PENGKLONAN DAN DETERMENAS1 URUTAN NUKLEOTIDA PADA S'GENOM RNA-PSTV SERTA ANALISIS KERAGAMAN DAN FILOGENETIKA SUBKELOMPOK BCMV

PENGKLONAN DAN DETERMENAS1 URUTAN NUKLEOTIDA

PADA S'GENOM RNA-PSTV SERTA

ANALISIS KERAGAMAN

PENDAHULUAN

Berdasarkan analisis asam amino CP beberapa p o t y v i ~ ~ s , PStV, B I C W , dan

AzMV, digolongkan sebagai strain-strain dari BCMV (Hucluenot el

at.,

1994).

Subkelompok B C W sebelumnya dikelompokkan menjadi dua serotipe A dan B

bwdasarkan reaksi serologi (Vetten el a/., 1992). Mink el al. (1994) rnenysulkan

subkelompok B C W menjadi dua virus yang berbeda yaitu serotipe A menjadi

BCMNV dan serotipe B rnenjadi BCMV. Analisis filogenetika mernbuktikan PStV

termasuk ke dalam subkelompok BCMV (Murphy et al.. 1994).

Taksonomi potyvirus, sebagai kelompok virus tumbuhan terbesar, sampai saat

ini masih sulit dilakukan dengan baik karena besarnya variasi diantara anggota

kelornpok sehingga sulit membedakan antar strain potyvirus (Ward & Shukla, 1990).

ShuMa dan Ward (1988) mengslnakan urutan asarn amino CP untuk menilai

hubungan kekerabatan dari 17 strain yang berasal dari delapan spesies potyvirus. Hasil

kajian tersebut menunjukkan spesies-spesies yang berbeda rnempunyai kesamaan

urutan asarn amino CP 38-71s dan untuk strain-strain dalam virus yang sama

hornologhya 9049%. Frankel ef aZ. (1989) melaporkan hasil studi homologi urutan

nukleotida 3'UTR strain-strain dari waremelon mosaic 19int.s dan .wybean

mosazc virus ( S W . Hasid studi tersebut menunjukkan homologi urutan nukleotida 39-53% untuk virus yang berbeda dan 8 3 4 9 % untuk strain dalam jenis virus yang

sama. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui keragaman isolat-isolat PStV dan

andisis filogenetika PStV dalam subkelompok BCMV berdasarkan gen CP dan

BAHAN DAN METODE

Sintesis

cDNA

3'

Genom RNA-PStV

Sintesis cDNA dari 3' genom RNA-PStV (Garnbar 22) dilakukan dengan

teknik RT-PCR. RT-PCR dilakukan dengan protokol T i m One Ttzbe RT-PCR Kit

(Boehringer Mainheinn). Primer yang diynakan adalah PSTl (S'GCATGCCCTC-

GCCATTGCM') yang kompiementer den- basa ke 10.003-9984 pada bagian 3'

UTR dan PST4 (5'TACATAGC-AGAATCAGCACT3') yang homolog dengan

nukleotida 8810-8829 pada sistron NIb. Prosedur RT-PCR dilakukan seperti

percobam deteksi PStV. Hasil RT-PCR dianalisis dengan elektroforesis gel 1%

agarose/lxTAE (SOX TAE terdiriatas 2M Tris-HC1, pH8,3; 0,99 M asam asetat pekat,

dan 50mM EDTA) -- 5'

_Oenom

ssRNA PStV (10059

nf)

0 3' P1 H C R o P3 W Ct _vg Nls N h

-

Nlb CP UTR

1

I

Nlb CP UTR C )

,

,

I

4- PST4 1.2 Kb PST1

Gambar 22. Amplifikasi RT-PCR cDNA 1.2 Kb dari genom RNA PStV dengan

Pengklonan cDNA

3'

Genom RNA-PStV

1. Ligasi dan transformasi

cDNA 1,2 Kb hasil amplifikasi RT-PCR d i u r n i k a n dengan protokol QIAprep spin Kit (QIAGEN) dan diligasikan dengan plasmid vektor pGEM-T Easy (Promega)

(Gambar 23). Plasmid tersebut merupakan plasmid high copy mrmber yang

mempunyai penanda seleksi resisten terhadap arnpisilin. Situs Honing terletak pada

ORF dari ~galactosidase sehingga klon rekombinan dapat diketahui dari wama

koloni. Koloni berwarna p~rtih mengidikasikan bahwa bakteri tersebut mengandung plasmid rekombinan karena terjadi inaktivasi lacZ

sca T7

1

Apa l Aal I t Sph I NCO I pGEM"TEasy . ta,z BSIZ I N o r I Sac II EcoR l Spe l EcoR I No1 I s s t z I PSt l Sal l Nde I Sac l BsrX I Nsi l 1 start

Gambar 23. Plasmid vektor @GEM-T Easy) yang digunakan untuk mengklon cDNA

Reaksi ligasi antara fragmen cDNA dengan plasmid vektor dilakukan sebagai

berikut 1 pl 1 Ox dapar, 1 p1 (50 ng) plasmid vektor, 7pl cDNA hasil RT-PCR yang sudah dimurnikan, 1pI (3U) T4 DNA ligase dan diinkubasi semalam pada suhu 10°C.

Plasmid rekombinan ditransformasi ke Escherichia coIi DH5a (Mm EfJiciency/ Life

Technologie.F) mengikuti protokol pGEM-T Easy system (Promega). Bakteri yang telah ditransformasi ditumbuhkan pada media seleksi LB yang mengandung ampisilin (lOOpg/l), X-gd(0,SrngA). dan KPTG (0,gmgA).

IUon r e k o m b i i diidentifikasi dengan teknik PCR mengkuti prosedur yang

telah diikembangkan oleh Thornson (1997). Koloni berwarna putih disuspensikan

dalam 10pl air steril dan 1 p1 dari suspensi tersebut digunakan untuk PCR. Campuran

PCR adalah 1pl suspensi koloni, 0,2mM dNTP, 1,5 unit Taq polimerase, 1 p M primer

T7 dan SP6. Fragmen cDNA yang diklon diampLi6kasi pada kondisi (Perkin Elmer

4800): satu siklus 94°C- 1 menit; 25 siklus 94°C-10 detik, 50°C

-

20 detik, dan 72°C

-

1 menit. Hasil PCR d i d s i s dengan elektroforesis 1% agarosdlxTAE. 2. Xsolasi plasmid rekombinan

Plasmid r e k o m b i i diisolasi dan dimurnikan mengikuti protokol QIAprep spin

miniprep Kit (QIAGEN). Untuk konfirmasi ukuran cDNA yang disisipkan pada

plasmid vektor sesuai dengan ukuran 1,2 Kb dari cDNA gen CP-PStV

,

plasmid

rekombinan dipotong dengan EcoR1. EcoRl akan memotong plasmid rekombman

rnerjadi dua fiagmen DNA, yaitu: 3 Kb yang berasal dari vektor dan 1,2 Kb yang berasd dari sisipan DNA. Plasmid rekombinan yang telah dimurnikan digunakan

Determinasi

Urutan NuMeotida cDNA

3'

Genom RNA-PStV

Determinasi umtan nukleotida cDNA 3' genom RNA-PStV dari plasmid

rekombinan dengan metode Sanger el al. (1979) dilakukan mengikuti protokol BigDye

Terminator Kit (Perkin E h e r ) . Primer T7 dan SP6 dan empat primer internal

diynakan untuk mengetahui total urutan nukleotida kedua utas cDNA 3' genom

RNA-PStV (Tabel 12). Komposisi reagen untuk deterrninasi urutan nukleotida cDNA

3' genom RNA-PStV adalah 3,2 pM primer, 8pl campuran terminator BigDye, 5yl

suspensi plasmid rekomb'man, dan 4,8pl air bebas ion. Reaksi dilakukan menggunakan

Perkin Elmer 4800 dengan program untuk 25 siklus yaitu: 96°C - 30 detik, 50°C

-

15

detik, dan 60°C

-

4 menit. Hasil reaksi tersebut dipresipitasi dengan etanol untuk

menghilmgkan keleb-&an terminator. Urutan nukleotida diamati menggunakan mesin

sekuensi otornatis ABI PRTSM Model 377 Version 3.0. Konsensus urutan nukleotida

untuk masing-masing strain ditentukan berdasarkan umtan nukleotida dari dua klon

dan apabila terdapat nukleotida dari kedua klon tersebut maka klon ketiga

akan disehensi untuk menenidan nukleotida untuk konsensus urutan nukleotida.

Data dianalisis dengan komputer program Sepencher Version 3.0.

Tabel 12. Primer yang d i muntuk determinasi urutan nukIeotida cDNA dari 3'

genom RNA-PStV

Primer Urutan nukleotida Posisi hibridisasi

Aualisis Keragaman

dan

Filogenetika

Analisis keragaman antara isolat-isolat PStV dari berbagai daerah di Indonesia

dm strain-strain PStV dari Thailand, U S 4 d m Afrika Selatan, serta hubungan

kekerabatan dengan subkelompok BCMV dilakukan berdasarkan urutan nukleotida

gen CP, 3'UTR, dan asam amino CP. Prediksi urutan asam amino CP-PStV dari

konsensus urutan nukleotida dilakukan dengan program ANGIS (Ar~~rtraIian Nationat

Genomic Infomadion Service). Selain urutan nukleotida, asam amino CP, dan 3'UTR

yang diperoleh dari Mil penetitian ini, beberapa urutan nukleotida PStV dan

subkelompok BCMY diperoleh dari GeneBank (Tabel 13) juga digunakan dalam

analisis keragaman dan filogenetika.

Multipasangan (nn~ltipZealignment) urutan nukleotida gen CP dan 3'UTR

serta asam amino CP dianalisis dengan program CLUSTAL W (Thornson er al.,

1994). Sedangkan analisis filogenetika mengslnakan p r o m PIiYLIP Version 3.5

(Felsentein, 1985). M a e jarak masing-masing virus diitung dari pasangan urutan

rnengguwhn Kimura 2-parameter matrix (Kimura, 1980) dalam program DNADIST

untuk urutan nuklwtida dan PRODIST untuk urutan asam amino CP. Filogenetika

diduga dari matrik hubungan rnenggunakan metode NEIGHBOUR JOINING dan juga

analisis parsimony mengynakan DNAPARS. Pohon filogenetika digambarkan

dengan program DRAWTREE dalam PHYLP. Analisis bootstrap dengan 100

ulangm menggunakan SEQBOOT dan konsensus pohon filogenetika dibuat dengan

dengan kekerabatan masing-masing strain, sebaliknya untuk parsimorry tree, jarak tidak menggambarkan jarak genetika dari strain-strain BCMV.

Tabel 1 3 . Beberapa strain subkelompok BCMV yang digunakan dalam analisis keragaman dan filogenetika PStV

HASIL

Sintesis

cDNA

genom

RNA-PStV

cDNA 3' gemom RNA-PStV dari 15 isolat PStV yang berasal dari berbagai

daerah 13 Indonesia diarnplifkisi dengan teknik RT-PCR. Amplifikasi RT-PCR

menggunakan primer PSTl dan PST4 diperoleh cDNA 1,2 Kb yang meliputi sebagan

nukleotida sistron NIb, gen CP, dan 3'UTR. Selain fkagmen 1,2 Kb juga terdapat

arnplifikasi 600 bp yang merupakan amplifikasi yang tidak spesifik dari RT-PCR

(Gambar 24).

Pengldoaan cDNA

3'

Genom RNA-PStV

cDNA 1,2 Kb hasii amplitikasi RT-PCR dari genom RNA-PStV d i i o n pada

plasmid pGEM-T dan ditransfonnasikan ke E. c d i DH5a. Fragmen cDNA yang

berukuran 640 bp b e d dari IPS4 juga diklon untuk mengetahui urutan nukleotida

hasil amplifikasi tidak spesifik dari reaksi RT-PCR Seleksi kIon rekombinan

dilakukan dengan seleksi biru dan putih pada media seleksi (Gambar 25). Koloni yang

bakteri benvama putih menunjukkan bakteri tersebut mengandung plasmid

rekombinan. Sedangkan koloni yang berwarna biru menunjukkan bakteri hanya

mengandung plasmid vektor yang tidak disisipi oleh D N A yang berasal dari gen CP-

PStV.

Koloni bakteri yang benuarna putih selanjutnya diseleksi dengan teknik PCR

rnenggunakan primer T7 dan Sp6 untuk mengetahui ukuran D N A yang disisipkan pada

fiagmen DNA yang berukuran 1,4 K b yang terdii atas 1,2 Kb cDNA yang diklon dan 200 bp bagian dari plasmid vektor (Gambar 26). Tiga atau empat klon untuk masing- masing isolat PStV dipelihara clan diguoakan untuk percobaan sekmjumya (Tabel 14).

Gambar 24. Hasil amp- RT-PCR m e n g p m h n primer PSTl dan PST2 dari gemm

RNA

PStV.

A. Lajur 1 : cDNA h a d amp- RT-PCR (12 Kb, 600 bp, 400 bp); 2: 1 K b marker.

seleksi klon rekombinan

LB

+

ampisilin

+

IPTG + X-gal

Gambar 25. Proses Moning dan seleksi klon rekombinan pada media seleksi yang menimbulkan warna putih untuk klon rekornbinan dan biru untuk klon yang bukan rekombinan.

Tabel 14. Hasil seleksi klon rekombinan dengan teknik

PCR

Untuk kodkmasi ukuran cDNA yang disisipkan, plasmid vektor dipotong dengan endonuklease (EcoR1). Hasil potongan plasmid r e k o m b i i dengan E w R l menunjukkan semua plasmid r e k o r n b i membawa sisipan cDNA berukuran 1,2 Kb yang sesuai dengan ukuran cDNA 3' genom RNA-PStV kecuali untuk klon yang berasal dari IPS4 ukuran sisipannya adalah 640 bp y m g terpotong menjadi dua fragmen 300 bp dan 340 bp (Gambar 27)

Gambar 26. Hasil amplifikmi cDNA 1,4 W dari klon E. coli DHSa yang membawa plasmid rekombinan @GEM-T: : CP-PStV) yang diseleksi dengan teknik PCRmenggunsksnprimerT7dsnSP6.

Lajur 1 clan 17: i

K b

marker, 2: Kontroi wtif

(dHzO);

3-16: Klon rekombinan

Gambar 27. Hasil peolotoogan plasmid rekombinan dengan b R 1 .

Lajur 1 & 18: 1

W

marker, 2: plasmid r e k d i yang

utuh

(pHS1.1); 3: pHS1.1; 4: pIiS1.3; 5: pHS2.5; 6: pHS3.60,7: pHS5.9; 8: pHS5.6-9: pHS9.11; 10: pHS7.3; 11: pHS9.11; 12: pHSlO.1: 13: pHSl1.1; 14: pHSl4-1; 16: pHS14.1: 17: pHS15.16

Determinasi Urutan Nukieotida cDNA

3'

Genom RNA-PStV

Konsensus urutan nukleotida cDNA 3' genom RNA-PStV terdii atas 1.195

bp yang meliputi 91 bp NIb, 861 bp gen CP, dan 243 bp 3'UTR (Gambar 36). Hasil

translasi gen C P isolat-isolat PStV untuk mengetahui susunan asam amino CP

diperoleh 287 asam amino (Gambar 37). Hasid identifikasi menggunakan database

yang tersedia di GeneBank dengan program komputer ANGIS menunjukkan urutan nukleotida cDNA 640 bp yang berasal dari PStV-IPS4 adalah hasil ampliikasi RNA

ribosom tanaman (Gambar 39).

Semua gen CP dari isolat-isolat PStV Indonesia mempunyai satu kerangka

baca (open readingframe) tanpa kodon awal dan diakhiri dengan kodon stop pada

posisi 991. Terdapat situs pemotongan protease (Q/S: glutaminherin) yang

memisahkan urutan asam amino CP dengan protein NIb, dan stop kodon yang

memisahkan CP dengan 3'UTR (Gambar 28). Selain itu juga terdapat valin (V) pada

posisi -4 dari situs pemotongan protease (Q/S) yang merupakan urutan konsensus

dalam proses pemotongan poliprotein hasil ekspresi genom PStV. Urutan asam amino

CP isolat-isolat PStV Indonesia mempunyai motif DAG (asam aspartat-alanin-&sin)

UP.CAUAGSA64AUCAGCACUAWAACACUUUACACCAACA Y i A E S A L K T L Y T N A A A G A A ~ U ~ G A U J ~ G T A U U U U A G C U G U K R T K I E E L A K Y L A V G C U V G A W U W ; A C U A V G A A G U ~ G A A W : U G U G L D F D Y E V G C G E S Y CAUUUGCAGUCAGGAAGCAGCACAACACMCCACCAGUWj V D A G V D T A K D K K E K G A G C A A C A A A M G G V C C W ~ G G 3 W A S N K G K G P E S G E G S G G U A A U A A U A ~ C A G A G A A W U C A A U A A G A G G N N S R G T E N Q S I R ACAAOGAUGUGUUGC-a3AAA- D K D V N A G S K G K I V P U C G G C U U C A G A A G A ~ A C A A A G A G A A ~ ~ ~ A A U G R L O K I T K R M N L P M GUGAAA~GLb3UCUWAAUWAG9UCAUCUUUWG V K G K V I T N L D H L L A W A C A A G O C A G A G C I U A C W ~ A A C A C A A G A G C D Y K P E O T D L F N T R A A A C A M G A U G C A ~ ~ C A A ~ G T K M Q F E M W Y N A V K G G C G A G U A U G A A A U A G A V G A U G A A C A G A ~ U ~ G E Y E l D D E Q M S I V U G A A U ; G C W W ~ U W i A C A 4 U Q I : A C M C M N G F M V W C I D N G T S A C C G G A t K X l M A V G G M C A ~ W U Q 3 U G G A C A U P D V N G T W V M M D G D G A G C A A ~ W ~ ~ G A A U G E Q V E Y P L K P M V E N c A A A A C C V A C A C ~ W 3 A U G C A C C A U U K : ~ G A A K P T L R Q I M H H F S D U G C A ~ G C A W C A ~ G A A A ~ G C G A A A E A Y I E M R N S E R C C A U A C A L I E O X A G G U A U G G A ~ ~ G G G P Y M P R Y G L L R N L R A u A N l M U C U A ~ ~ ~ G i J D K N L A R Y A F D F Y E V A A C ~ G A C A ~ G A ~ G G G M G C A G V A G C A T S K T S D R A R E A V A C A G A U G A A -Q M K A A A L S N V N S K ~ ~ U O X M ~ C M C C A G C 6 4 G A A L F G L D G N V A T T S E N W ~ ~ C A ~ ~ ~ L c M A A c A f f i T E K H T A R O V N Q N M C A C A C A C W C ~ A ~ C C G C A ~ G A ~ H T L L G M G S P Q 3UTR

Gambar 28. Urutan nukleotida 3' genom RNA-PStV isolat PStV-IPS2 dan prediksi urutan asam amino protein NTb dan protein selubung PStV.

Analisis Keragaman

dan

Filogenetika

1. Keragaman strain-strain PStV

Multipasangan urutan nukleotida gen CP, S'UTR, dan asam amino CP

subkelompok BCMV dapat dilihat pada Gambar 36, 37, dan 3 8 . Urutan asam amino

CP dari isolat-isolat PStV yang berasal dari berbagai daerah di Indonesia dideduksi dari urutan nukleotida gen CP. Hasil perbandingan pasangan ganda diantara isolat-

isolat PStV yang berasal dari berbagai d a d di Indonesia menunjukkan keragaman

urutan nukleotida gen CP berkisar antara 0-2,1%, urutan asam amino CP 0-1,4%,

dan 3'URT O-2,l0A (Tabel 15).

Tabel 15. Varaiasi perbedaan diantara PStV strain Indonesia, Thailand, d m USA

Keragaman isolat-isolat PStV di Indonesia hampir sama dengan keragaman PStV yang berasal dari Thailand (TI, T3, T5, T6, T7) dan relatif lebih tin&

dibandingkan dengan PStV yang berasal dari USA (USA1, USA;?, USA3) (Tabel 15).

Analisis fZogenetika berdasarkan urutan nukleotida gen CP-PStV (Garnbar 29)

menunjukkan derajat kekerabatan strain-strain PStV berkorelasi positif dengan asal strain PStV. Analisis filogenetika menggunakan urutan asam amino CP (Garnbar 30) juga rnenunjukkan hasil yang sama. Isolat PStV dari Indonesia mempunyai hubungan

Asal strain PStV

]

G ~ ~ C P Asamamino CP

0- 1,4% 0-5,2% 0,7- 1,4"/0 Indonesia 3'- 0-2,1% 0-O,% 0,4- 1,2'!! 0-2,1% Thailand USA 0,1-2,W? 0,3-0,S0?

yang lebih dekat sesama isolat P StV dari Indonesia dibandiikan dengan strain-strain

PStV dari Thailand dan USA. Uji statistik menunjukkan PStV dari Indonesia,

Thailand, dan USA masing-masing membentuk kelompok monophylefic (nilai

booststrap 93) Analisis filogenetika mengindikasikan isolat PStV dari Indonesia,

Thailand, dan USA berasal dari tetua (progemtor) yang sarna

Hasil analisis filogenetika urutan nukleotida gen CP (Garnbar 29) menun-

jukkan isolat-isolat PStV yang berasal dari Indonesia terdiri atas dua kelompok

Kelompok pertama (subkelompok A) terdiri atas PStV-Ib (isolat Malang) dan PStV-

IPS14 (isolat Kalimantan Tengah), kelompok kedua (subkelompok B) terdiri atas 12

isolat PStV dari berbagai daerah di Indonesia Niai bootstrap 100 yang memisahkan

kedua kelompok tersebut menunjukkan bahwa kedua kelompok tersebut masing-

masing membentuk monophyletic yang berbeda Fiiogenetika berdasarkan urutan

asam amino CP (Gambar 30) juga menujukan adanya pemisahan garis evolusi pada

PStV yang berasal dari berbagai daerah di Indonesia. Adanya keragaman isolat-isolat

PStV yang berasal dari Indonesia digambarkan berdasarkan analisis parsimony pada Garnbar 3 1

T5

Gambar 29. Pohon filogenetikit PStV (Neigbmr Joining Tree) berdasarkan urutan nukleotida gen CP.

12,13,16,17,t9, I l l ,112,ilS

Garnbar 30. Pohon flogenetika PStV (Neigbmr Joining Tree) berdasarkan urutan asam amino

CP.

Gambar 3 1. Parsirnoni free subkempok BCMV berdasarkan urutan nukleotida gen CP.

2. Hubungan PStV dengan subgup BCMV

Analisis filogenetika urutan nukleotida gen CP subkelornpok BCMV (Gambar

32) menunjukkan bahwa isolat-isolat PStV dari Indonesia, Thailand, dan USA

mempunyai hubungan yang retatif dekat antar sesama strain PStV dibandingkan

dengan strain-strain BCMV yang lain (BCW-NL4, BICMV, A z W - H , A z W ,

DMV). Analisis filogenetika menggunakan urutan asam amino CP (Gambar 33) juga

menunjukkan hasil yang sama.

3arak genetika yang lebih jauh antara isolat-isolat PStV dengan strain-strain

B C W yang lain mengindikasikan tidak tejadi rekombinasi RNA antara PStV dengan

urutan nukleotida dan asam amino CP antara isolat-isolat PStV Indonesia dengan strain-strain BCMV Iainnya menunjukkan derajat keragaman urutan nukleotida gen

CP 11,O-12,9%, asarn amino CP 8-10,1%, dan 3'UTR 2,5-6,2% (Tabel 16)

Has3 analisis pasangan ganda 3'UTR PStV Indonesia dengan subkelompok BCMV menunjukkan sernua PStV yang berasal dari Indonesia mempunyai hubungan yang l e b i dekat dengan BCMV-NLA dan BlCMV dari pada dengan isolat-isolat PStV

yang berasal dari Thailand d m USA (Tabel 16). Kesamaan 3'UTR PStV Indonesia

dengan strain PStV dari Thailand 93-94,2%, deyan strain dari USA 90,9-92,6% l e b i

rendah dari kesamaan den- BCMV-NLA 94,s-95,5%, dan dengan BlCMV 97,l-

97,5%.

Tabel 16. Variasi perbedaan antara PStV strain Indonesia dengan strain-strain

Gambar 32. Pohon filogenetika (Neighmr Joining Tree) subkelompok BCMV

berdasarkan urutan nukleotida gen CP.

AzMV

Gambar 3 3 . Pohon filogenetika (Neigbmrr .Joz~zing Tree) subkelompok BCMV

Jarak genetika yang lebih dekat antara PStV strain Indonesia dan BlCMV mengindikasikan adanya rekombinasi RNA antara PStV dengan BlCMV dalam evolusi

PStV di Indonesia. Analisis filogenetika CP/3'UTR subkelompok BCMV juga

menunjukkan isolat PStV Indonesia lebih dekat dengan BCMY-NL4 atau BICMV

dari pada dengin strain-strain PStV yang berasal dari Thailand, US& atau Afrika

Selatan (Gambar 34).

Gambar 34. Pohon filogenetika subkelompok (Neighour Joining Tree) subkelompok B C . W berdasarkan urutan nukleotida CP/3'tTR

PEMBAHASAN

Keragaman isolat-isolat PStV yang berasal dari beberapa daerah di Indonesia pada level urutan nukleotida gen CP adalah 0-2,196 sama dengan 0-17 nt, urutan asam amino CP 0-1,4% setara dengan 0-11 aa, d m urutan nukleotda 3'UTR 0-2,1°A

atau 0-5nt Lebih rendahnya variasi isolat-isolat PStV pada level asam amino CP

dibandiigkan dengan level nukleotida gen CP menunjukkan kebanyakan rnutasi tejadi

pada basa ketiga dari kodon pada ORF protein selubung PStV. Pertukaran basa

ketiga pada kodon wob6le dengan basa tertentu tidak menimbulkan perubahan asam amino yang disintesis.

Karakter penyebaran PStV melalui benih yang dapat tersebar dari satu daerah

ke daerah yang lain merupakan faktor yang menyebabkan rendahnya variasi genetika

PStV dari beberapa wilayah di Indonesia. Penyebaran benih yang umumnya di

produksi di p u l a Jawa ke wilayah-wilayah lain sejalan dengan program ekstensifikasi

dan transmigasi rnenyebabkan PStV dari pulau Jawa tersebar ke pulau-pulau lain di

Indonesia.

Analisis keragarnan pada level asam amino CP untuk mengetahui hubungan

isolat-isolat PStV dari Indonesia dengan subkelompok BCMV menunjukkan variasi

antara 8-10,1% atau tingkat kesamaan 89,9-92%. Menurut kriteria yang diajukan oleh Shukla dan Ward (1988) isolat-isolat PStV yang berasal dari berbagai daerah di

Indonesia merupakan strain dari BCMV yang alamiah menyerang kacang tanah di

Indonesia. Hubungan PStV dengan subkelompok BCMV juga diamati berdasarkan

5,8% atau lcesamaan 94,2-97,5% antara isolat-isolat PStV Indonesia dengan

subkelompok BCMV Berdasarkan kriteria klasifikasi potyvirus yang dikernukakan

oleh Frenkel et al. (1989), isolat-isolat PStV tersebut diklasifikasikan sebagai strain

dari BCMV

Hasil penelitian ini rnendukung has2 penelitian terdahulu yaitu PStV-Ib yang

berasal dari Indonesia rnerupakan rekombinasi antara PStV dengan BlCMV {Revers ef

al. 1996). Hasil pengamatan pada urutan nukleotida isolat-isolat PStV dari Indonesia

menunjukkan rekombinasi RNA-PStV dengan BICMV terjadi pada posisi basa ke

9764 (38 nukleotida bagian hulu kodon stop) (Gambar 28 dan 38) Semua 14 isolat

PStV yang berasal dari Indonesia rnerupakan rekombinasi antara PStV dengan

BICMV. Tidak ditemukannya isoIat PStV Indonesia yang dekat hubungannya dengan

PStV dari Thailand dan USA pada urutan nukleotida CP/3'UTR mengindikasikan

b&wa rekombiinasi antara PStV dengan BlCMV telah terjadi sebelum PStV rnasuk ke

Gambar 35. M o d e l pindah silang antara RNA BICMV dengan RNA P S t V membentuk P S t V rekombinan.

Rekombinasi RNA antar spesies virus mempakan faktor utama sebagai

penyebab terjadinya variasi biologi virus tumbuhan (Revers e t ul., 1996). RNA-

deperdenf R N A - p o & n e r a ~ e (RdRp) dalam proses replikasi genom RNA virus tumbuhan merupakan subyek terjadinya rekombinasi nukleotida (Rao & Hall, 1993).

Rekombinasi R N A merupakan faktor utama dalam proses evolusi virus (Strauss &

Strouss, 1988). Peranan rekombinasi R N A dalam evolusi virus juga didukung oleh pengamatan rekombinasi heteroiogus RNA genom BMV ( h r r ~ m e mosaic virus) P a g y

& Bujaski, 1992). Rekombinasi antara PStV dengan B l C W dapat te rjadi rnelalui

infeksi campuran pada tanaman kedelai (Gljcine mar L.) atau blackeye cowpea

( F i g n a unguiculafa). Kedua tanaman tersebut merupakan inang yang secara alamiah dapat terinfeksi oleh P S t V dan BlCMV (Edwarson & Christie, 1991 ).

Diduga P S t V pertama kaii masuk k e Indonesia dan RRC bersamaan rnelalui irrtroduksi tanaman kacang tanah oleh bangsa Spanyol pada abad .ke 16. Sedangkan

PStV masuk USA pada tahun 1984 melalui benih yang diimpor dari RRC (Demski,

1984). Berdasarkan sejarah penyebaran kacang tanah dan karaIcter penyebaran PStV,

maka pemisahan antara PStV strain Indonesia dengan strain USA diperkirakan te jadi

sejak abad ke 16. A d s i s filogenetika isolat-isolat PStV rnendukung hal tersebut yang menunjukkan PStV strain Indonesia mempunyai jarak genetika yang lebih dekat

dengan strain-strain yang berasal dari USA dan Afrika Selatan dari pada dengan

strain.-strain yang berasal dari Thailand. Pemisahan antara PStV strain Indonesia dengan strain PStV dari Thailand & p e r M a n telah te jadi lama sebelum pernisahan

Tabel

17,

Persentase kesamaan

urutan

nukleotida gen

CP dan

asam

amino

CP

diantara isolat-isolat

PStV

yang

berasal dari

berbafiai daerah

di

Indonesia

Tabel

18.

Persentase

kesamsan wutan

nukleotida

3'UTR

diantara

isolat-isolat

PStV

yang

berasd

dari berbagai daerah di

Indonesia

Adisis

multipasangan sekuen nukleutida gen CP subgrup BCMV CLUSTAL w ( 1 . 7 ) multiple sequence alignment

AZgMV DMV AZBMVH I P S l I P S 1 5 I P S 9 I P S 7 I P S 6 I P S 3 I P S 1 2 I P S 1 1 I P S 2 I P S 1 0 I P S 5 I P S 1 3 IND I P S 1 4 USA2 USA3 USA1 RSA T3 T6 T7 T1 T5 NL4 BICMV A Z W m AZBMVH I P S l I P S 1 5 I P S 9 I P S 7 I P S 6 I P S 3 I P S 1 2 I P S 1 1 I P S 2 I P S 1 0 I P S 5 I P S 1 3 I ND I P S 1 4 USAZ USZU USA1 RSA T3 T6 T7 T 1

AZBMV DMV AZBMVH I P S 1 I P S 1 5 I P S 9 IPS7 I P S 6 IPS3 I P S 1 2 I P S 1 1 IPS2 I P S 1 0 I P S 5 I P S 1 3 IND I P S 1 4 USA2 USA3 USA1 RSA T3 T6 T7 T1 T5 NL4 BLCMV AZBMV DMV AZBMVH I P S 1 I P S 1 5 I P S 9 I P S 7 I P S 6 I P S 3 I P S 1 2 I P S 1 1 I P S 2 I P S 1 0 I P S 5 I P S 1 3 IND I P S 1 4 USA2 USA3 U S A 1 R SA T3 T6

vsil rvsn msn zvsn V T S d I aNI E T S d I S S d I O T S d I Z S d I T T S d I Z T S d I E S d I 9SdI L S d I 6SdI S T S d I T S d I HmaKzY m I\kIBm m V ' I N S L T L L L 9 L E L vsx rvsn Evsn m n V T S d I CUiI E T S d I SSdI O T S d I Z S d I T T S d I Z T S d I E S d I 9SdI L S d I 6 S d I S K S d I T S d I =mi IIWl mmi

AZBMV DMV AZBMVH I P S 1 I P S 1 5 I P S 9 I P S 7 I P S 6 I P S 3 I P S 1 2 I P S 1 1 I P S 2 I P S 1 0 I P S 5 I P S 1 3 IND I P S 1 4 USA2 USZU USA1 RSA T3 T6 T7 T I T5 NL4 BLCMV A 7 i W DMV . AZBMVH I P S 1 I P S 1 5 I P S 9 IPS7 I P S 6 I P S 3 I P S 1 2 I P S 1 1 I P S 2 IPS10 I P S 5 I P S 1 3 IND I P S 1 4 USA2 USA3

USAl RSA T3 T6 T7 T 1 T5 NL4 B -AZBMV DMV AZBMVH I P S l I P S 1 5 IPS9 IPS7 I P S 6 IPS3 I P S 1 2 I P S l l IPS2 I P S 1 0 I P S 5 I P S 1 3 IND I P S 1 4 USA2 USA3 USAl RSA T3 T6 T7 TI T5 NL4 BLCMV AZBEn DMV Az- I P S l I P S 1 5 I P S 9 I P S 7 I P S 6 I P S 3 I P S 1 2 I P S l l I P S 2 I P S 1 0 IPS5 I P S 1 3 IND I P S 1 4

USA2 USA3 USAl RSA T3 T6 T7 T I T5 NL4 BLuW AZBMV DMV AZBMVH I P S 1 I P S 1 5 I P S 9 I P S 7 I P S 6 I P S 3 I P S 1 2 I P S l l I P S 2 I P S 1 0 I P S S I P S 1 3 IND I P S 1 4 USA2 USZU USAl RSA T3 T6 T7 T1 T 5 m4 BLCMV AZBMV DMV Azm4vH I P S 1 I P S 1 5 I P S 9 IPS7 IPS6 I P S 3 I P S 1 2 I P S l l IPS2 I P S 1 0 IPSS I P S 1 3

I N D I P S 1 4 USA2 USA3 USA1 RSA T3 T6 T7 T I T5 NL4 BLCMV AZBMV DMV AZBMVH I P S l I P S 1 5 I P S 9 IPS7 I P S 6 I P S 3 I P S 1 2 I P S l l I P S 2 I P S l O I P S 5 I P S 1 3 I N D I P S 1 4 USA2 USA3 USA1 RSA T3 T6 T7 T 1 T5 m4 B?xmv AZBMV DMV AZBMVH I P S l I P S 1 5 I P S 9 IPS7 I P S 6 IPS3 I P S 1 2 I P S l l IPS2 IPSlO

m V ? N E 6 rs. L J 9 & E J Ysn m n Evsn ZIfSn V T M I aN1 E T S d I SSdI O T S d I E S d I T S S d I zrsar E S d I 9SdI L S d I 6SdI S T S d I T S d I m m rn m2-d AhMg. V'IN S5. 1.L L.L 95. E.L VSY rusn msn zvsn V S S d I m1 E T S d I S S d I

-1

s multipasangan sekuen asam amino CP subgrup BCh4V

CLUSTAL AZBMV DMV A Z m I P S 1 5 I P S 9 I P S 7 I P S 6 I P S 3 I P S 2 I P S 1 2 I P S 1 1 I P S l I P S 1 0 I P S 5 I P S 1 3 I N D I P S 1 4 USA2 USA3 USAl RSA T 3 T6 T7 T L T5 BLcrw NL4 AZaMV rn AZBMVH I P S 1 5 I P S 9 I P S 7 I P S 6 I P S 3 I P S 2 I P S 1 2 I P S 1 1 I P S l I P S 1 0 I P S 5 I P S 1 3 I N D I P S 1 4 U S A 2 U S A 3 U S A l R SA T 3 T 6 T7 TI

w (1.7) rnultlple sequence alignment

SCrNNSRGAENSTMRDRDVNAGSKG S(;NNSRGAENSPMRDXDVNAGSKG SGDSSRGAENS-SKG SGNICSRGTENQS-SKG SGNNSRGTEWQSIRDKDVNAGSKG GKGPIEGEG-SRGTENQS-SKG PE!ZGFGSGNNSRGTESQSIRDKIFJNAGSKG PES2EG-SRGmSI-SKG PESGEYjSGNNSRG!l'ENQ-SKG PES2EGSGNNSRG!l'ENQ-SKG PES2EGSCbUNSRGTENQSMRDUDVNAGSKG PESGEYjSGNNSRGTENQ-GSKG PESGBSSGNNSRGTENQSKRDKDVNAGSKG P E S S ~ S ~ Q S M P D X D V N A G S K G PESSGSGNNSRGTENQSMRDKDVIGGSKG PESSEGSGNKSRGTENQSMPQKDVIGGSKG S E S S ~ S R G T E N Q S M B D I W V N A G S R G S-SRG-SRG SESSEGS3Tl?SRGTENQ-GSRG PESGB3-SRG-GSRG

A 7 . W DMV A Z m I P S 1 5 I P S 9 IPS7 I P S 6 IPS3 IPS2 I P S 1 2 I P S l l I P S 1 I P S 1 0 I P S 5 I P S 1 3 IND I P S 1 4 USA2 USA3 USAl RSA T3 T6 T7 T1 T5 BLCMV NL4 AZBMV rm Azm4W-I I P S 1 5 I P S 9 IPS7 I P S 6 I P S 3 I P S 2 I P S 1 2 I P S l l I P S 1 I P S 1 0 I P S 5 I P S 1 3 IM) I P S 1 4 USA2 USA3 USA1 RSA T3 T6

-- - IPS13 A A A t P T T - - S F Q IND mSNVN-TT W S P 2 IPS14 A A A L S J V N - T T P S E ' Q USA2 A A A L P T T S E 3 m E m m - S A Q RSA T3 T6 T7 T1 T5 B l x n v I n 4

Gambar 37. Analisis multipasangan urutan asam amino protein selubung (CP) subke1ompok BCMV. DAG (asam aspartat-danin-&sin) adalah urutan asam m i n o spesifik pengendali transrnisi potyvirus me1 Jui seranBa vektor.

E J T J vsa w i n m n m n W - I N m s P T S d I aNI T S d I Z T S d I E T S d S 5 T S d I Z S d I E S d I 9 S d I L S d I 6SdI S S d I T T S d I O T S d I wLnwx Iuia m m 9J 56 LJ EJ. T 6 VSU m n m n m n ,-IN m s V T S d 1 m1 T S d I Z T S d I E T S d I S T S d I Z S d I E S d I 9 S d I L S d I 6 S d I S S d I T T S d I O T S d I m m m m m

A Z m 13MV A Z m IPSlO IPS11 IPS5 IPS9 IPS7 IPS6 IPS3 IPS2 IPS15 IPS13 IPS12 IPS1 IND IPS14 BLCMV NL4 USA2 USA3 USAl RSA T1 T3 T7 T5 T6 Azm DMV A Z m IPSlO IPS11 IPS5 IPS9 IPS7 IPS6 IPS3 IPS2 IPS15 IPS13 IPS12 IPS1 IND IPS14 BlXlMV NL4 USA2 USA3 USAl RSA

TGC TGC TGC TGC TGC TGC TGC TGC TGC TGC TGC TGC TGC TGC TGC TGC TGC TGC TU3 TGC TGC TGC TGC TOC TGC TGC

---

TGC

Gambar 38. Analisis multipasangan urntan nukleotida CP13'UTR subkelompok B C W . Nukleotida ke 38 bagian hulu stop kodon (-38) merupakan lokasi terjadinga pindah silang dalam proses rekornb'masi homolog antara PStV d m B C W .

Gambar 3 9 . Urutan nukleotida RNA ribosom kacang tanah hasil amplifikasi RT-PCR yang tidak spesifik menggunakan primer PSTl dan PST4.