BAHAN DAN METODE
Tempat PenelitianPenelitian dilakukan di Laboratorium Kimia Analitik Departemen Kimia, Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi FMIPA Institut Pertanian Bogor, dan Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka-LPPM IPB.
Bahan dan Alat
Bahan baku yang digunakan pada penelitian ini ialah daun dan umbi tanaman daun dewa yang diambil dari Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat (Balitro) dan Pusat Studi Biofarmaka-LPPM IPB (PSB). Serbuk daun dan umbi dibuat dengan mengeringkan daun dan umbi tanaman tersebut di dalam oven, pada suhu kurang dari 60 oC. Bahan-bahan kimia yang digunakan untuk keperluan analisa memiliki standar mutu pa, antara lain metanol, n-heksana, kloroform, dietil eter, etil asetat, n-butanol, amonium hidroksida, asam sulfat, petroleum eter, asam asetat anhidrat, natrium karbonat, asam formiat, HCl, NH3, pereaksi fitokimia, pereaksi folin-ciocalteau, telur A. salina Leach, air laut,
perangkat uji antikhamir S. cerevisiae, akuades, metanol HPLC grade, air HPLC grade, buffer KH2PO4, serta standar murni asam galat dan kuersetin dihidrat
yang diperoleh dari Sigma Chemical Co. St. Louis, USA.
Peralatan untuk ekstraksi antara lain blender, Soxhlet, alat pengocok (Shaker), refrigerator, termometer, dan seperangkat alat gelas. Untuk uji fitokimia dan uji bioaktif digunakan spot plate, oven, penangas air, rotavapor, laminar, autoklaf, vial uji, petri disk dan peralatan gelas. Untuk kromatografi lapis tipis (KLT) digunakan silika gel 60 F254 plat aluminium (20 x 20 cm, tebal
0,2 mm E. Merck). Untuk KLT preparatif digunakan silika gel 60 F254 (5x10 cm,
tebal 0,2 mm K GaA. Merck). Sedangkan untuk analisa menggunakan peralatan spektrofotometer UV-Vis Hitachi U-2800 dengan piranti lunak UV Solution keluaran Hitachi versi 2.0 dan kuvet kuarsa berukuran 1 cm, seperangkat spektrofotometer infra merah “Bruker-Tensor 37”, seperangkat alat kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) Hitachi dilengkapi dengan detektor UV-Vis L-2420, menggunakan kolom Li chrospher RP-18 panjang 4 x 125 mm, dan alat GC-MS.
Metode Penelitian
Penelitian ini dilakukan mulai dari persiapan bahan, uji pendahuluan (uji fitokimia) untuk penentuan pemilihan sampel, ekstraksi, pemisahan komponen dan identifikasi komponen. Pada tahap awal daun dan umbi tanaman daun dewa dibersihkan dengan air. Selanjutnya daun dan umbi yang sudah diiris-iris dikeringkan di dalam oven, Setelah daun dan umbi kering, lalu dijadikan serbuk untuk kemudian diekstraksi.
Uji Fitokimia
Uji Alkaloid. Sedikit sampel ditambah 10 mL CHCl3 dan beberapa tetes
NH4OH, lalu digerus. Kemudian di saring dan ekstrak dikocok dengan 10 tetes
H2SO4 2M. Lapisan asamnya diambil dan ditambah pereaksi Mayer, Wagner dan
Dragendorf. Hasil uji akan positif apabila terbentuk endapan putih ketika direaksikan dengan pereaksi Mayer, endapan coklat dengan pereaksi Wagner, dan endapan merah jingga dengan pereaksi Dragendorf (Harborne 1988).
Uji flavonoid. Sedikit daun atau umbi tanaman daun dewa segar ataupun 1 gram serbuk daun atau serbuk umbi tanaman tersebut ditambahkan metanol sampai terendam, lalu dipanaskan. Filtratnya diuji pada spot plate. Jika ditambahkan NaOH 10% terbentuk warna merah, positif mengandung fenol hidrokuinon. Jika ditambahkan H2SO4 pekat terbentuk warna merah, maka
positif mengandung flavonoid (Harborne 1988).
Sebanyak 3 gram serbuk daun atau umbi tanaman daun dewa ataupun sedikit daun dewa segar ditambahkan 10 mL HCl 2 N dan dipanaskan dalam labu erlenmeyer pada suhu 100 oC selama 30 menit. Setelah itu didinginkan dan disaring, filtratnya diekstraksi dengan etil asetat. Fasa asamnya dipanaskan kembali lalu diekstraksi dengan amil alkohol. Ekstrak amil alkohol dipakai untuk penentuan antosianin dan ekstrak etil asetat untuk penentuan adanya flavonoid yang lain (Suradikusumah et al. 1998).
Sebanyak 1 mL ekstrak amil alkohol ditambah natrium asetat lalu diamati, kemudian ditambah lagi 3 tetes FeCl3 dan diamati lagi. Sianidin dengan natrium
biru. Malvidin dengan natrium asetat memberikan warna biru dan bila ditambah FeCl3 warna tetap biru.
Sebanyak 1 ml ekstrak amil alkohol ditambah natrium karbonat lalu diamati. Pelargonidin memberikan warna ungu, sianidin memberikan warna biru muda, dan malvidin memberikan warna hijau biru.
Sebanyak 2 mL ekstrak etil asetat ditambah 0,1 gram serbuk Mg dan 0,5 mL HCl pekat, lalu diamati warna yang terjadi. Agar warna terlihat jelas dapat diencerkan dengan air. Flavon memberikan warna jingga sampai merah, flavonol memberikan warna merah sampai krem, dan kalkon serta auron tidak memberikan warna.
Sebanyak 1 mL ekstrak etil asetat ditambah beberapa tetes Pb-asetat lalu diamati warnanya. Flavon memberikan warna jingga sampai krem, kalkon memberikan warna jingga tua, dan auron memberikan warna merah.
Sebanyak 1 mL ekstrak etil asetat ditambah beberapa tetes NaOH 0,1 N lalu diamati warnanya. Flavonol dan flavon memberikan warna kuning, sedangkan kalkon serta auron memberikan warna merah sampai ungu.
Sebanyak 1 mL ekstrak etil asetat ditambah beberapa tetes H2SO4 pekat
lalu diamati warnanya. Flavonol dan flavon memberikan warna jingga sampai krem, dan kalkon memberikan warna krem sampai merah tua.
Ekstraksi Sampel
Ekstraksi dilakukan terhadap sampel tanaman terpilih dengan dua metode yang berbeda sesuai dengan kelas golongan senyawa flavonoid yang ingin didapatkan.
Ekstraksi Antosianin
Ekstraksi antosianin dilakukan merujuk pada Choung et al. (2001). Sebanyak 500 g daun dewa segar diekstrak 3 kali dengan 1 L larutan HCl 1%-metanol 40% dalam H2O dan disimpan dalam refrigerator selama 24 jam pada
suhu 4 oC. Penyaringan dilakukan dengan kertas saring Whatman no 1. Ekstrak yang didapat dari 3 kali ekstraksi dikumpulkan dan dipekatkan menggunakan rotavapor. Selanjutnya dihitung berat rendemen yang dihasilkan. Terhadap
ekstrak dilakukan uji antosianin dan flavonoid lainnya, penentuan total fenol serta diuji bioaktivitasnya terhadap larva A. salina Leach. Jika ekstrak mempunyai potensi bioaktivitas terhadap larva tersebut, lalu dilanjutkan dengan uji aktivitas antikhamir terhadap khamir S. cerevisiae.
Ekstrak kasar tanaman daun dewa difraksinasi dengan kolom Sephadex LH-20, lalu dielusi berturut-turut dengan 200 mL HCl 1%-H2O, 200 mL HCl
1%-CH3OH 10%, 200 mL HCl 1%-CH3OH 20%, dan 400 mL HCl 1%-CH3OH
30%. Fraksi-fraksi yang didapat dipekatkan menggunakan rotavapor. Selanjutnya masing-masing fraksi dimurnikan lebih lanjut dengan kromatografi kolom terbuka, dan dielusi berturut-turut dengan kombinasi pereaksi 200 mL HCl 1%-H2O, 200 mL HCl 1%-CH3OH 20%, 200 mL HCl 1%-CH3OH 30%,
dan 200 mL HCl 1%-CH3OH 40%.
Fraksi-fraksi dari kromatografi kolom diperiksa dengan KLT analitik. Fraksi dengan retention frontier (Rf) yang sama digabung, kemudian dilakukan
uji kualitatif untuk flavonoid. Fraksi yang mengandung komponen sama disatukan dan dikeringkan. Kemudian fraksi terpilih diuji toksisitasnya terhadap mortalitas larva udang A. salina Leach untuk mengetahui potensi bioaktivitasnya, dan yang mempunyai potensi bioaktivitas terhadap larva tersebut dilakukan uji aktivitas antikhamir terhadap khamir S. cerevisiae, dan diidentifikasi kemungkinan rumus strukturnya.
Ekstraksi Flavonoid lainnya
Ekstraksi flavonoid dilakukan dengan mengacu pada Markham (1988) dan Budzianowski et al. 1985 dalam Gauci, K. (2001). Serbuk tanaman daun dewa ditimbang dan dimaserasi dalam dua tahap perlakuan, yaitu pertama dengan metanol-air (9:1) dan kedua dengan metanol-air (1:1). Pada setiap tahap, pelarut ditambahkan secukupnya hingga terbentuk bubur cair, lalu dibiarkan selama 6-12 jam. Hasil maserasi yang diperoleh dari dua tahap perlakuan disaring dengan cepat memakai saringan hisap dan kertas saring Whatman nomor 40 dan disatukan. Ampas yang diperoleh dikeringkan dalam oven pada suhu 40 oC,
sedangkan ekstraknya diuapkan dengan rotavapor sampai semua pelarut metanol menguap dengan sempurna.
Ekstrak air yang diperoleh dipartisi bertahap dengan corong pisah menggunakan n-heksan, kloroform, dietil eter, etil asetat, dan n-butanol. Ekstrak yang didapat diuapkan sampai kering pada tekanan rendah menggunakan rotavapor. Ampas dari perlakuan maserasi yang telah dikeringkan dalam oven diekstraksi kembali menggunakan Soxhlet selama satu jam menggunakan petroleum eter. Kemudian ampas dikeringkan pada suhu kamar untuk menghilangkan sisa petroleum eter, dan diekstraksi kembali dengan cara 2x pengulangan dengan 500 mL metanol. Masing-masing ekstrak dilakukan uji flavonoid, penentuan total fenol serta diuji bioaktivitasnya terhadap larva A. salina Leach. Ekstrak yang mempunyai potensi bioaktivitas dengan larva tersebut diuji aktivitas antikhamirnya terhadap khamir S. cerevisiae.
Langkah berikutnya dilakukan analisa KLT terhadap larutan ekstrak kasar untuk melihat pola kromatogram dari masing-masing ekstrak dengan menggunakan fase diam lempeng KLT aluminium silika gel 60 F254 ukuran 1,50
x 10,00 cm dan fase gerak campuran dengan perbandingan n-butanol-asam asetat-air = 4:1:5 (v/v/v, fase organik). Spot yang didapat divisualisasikan dengan lampu UV, dengan penampak bercak uap amoniak.
Fraksi ekstrak terpilih difraksinasi lebih lanjut menggunakan KLT preparatif dengan fase diam silika gel 60 F254 untuk memperoleh pemisahan
komponen untuk uji lanjutannya. Fraksi-fraksi terpilih diuji toksisitasnya terhadap mortalitas larva A. salina Leach dan uji antikhamir menggunakan S. cerevisiae. Selanjutnya diidentifikasi kemungkinan senyawanya.
Pengukuran Rendemen
Pengukuran rendemen diperlukan untuk mengetahui dan membandingkan jumlah senyawa yang dapat terambil oleh pelarut. Banyaknya rendemen hasil ekstraksi dihitung berdasarkan :
Rendemen (%) = x100% sampel bobot ekstrak bobot
Penentuan Total Fenol
Analisis total fenol dilakukan dengan melarutkan sejumlah ekstrak kering sampel dalam etanol 95%, kemudian ditambahkan akuades dan reagen folin-ciocalteau 50%, lalu didiamkan dan ditambahkan Na2CO3 5% lalu
dihomogenisasikan dan diinkubasi dalam gelap. Kemudian dihomogenisasi kembali dan diukur pada panjang gelombang 765 nm. Konsentrasi larutan ekstrak dihitung berdasarkan persamaan regresi yang diperoleh dari kurva larutan standar. Sebagai larutan standar digunakan asam galat.
Penentuan Total Antosianin
Pengukuran kadar antosianin dilakukan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang maksimum bahan baku yang digunakan (rentang absorbsi senyawa antosianin berkisar antara 500-535 nm). Ektrak hasil ekstraksi di atas, dilarutkan dalam larutan etanol 95%-HCl 1,5 N (85:15) dan ditutup dengan parafilm, lalu disimpan pada suhu 4 oC. Campuran didekantasi dan residu dicuci sampai didapat filtrat dengan volume 500 mL. Total antosianin dihitung dengan rumus : Total antosianin = 2 , 98 ) (absorbanx faktorpengenceran
Faktor 98,2 adalah nilai serapan molar dari pigmen antosianin dalam pelarut etanol 95% dan larutan asam klorida 1,5 N (85 : 15) (Lees dan Francis, 1972).
Uji flavonoid ekstrak sampel
Ekstrak sebanyak 10 mL ditambah 0,5 gram serbuk Mg dan 2 mL alkohol klorhidrat, lalu campuran dikocok kuat. Jika terbentuk warna merah, kuning atau jingga maka positif menunjukkan senyawa flavonoid (Harborne, 1988). Sedikit ekstrak dilarutkan dalam etanol 80% kemudian diuji dengan KLT menggunakan fasa diam kiesel gel 60 F254 (E. Merck), fasa gerak butanol-asam asetat-air
(4:1:5), dan penampak bercak uap amonia, lalu diamati di bawah sinar ultraviolet.
Uji Bioaktivitas Uji BSLT
Untuk uji BSLT dilakukan beberapa tahapan yaitu penetasan telur, persiapan contoh dan uji bioaktivitasnya. Penetasan telur dilakukan dengan cara menempatkan telur udang dalam gelas piala yang berisi air laut, lalu diaerasi dan diberi penerangan. Telur akan menetas dalam 48 jam dan siap untuk digunakan sebagai target uji bioaktivitas.
Proses persiapan contoh dilakukan dengan cara, di mana larutan ekstrak yang akan diuji bioaktivitasnya dibuat dengan konsentrasi 2000, 200 dan 20 ppm. Sedangkan untuk uji bioaktivitas sebanyak 10 ekor larva udang dan 100 μL air laut dimasukkan ke dalam tiap vial uji diikuti dengan penambahan 100 μL larutan ekstrak, sehingga konsentrasi akhir dalam vial uji adalah 1000, 100, dan 10 ppm. Untuk kontrol (air laut) dilakukan tanpa penambahan larutan ekstrak. Setiap perlakuan konsentrasi dilakukan 4 kali pengulangan. Pengamatan dilakukan setelah 24 jam. Jumlah larva udang yang masih hidup dan yang sudah mati dihitung. Data yang diperoleh diolah dengan menggunakan Probit Analysis Method untuk menentukan LC50 dengan selang kepercayaan 95% dengan soft
ware SPSS versi 12.
Uji Antikhamir S. cerevisiae
Media Potato Dextrose Agar (PDA). Sebanyak 39 gram bubuk PDA dilarutkan dalam 1 L air destilata, kemudian dipanaskan sambil diaduk sampai rata. Filtrat dituang kedalam Erlenmeyer, lalu distrerilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit pada tekanan 1 atm. Filtrat yang steril dituang ke cawan petri yang sudah disterilisasi. Untuk agar miring, sebanyak 5 mL larutan PDA ditempatkan dalam tabung reaksi dan ditutup dengan kapas. Tabung reaksi diletakkan pada rak agar miring dan didiamkan sampai mengeras.
Media Potato Dextrose Broth (PDB). Sebanyak 24 gram bubuk PDB dilarutkan dalam 1 L air destilata, kemudian dipanaskan sambil diaduk sampai rata. Filtrat dituang ke dalam labu erlenmeyer, lalu disterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit dan tekanan 1 atm.
Isolasi dan Peremajaan S. cerevisiae. Fermipan sebanyak seujung sudip dimasukkan dalam 5 mL air steril dan didiamkan selama 2 jam. Sebanyak satu ose larutan fermipan tersebut digoreskan pada media agar cawan dengan metode kuadran dan didiamkan selama 3 hari. Koloni khamir yang terpisah ditandai dengan spidol. Pada hari ke-3, kolom khamir yang terpisah diambil menggunakan ose dan diremajakan dalam media agar miring. Semua pekerjaan yang berhubungan dengan penggunaan khamir dilakukan secara aseptik dalam laminar.
Penentuan Kurva Pertumbuhan S. cerevisiae. Sebanyak satu ose khamir S. cerevisiae diinokulasikan ke dalam 50 mL media PDB. Selanjutnya diukur kerapatan optisnya pada panjang gelombang 436 nm setiap 3 jam sekali.
Uji Anti Khamir Contoh terhadap S. cerevisiae. Sebanyak 1 mL biakan S. cerevisiae dimasukkan ke dalam 200 mL media semisolid PDA (Metoda two layer). Setelah media kering dimasukkan kertas cakram yang telah disterilkan dalam autoklaf, lalu diteteskan ekstrak sampel ke dalam cakram sebanyak 20 µL. Selanjutnya cawan petri diinkubasi selama 2 hari. Lalu diamati diameter hambatan yang terbentuk.
Pencirian Senyawa Aktif
Identifikasi dan karakterisasi senyawa untuk fraksi terpilih dilakukan dengan menggunakan spektrometer UV-Vis, FTIR, KCKT dan GC-MS.
Identifikasi menggunakan spektrometer UV-Vis dilakukan dengan metode pergeseran panjang gelombang maksimum berdasarkan pengamatan spektrum UV-tampak senyawa dalam metanol, metanol dengan penambahan pereaksi NaOMe, Na-asetat, Na-asetat + Asam borat, AlCl3, dan AlCl3 + HCl. Fraksi
yang sama dikeringkan, digerus bersama KBr, lalu dibaca dengan alat spektrometer IR Bruker Tensor 37.
Identifikasi dengan GC-MS dilakukan dengan alat GC-MS Agilent Technologies 6890 Gas Chromatograph with Auto Sampler and 5973 Mass Selective Detector and Chemstation Data System, menggunakan kolom HP Ultra 2. dengan kondisi alat, laju alir 0,6 μL/menit, gas pembawa Helium.
Identifikasi dengan KCKT dilakukan dengan beberapa tahap, yaitu persiapan larutan stok standar kuersetin, persiapan larutan standar kuersetin, dan persiapan larutan ekstrak sampel. Kondisi KCKT mengacu pada Hertog et al. (1993), menggunakan kolom Li chrospher(R)100 RP-18, eluen metanol-buffer KH2PO4 0,025 M pH 2,4 (45:55), isokratik dengan laju alir 0,8 mL/menit, dan
detektor UV-Vis pada panjang gelombang 370 nm.
Persiapan Larutan Stok Standar Kuersetin. Larutan stok standar kuersetin dibuat dengan menimbang 0,0050 g standar kuersetin lalu dilarutkan dalam MeOH 50% sampai volumenya 10 mL. Larutan tersebut diambil 2 mL dan diencerkan sampai volumenya 10 mL. Konsentrasi larutan stok standar yang diperoleh yaitu 100 ppm.
Persiapan Larutan Standar Kuersetin. Larutan stok standar kuersetin 100 ppm diambil sebanyak 50, 250, 500, 750, dan 1000 μL dan diencerkan dengan MeOH 50% sampai volumenya 10 mL. Konsentrasi standar yang diperoleh sebesar 0,5; 2,5; 5; 7,5; dan 10 ppm. Masing-masing ekstrak kemudian diambil 4 mL dan ditambahkan 1 mL HCl 2M dan dikocok sampai homogen. Kemudian campuran disaring dengan filter 0,2 μm.
Persiapan Larutan Ekstrak. Ditimbang sedikit ekstrak dan ditambah 20 mL MeOH 50%, lalu ditambah lagi 5 mL larutan HCl 2M. Kemudian direfluk pada suhu 90 oC selama 2 jam. Selanjutnya larutan didinginkan. Larutan disaring dengan kertas saring filter 0,2 μm dan diinjeksikan ke alat KCKT.
