menit, serapan maksimum pada panjang gelombang 451 dan waktu tambat 10.06 menit. Kemudian hasil FTIR, OH = 3462; CH = 2923, 2853; Allene = 1930; C=O, acetate = –; C=O, ester =
1742; C=C, conjugated = 1650; C=O, konjugasi = –; CH2 =
1527, 1459; C-O, asetat = –; C=C, trans substituted = –, berat molekul terdeteksi dengan 658,77 dan BM fukosantin 658.917.
KEPUSTAKAAN
Haugan JA, T Aakemann, and S Liaaen-Jensen, 1995. In: Carotenoids. Isolation and Analysis (Britton, G., S. Liaaen-Jensen, and H. Pfander, eds.), Birkhauser Verlag, Basel, Switzerland. 1: 215–226,
Hegazi MM, AP Ruzafa, L Almela, and ME Candela, 1998. Separation and identification of chlorophylls and carotenoids from Caulerpa prolifera, Jania rubens and Padina pavonica by reversed-phase high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A, 829, 153–159.
Kim JM, S Araki, DJ Kim, CB Park, N Takasuka, H Baba-Toriyama, T Ota, Z Nir, F Khachik, N Shimidzu, Y Tanaka, T Osawa, T Uraji, M Murakoshi, H Nishino, and H Tsuda, 1998.
Chemopreventive effects of carotenoids and curcumins on mouse colon carcinogenesis after 1,2-dimethylhydrazine initiation. Carcinogenesis, 19, 81-85.
Maeda H, M Hosokawa, T Sashima, K Funayama, and K Miyashita, 2005. Biochem. Biophys. Res. Commun., 332, 392-397.
Matsuno T, 2001. Aquatic animal carotenoids. Fisheries Science, 67, 771–783.
Nomura T, M Kikuchi, A Kubodera, and Y Kawakami, 1997.
Proton-donative antioxidant activity of fucoxanthin with 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Biochem. Mol. Biol. Int., 42, 361 370.
Okuzumi J, H Nishino, M Murakoshi, A Iwashima, Y Tanaka, T Yamane, Y Fujita, and T Takahashi, 1990. Inhibitory effects of fucoxanthin, a natural carotenoid, on N-myc expression and cell cycle progression in human malignant tumor cells.
Cancer Lett. 55: 75–81.
Seely GR, MJ Duncan, and WE Vidaver, 1992. Preparative and analytical extraction of brown algae with dimethyl sulfoxide. Marine Biology 12: 184–188.
Shiratori K, K Ohgami, I Ilieva, XH Jin, Y Koyama, K Miyashita, S Kase, and S Ohno, 2005. Effects of fucoxanthin on lipopolysaccharide-induced infl ammation in vitro and in
vivo. Exp. Eye Res, 81, 422–428.
Weedon BCL, and P Moss, 1995. Chapter 3. Structure and Nomenclature dalam G. Britton, S. Liaaen-Jensen and H. Pfander. Carotenoids. Isolation and Analysis. Birkhauser Verlag Basel, 1: 34.
