TINJAUAN PUSTAKA Botani Tanaman
Tanaman rosela diklasifikasikan dengan kingdom Plantae, divisio Spermatophyta, subdivisio Angiospermae, kelas Dicotyledonae, ordo Malvales,
famili Malvaceae, genus Hibiscus, species Hibiscus sabdariffa L. (Mardiah, dkk., 2009).
Batang merupakan herba tahunan yang biasanya mencapai ketinggian 0,5-3 meter. Bentuk batang bulat, tegak, berkayu, banyak percabangan dan berwarna merah (Widyanto dan Nelistya, 2008).
Daunnya tunggal, berbentuk bulat telur, pertulangan menjari dan letaknya berseling dan pinggiran daun bergerigi dan daun berwarna hijau berbentuk hijau (bulat telur) dengan ujung daun yang meruncing atau bercangap. Daun memiliki tulang-tulang menjari warna merah dan tepi beringgit dengan banyak kelenjar pada permukaan bawahnya daun letaknya berseling-seling (spiral) mengelilingi batang tanaman yang terdiri dari tangkai daun, helai daun dan tidak mempunyai upih (vagina) dan ukuran daun panjang dapat mencapai 6-15 cm dan lebar 5-8 cm (Wijayanti, 2010).
Bunga rosela yang keluar dari ketiak daun merupakan bunga tunggal, artinya pada setiap tangkai hanya terdapat satu bunga. Bunga ini mempunyai 8-11 helai kelopak yang berbulu, panjangnya 1 cm, pangkalnya saling berlekatan dan berwarna merah dan ukuran bunga cukup besar, diameter ketika sedang mekar lebih dari 12,5 cm dan memiliki dasar bunga pendek. Kelopak bunga ini sering dianggap sebagai bunga oleh masyarakat. Bagian inilah yang sering dimanfaatkan sebagai bahan makanan dan minuman. Mahkota bunga berbentuk corong, terdiri
dari 5 helaian, panjangnya 3-5 cm. Tangkai sari merupakan tempat melekatnya kumpulan benang sari berukuran pendek dan tebal, panjangnya sekitar 5 mm dan lebar sekitar 5 mm. Putiknya berbentuk tabung, berwarna kuning atau merah, bunga rosela bersifat hermaprodit (mempunyai bunga jantan dan bunga betina) sehingga mampu menyerbuk sendiri (Mardiah, dkk., 2009).
Buah berbentuk kerucut, berambut, terbagi menjadi 5 ruang, berwarna merah. Bentuk biji menyerupai ginjal, berbulu dengan panjang 5 mm dan lebar 4 mm. Saat masih muda, biji berwarna putih dan setelah tua berubah menjadi abu-abu (Maryani dan Kristina, 2005).
Benih Ortodoks dan Benih Rekalsitran
Benih adalah awal kehidupan dari suatu budidaya tanaman dan keberhasilan peningkatan produksi dalam usaha tani sangat dipengaruhi oleh benih yang digunakan. Untuk mencapai produk yang maksimum, benih yang akan ditanam harus memiliki mutu tinggi. Benih itu tidak cukup hanya memiliki kemampuan reproduksi normal pada kondisi yang optimum, tetapi juga pada kondisi yang sub optimum. Benih yang memiliki vigor kekuatan tumbuh demikian akan mampu mencapai produksi maksimum pada kondisi optimum. (Sadjad, 1994).
Benih ortodoks adalah benih yang dapat dikeringkan dan disimpan pada suhu rendah dalam jangka waktu yang lama sehingga dapat bertahan hidup lebih lama. Viabilitas benih ortodoks dapat dijaga dengan mengeringkan benih dan menyimpannya pada suhu rendah. Kadar air yang rendah pada benih ini berkolerasi dengan peningkatan daya simpan (Fitriyatmi, 1996).
Mengklasifikasikan benih menurut sifatnya benih ortodoks adalah benih yang tahan dikeringkan hingga kadar air yang rendah lebih kurang 5% dan toleran terhadap suhu rendah. Benih ortodoks berasal dari spesies tanaman setahun yang tumbuh di daerah terbuka, dan mempunyai periode simpan yang lama tergantung pada temperature dan kadar air selama masa simpan (Mulsanti, 2002).
Benih rekalsitran adalah benih yang memiliki kadar air kritis yang tinggi, sehingga bila benih dikeringkan di bawah kadar air tersebut, viabilitas benih menurun dengan cepat. Keadaan ini menyebabkan benih golongan ini hanya dapat disimpan selama beberapa minggu atau bulan, bahkan ada benih yang hanya bertahan beberapa hari sebelum viabilitasnya menurun dengan cepat. Benih rekalsitran peka terhadap pengeringan dan umumnya mati bila dikeringkan di bawah kadar air kritis (12-35%). Pada rentan kadar air ini dapat terjadi pertumbuhan jamur dan peningkatan suhu di dalam benih atau perkecambahan, karena itu benih rekalsitran lebih pendek umurnya walaupun kondisi kelembaban
tinggi sehingga membutuhkan teknik penyimpanan yang lebih baik (Fitriyatmi, 1996).
Nitrogen Cair
Nitrogen cair dapat diperoleh pada temperatur -1960C, temperatur yang cukup rendah, dimana diketahui efek temperatur rendah dan tinggi sama saja, bisa menghancurkan benda-benda yang dilewatinya, sesuai dengan ketahanan dan kekuatan benda yang dilewatinya. Nitrogen adalah senyawa kimia yang bersifat inert, mempunyai rumus molekul N. Biasanya ditemukan sebagai gas tanpa warna, tanpa bau, tanpa rasa dan merupakan gas diatomik bukan logam yang stabil, sangat sulit bereaksi dengan unsur atau senyawa lainnya. Dinamakan juga
zat lemas karena zat ini bersifat malas, tidak aktif bereaksi dengan unsur lain (Amri, 2011).
Nitrogen cair adalah salah satu kriogen yang paling banyak digunakan mudah dan banyak tersedia, ramah lingkungan, tidak mudah terbakar, murah, dan memiliki temperatur paling rendah diantara kriogen lainnya yaitu -1960
Nitrogen cair diproduksi menggunakan bahan baku udara, dimana udara ditekan dalam kompresor, kemudian dicairkan dan dilakukan pemisahan antara nitrogen, oksigen dan argon. Dikenal beberapa teknologi pemisahan nitrogen dari udara, diantaranya adalah : 1. Pressure Swing Adsorption (PSA) yang digunakan dalam generator oksigen dan nitrogen 2. Vacuum-Pressure Swing Adsorption (VPSA) yang digunakan dalam generator oksigen dan 3. Membran pemisahan yang digunakan untuk menghasilkan gas nitrogen (Amri, 2011).
C sehingga menyebabkan jaringan lebih cepat beku. Kerugiannya yaitu penggunaan nitrogen
cair yang terlalu agresif akan meninggalkan hipopigmentasi permanen (Daulay, 2010).
Faktor-Faktor Yang Mempengaruhi Keberhasilan Kriopreservasi
Kriopreservasi adalah salah satu cara yang dapat dilakukan untuk mengonservasi sumber daya genetik terutama terhadap tanaman yang mempunyai karakteristik benih. Melalui metode ini material tanaman dapat diawetkan tanpa mengubah morfologi maupun kandungan biokimianya, sehingga dapat juga digunakan untuk kelestarian jenis-jenis tanaman langka dan hampir punah. Metode ini sudah berkembang dengan baik dan menjadi metode rutin untuk beberapa jenis tanaman. Ketahanan terhadap kondisi dingin beku (freezing) di dalam larutan nitrogen telah banyak diteliti pada lebih dari 100 jenis tanaman baik
yang berasal dari daerah beriklim sedang maupun tropik pada berbagai kultur jaringan tanaman (Syamsuwida dan Aminah, 2008).
Teknik kriopreservasi merupakan teknik penyimpanan pada suhu yang sangat rendah (-196oC) dalam nitrogen cair. Teknik ini potensial dikembangkan untuk penyimpanan plasma nutfah tumbuhan dalam jangka panjang. Dengan teknik kriopreservasi, pembelahan sel dan proses metabolisme dalam sel, jaringan, atau organ bahan tanaman yang disimpan dapat dihentikan sehingga tidak terjadi modifikasi atau perubahan dalam waktu yang tidak terbatas. Kondisi suhu
penyimpanan bahan tanaman dengan teknik kriopreservasi sangat rendah, yaitu -160 hingga -1800C (nitrogen fase uap) bahkan sampai -1960
Teknik kriopreservasi juga tidak menyebabkan perubahan genetik, sehingga stabilitas genetik bahan yang disimpan lebih terjamin karena tidak
menggunakan zat penghambat tumbuh dalam jangka waktu yang lama (Roostika, dkk., 2004).
C (nitrogen fase cair) (Roostika dan Mariska, 2003).
Setiap teknik penyimpanan mempunyai kelebihan dan kekurangan. Pada penyimpanan in vitro jangka pendek dan jangka menengah diperlukan tindakan subkultur yang berulang-ulang sehingga kurang efisien dalam hal waktu, tenaga, ruangan, dan biaya. Tindakan tersebut juga dapat menyebabkan kultur mengalami kontaminasi dan kehilangan vigoritas karena kehabisan unsur hara yang terdapat dalam media dan berpeluang terjadinya perubahan genetik akibat penggunaaan zat penghambat tumbuhan dalam jangka waktu yang relatif lama. Teknik kriopreservasi dapat dibedakan atas teknik lama dan teknik baru. Teknik lama didasarkan pada freeze-induced dehydration, yaitu dehidrasi yang diinduksi
dengan pembekuan pada suhu dibawah titik beku air hingga -400C, sedangkan teknik baru didasarkan pada vitrification, yaitu dehidrasi yang di induksi pada suhu diatas titik beku air. Teknik lama juga disebut teknik pembekuan lambat atau teknik pembekuan 2 tahap. Teknik pembekuan 2 tahap meliputi inkubasi sel pada krioprotektan dengan total konsentrasi 1-2 M yang menyebabkan dehidrasi moderat dan diikuti oleh pembekuan lambat, misalnya dengan 10C per menit hingga suhu -350
Namun demikian, belum ada metode dengan tujuan yang sama untuk struktur tanaman yang lebih kompleks seperti apeks dan embrio, sehingga masih perlu dilakukan penelitian mendalam untuk mendapatkan metode yang baku dan dapat diaplikasikan secara lebih luas. Dalam prosedur vitrivikasi, bahan tanaman harus cukup terdehidrasi secara osmotik pada suhu tidak dingin dengan memberi konsentrasi larutan vitrivikasi yang tinggi untuk menghindari kristalisasi saat dimasukkan ke dalam larutan nitrogen. Ketidakmampuan benih untuk menoleransi pengeringan hingga kadar air optimum yang dapat disimpan pada suhu di bawah -5
C, lalu pembekuan dalam nitrogen cair dan selanjutnya thawing (pelelehan) (Roostika dan Mariska, 2003).
0
Sejumlah faktor yang mempengaruhi keberhasilan kriopreservasi dengan teknik pembekuan lambat adalah 1. Kecepatan pembekuan, 2. Jenis dan konsentrasi krioprotektan, 3. Suhu akhir pembekuan dan 4. Tipe dan keadaan fisiologis bahan yang akan disimpan. Jika pembekuan terlalu lambat maka sel terlalu terdehidrasi sehingga konsentrasi zat elektrolit dalam sel menjadi tinggi. Jika pembekuan terlalu cepat maka sel kurang mengalami dehidrasi sehingga
C memerlukan percobaan lebih intensif (Syamsuwida dan Aminah, 2008).
terjadi formasi es intraselular yang bersifat letal. Penambahan kriprotektan dalam memelihara keutuhan membran dan meningkatkan potensial osmotik media
sehingga cairan di dalam sel mengalir ke luar dan terjadi dehidrasi (Roostika dan Mariska, 2003).
Kriopreservasi didefenisikan sebagai teknik penyimpanan untuk spesimen biologi pada suhu yang sangat rendah (-1960
Teknik kriopreservasi yang baru dapat diterapkan pada penyimpanan berbagai jenis eksplan seperti suspensi sel, kalus embriogenik, meristem, tunas apical, tunas aksilar, biji dan polen. Penyimpanan eksplan dalam teknik suspensi sel, kalus embriogenik, biji dan polen dimaksudkan untuk mempertahankan dan melestarikan keragaman genetik. Suspensi sel embriogenik sering digunakan terutama untuk tanaman monokotil sebagai bahan untuk transformasi dan khususnya bagi tanaman steril yang tidak dapat menghasilkan embriozigotik (biji). Biji dan polen biasanya disimpan dengan teknik desikasi karena kandungan air dalam kedua bahan tersebut relatif lebih sedikit (Roostika dan Mariska, 2003).
C) pada media cryogenic seperti nitrogen cair. Penyimpanan dengan pembekuan pada nitrogen cair merupakan metode yang potensial untuk penyimpanan dalam jangka panjang untuk konservasi plasma nutfah tumbuhan. Pada suhu yang sangat rendah seluruh proses pembelahan sel dan metabolisme berhenti, dan mengalami konservasi yang secara teoritis tidak terbatas oleh waktu (Pancaningtyas, 2013).
Penyimpanan material tanaman dengan teknik kriopreservasi, proses pembelahan sel dan proses metabolisme dalam sel, jaringan atau organ yang disimpan dapat dihentikan, sehingga bahan tanaman dapat disimpan tanpa terjadi modifikasi atau perubahan dalam waktu tidak terbatas. Teknik penyimpanan ini
didasarkan pada salah satu metabolisme reduksi (kehilangan media kultur, dehidrasi sebagian) atau penahanan metabolisme melalui kriopresevasi dalam nitrogen cair pada suhu -1960
Teknik kriopreservasi merupakan teknik yang potensial untuk penyimpanan jangka panjang, yaitu menyimpan tanaman kedalam nitrogen cair yang bersuhu -196
C. Metode ini sudah dilakukan pada embrio somatik. Berbagai macam keberhasilan telah dicapai seperti penumbuhan kembali embrio melalui embrio sekunder atau perubahan perkembangan tanaman melalui perkecambahan langsung embrio setelah proses media cair. Pada nitrogen cair dapat meminimalisir terjadinya kerusakan, sehingga teknik kriopreservasi banyak dimanfaatkan untuk konservasi plasma nutfah dalam bentuk biji, karena selain lebih mudah dan lebih sederhana untuk disimpan, tidak terjadi penurunan viabilitas (Pancaningtyas, 2013).
0
Benih yang disimpan di dalam nitrogen cair harus mencapai kadar air yang optimal sehingga selama dalam penyimpanan tidak mengalami kerusakan akibat suhu ultra dingin (chilling injury) (Djam’an, dkk., 2006). Pada benih ortodoks yang telah dikeringkan dengan mendapat kadar air tertentu kemudian dimasukkan ke dalam tabung krio dan disimpan di dalam tanki nitrogen cair selama 24 jam sebelum dikecambahkan, benih tersebut dicairkan (thawing) pada suhu ruangan C. Penyimpanan dengan cara tersebut tidak memerlukan tindakan subkultur yang berulang-ulang sehingga lebih efisien dari segi biaya, waktu, ruang penyimpanan, dan tenaga. Keberhasilan teknik kriopreservasi tidak hanya ditunjukan dengan kemampuan hidup regenerasi bahan tanaman pasca
kriopreservasi, namun juga ditentukan oleh tingkat stabilitas genetik (Roostika dan Mariska, 2003).
280
Laju Pendinginan
C (Priadi, 2006). Berdasarkan penelitian pendahuluan pada perlakuan perendaman dengan nitrogen cair selama 24 jam dengan kadar air 8,6 % di dapat persentase kecambah normal sebesar 59 %.
Pembekuan dengan cara cepat (langsung dimasukkan ke nitrogen cair) umumnya lebih merusak sel dibandingkan pembekuan lambat. Untuk itu diperlukan laju pendinginan yang optimum untuk setiap jenis tanaman. Laju pendinginan yang optimal bervariasi untuk setiap jaringan yang disimpan, dimana kerusakan yang akan dihasilkan minimum dan menghasilkan daya tahan yang tinggi. Sel atau jaringan yang didinginkan di bawah laju optimum dapat rusak karena perubahan sifat dari ekstraseluler yang disebabkan karena terbentuknya es dan konsentrasi larutan tinggi, sedangkan sel yang didinginkan di atas laju optimum akan rusak akibat terbentuknya es pada intraseluler. Umumnya laju pendinginan yang dipakai adalah 0,30 – 0,50C/menit misalnya untuk embrio somatik tanaman ubi kayu. Namum bagian tanaman tertentu ada yang memerlukan laju 10 – 30C/menit, seperti pada tanaman Atropa, Nicotiana dan
Petunia. Sedangkan pada Secle sereale laju pendinginan di atas 30
Pengembangan metode kriopreservasi pada dasarnya memiliki tujuan mekanisme yang sama yaitu terjadinya dehidrasi osmotik dari sel sebelum penyimpanan dalam nitrogen cair dan melindungi sel terhadap pengaruh-pengaruh merugikan dari toksisitas kimia dan pembekuan intraseluler. Berdasarkan prosedur pendinginan dan konsentrasi krioprotektan yang digunakan, dikenal
C merupakan laju pendinginan yang kritis (Fitriyatmi, 1996).
metode konvensional dengan pembekuan lambat dan pembekuan cepat (Khoirinaya, 2011).
Suhu penyimpanan benih terdiri dari dua bagian yaitu suhu di atas titik beku dan suhu di bawah titik beku. Semakin rendah suhu penyimpanan, semakin lambat penurunan daya hidup benih. Suhu optimum untuk penyimpanan benih tertentu jangka panjang terletak antara -180 – 00C, walaupun banyak yang berpendapat bahwa penyimpanan pada suhu tersebut adalah jangka menengah, sedangkan untuk jangka panjang adalah pada suhu -1960
Metode konvensional membutuhkan biaya yang relatif mahal karena menggunakan mesin pendingin. Laju pendinginan yang lambat menyebabkan tingginya peluang terbentuknya kristal es yang bersifat letal bagi sel. Terbentuknya kristal es intraselular dapat menyebabkan kerusakan membran, organel sel dan hilangnya kemampuan embrio untuk tumbuh setelah proses pembekuan. Kunci keberhasilan tidak terlepas dari pengoptimalan masing-masing tahap prosedur yang digunakan dalam hubungannya dengan ukuran, permeabilitas, dan sifat fisiologi awal sel tersebut. Dengan demikian keseluruhan prosedur tersebut dapat mempertahankan sel (Khoirinaya, 2011).
C (Fitriyatmi, 1996).
Lingkungan penyimpanan yang mempengaruhi benih yaitu suhu, kelembaban udara, cahaya dan komposisi gas di dalam ruang simpan. Salah satu kaidah yang dikemukakannya untuk penyimpanan benih adalah setiap penurunan suhu ruang simpan sebesar 50C maka umur benih dapat diperpanjang menjadi dua kalinya. Kaidah ini hanya berlaku pada kisaran 0 – 500C. Kondisi tempat penyimpanan sumber daya genetik tergantung kepada spesies yang akan disimpan dan periode penyimpanan yang diinginkan. Banyak penelitian yang telah di
publikasikan menunjukkan penggunaan suhu di bawah titik beku merupakan yang terbaik untuk menyimpan benih (Fitriyatmi, 1996).
Krioprotektan
Selama pembekuan dan pelelehan, sel dapat mengalami kerusakan sebagai akibat dari eksponsur bahan tanaman pada suhu rendah, formasi kristal es, sel terdehidrasi, dan formasi radikal bebas. Eksponsur pada suhu rendah dapat menyebabkan inaktivasi protein yang sensitif terhadap suhu dingin. Sebagian besar formasi es ekstraselular. Namun demikian, formasi es ekstraselular juga dapat merusak sel karena daya mekanis dari kristal es yang tumbuh, gaya adesi kristal es terhadap membran, interaksi elektris yang disebabkan oleh perbedaan solubilitas ion pada fase es dan cair, formasi gelembung udara intraselular, luka khemis yang berhubungan dengan peroksidase lipid dan perubahan pH pada lokasi tertentu (Roostika dan Mariska, 2003).
Penambahan krioprotektan dapat memelihara keutuhan membran dan meningkatkan potensial osmotik media sehingga cairan di dalam sel mengalir keluar dan terjadi dehidrasi. Krioprotektan yang umum digunakan adalah DMSO, gliserol, PEG, sorbitol, dan manitol. Senyawa dalam krioprotektan dapat dipisah menjadi dua yaitu senyawa yang dapat masuk ke dalam sel (permeating agent) seperti DMSO, gliserol (pada suhu tertentu) dan yang tidak masuk ke dalam sel
(non permeating agent) seperti sukrosa dan gula alkohol (manitol, sorbitol) (Windiastika, 2013). Pada penelitian Fitriyatmi (1996) di lakukan perendaman
krioprotektan selama 2 jam, karena pada waktu perendaman tersebut larutan krioprotektan dapat masuk ke dalam sel secara optimal.
Krioprotektan yang dapat menembus dinding sel (intraseluler) berfungsi memberikan perlindungan yang lebih baik pada laju pendinginan yang lambat, misalnya DMSO, etilen glikol (EG), dan gliserol. Penggunaan DMSO dan gliserol merupakan yang terbaik. Gliserol akan berdifusi menembus dan memasuki sel dan dapat dipakai sebagai aktivitas metabolisme oksidatif. Gliserol yang memasuki sel akan menggantikan sebagian air yang bebas dan mendesak ke luar elektrolit-elektrolit, menurunkan konsentrasi intraselular elektrolit-elektrolit tersebut dan mengurangi daya rusak terhadap sel tersebut (Handayani, 2004).
Penggunaan krioprotektan pada penyimpanan dengan suhu rendah ditunjukan untuk mengurangi kerusakan akibat terbentuknya kristal-kristal es. Krioprotektan yang digunakan harus memiliki sifat-sifat mencegah air, menjadi pelarut bagi elektrolit, memiliki sifat dapat masuk ke dalam sel dengan cepat dan tidak beracun. Beberapa bahan yang dapat digunakan sebagai krioprotektan adalah gliserol, dimethyl sulfoxide (DMSO), dan lain-lain. Fungsi utama krioprotektan pada suhu rendah adalah memasuki sel sehingga terjadi keseimbangan dengan es ekstraseluler pada suhu dibawah titik beku (Fitriyatmi,1996).
Untuk melindungi tanaman dari pengaruh negatif pada saat pembekuan diperlukan kondisi sel yang mengalami dehidrasi. Kondisi dehidrasi yang optimal dapat dicapai dengan menggunakan larutan krioprotektan pada jenis, konsentrasi, dan lama perendaman yang sesuai. Krioprotektan yang baik digunakan adalah yang dapat melindungi jaringan selama pembekuan tanpa bersifat toksik terhadap jaringan itu sendiri. (Roostika dan Mariska, 2003).
Penggunaan krioprotektan diharapkan dapat melindungi benih dari suhu rendah. Konsentrasi krioprotektan pada masing-masing benih berbeda-beda. Penggunaan konsentrasi krioprotektan yang tepat dapat melindungi benih dan menghasilkan daya berkecambah benih yang lebih baik. Penggunaan krioprotektan saat ini makin disukai karena penggunaannya pada material atau bahan penyimpanan telah menunjukkan hasil yang memuaskan. Konsentrasi optimal tergantung spesies, tetapi umumnya menggunakan 10 – 15 % seperti pada embrio somatik ketela pohon dengan perendaman krioprotektan dan di rendam dalam nitrogen cair (Fitriyatmi, 1996).
Teknik kriopreservasi pada berbagai sel, jaringan, dan organ telah banyak dilakukan, demikian juga dengan kriopreservasi embrio. Salah satu cara penyediaan embrio yang telah banyak dilakukan adalah pengawetan dengan metode freezing atau pembekuan melalui slow freezing, rapid freezing, dan ultra rapid freezing. Secara teknis, metode vitrifikasi dapat memperkecil kerusakan sel embrio akibat kristal es ekstraseluler, yang dilakukan bahwa setelah dilakukan pengamatan terhadap embrio dari beberapa spesies, metode vitrivikasi dapat mengurangi kerusakan akibat pembekuan karena suhu kritis dapat dilampaui sangat cepat (Pancaningtyas, 2013).
Sel yang terdehidrasi terlalu kuat dapat mengalami plasmolisis yang kuat pula sehingga berakibat terhadap perubahan pH, interaksi mikromolekuler, dan peningkatan konsentrasi zat elektrolit. Pada saat pelelehan, kontraksi osmotik dapat menyebabkan endositotik vesikulasi irreversibel yang mengakibatkan sel lisis karena bahan membran yang baru tidak mampu memfasilitasi deplasmolisis. Formasi radikal bebas juga dapat menyebabkan kerusakan sel. Radikal bebas yang
dapat terbentuk misalnya radikal hidroksil (OH), superoksida (O2), dan hidrogen peroksida (H2O2). Radikal bebas dapat merusak fraksi lipid pada membran dan menghasilkan lipid peroksida dan selanjutnya terurai menjadi senyawa produk oksidasi sekunder yang toksik (Windiastika, 2013).
Untuk melindungi tanaman dari pengaruh negatif pada saat pembekuan diperlukan kondisi sel yang mengalami dehidrasi. Kondisi dehidrasi yang optimal dapat dicapai dengan menggunakan larutan krioprotektan pada jenis, konsentrasi, dan lama perendaman yang sesuai. Krioprotektan yang baik digunakan adalah yang dapat melindungi jaringan selama pembekuan tanpa bersifat toksik terhadap jaringan itu sendiri. Krioprotektan yang dapat digunakan untuk kriopreservasi adalah (1) PVS1 (gliserol 22% + propilen glikol 13% + etilen glikol 13% + DMSO 6% dalam media dasar dengan sukrosa 3%), (2) PVS2 (gliserol 30% + etilen glikol 15% + DMSO 15% dalam media dasar dengan sukrosa 0,4 M), (3) PVS3 (gliserol 50% dalam media dasar dengan sukrosa 50%), dan (4) PVS4 (gliserol 35% + etilen glikol 20% dalam media dasar dengan sukrosa 0,6 M) (Roostika dan Mariska, 2003).
Viabilitas Benih
Mutu benih yang baik merupakan dasar produktivitas pertanian yang lebih baik. Kondisi sebelum, selama dan sesudah panen menentukan mutu benih walaupun mutu benih yang dihasilkan baik, penanganan yang kurang baik akan menyebabkan mutu langsung menurun (Hasanah, 2002).
Viabilitas potensial adalah viabilitas benih pada kondisi optimum yang secara potensial mampu menghasilkan tanaman normal. Viabilitas potensial
ditetapkan dengan menggunakan tolak ukur daya berkecambah benih (Sadjad, 1994).
Berdasarkan pada kondisi lingkungan pengujian viabilitas benih dapat dikelompokkan ke dalam viabilitas benih dalam kondisi lingkungan sesuai (favourable) dan viabilitas benih dalam kondisi lingkungan tidak sesuai (unfavourable). Pengujian viabilitas benih dalam kondisi lingkungan tidak sesuai termasuk kedalam pengujian vigor benih. Perlakuan dengan kondisi lingkungan sesuai sebelum benih dikecambahkan tergolong untuk menduga parameter vigor daya simpan benih sedangkan jika kondisi lingkungan tidak sesuai diberikan selama pengecambahan benih maka tergolong dalam pengujian untuk menduga parameter vigor kekuatan tumbuh benih (Mugnisjah dkk., 1994).
Viabilitas benih atau daya hidup benih dicerminkan oleh dua informasi masing – masing daya kecambah dan kekuatan tumbuh dapat ditunjukkan melalui gejala metabolisme benih dan atau gejala pertumbuhan. Uji viabilitas benih dapat dilakukan secara tidak langsung, misalnya dengan mengukur gejala – gejala metabolisme ataupun secara langsung dengan mengamati dan membandingkan unsur – unsur tumbuh penting dari benih dalam suatu periode tertentu. Struktur pertumbuhan yang dinilai terdiri dari akar, batang, daun dan daun lembaga. Harga tengah antara kedua nilai pengujian di laboratorium tersebut akan menjadi nilai tumbuh di lapangan (Sutopo, 1998).
Mutu fisiologi adalah mutu benih yang ditentukan oleh daya hidup (viabilitas) benih sehingga mampu menghasilkan tanaman yang normal. Klasifikasi mutu benih didasarkan pada kinerja fisik seperti kebersihan, kesegaran butiran serta keutuhan keadaan kulit benih tanpa ada luka atau retak-retak.
Kondisi lingkungan baik sebelum maupun sesudah masak fisiologi dapat mempengaruhi mutu benih. Pada saat masak fisiologi, benih memiliki berat kering maksimum serta viabilitas dan vigor yang paling tinggi. Pada benih jambu mete menunjukkan bahwa benih yang dipanen pada saat masak fisiologis (42 hari setelah antesis) mempunyai daya berkecambah 100% namun apabila benih dipanen 3 hari setelah masak fisiologis, daya berkecambah menurun dengan cepat sampai 46,60% (Hasanah, 2002).
Pertumbuhan kecambah setelah periode tertentu merupakan hasil waktu yang diperlukan untuk kecambah yakni pertumbuhan awal dan laju pertumbuhan berikutnya. Kecambah tersebut dengan waktu dan tidak dapat diekspresikan dengan mudah untuk jumlah kecambah yang banyak. Uji pertumbuhan kecambah sesuai dilakukan untuk spesies tanaman yang menghasilkan plumula yang lurus atau akar yang lurus (Mugnisjah, dkk., 1994).
Daya kecambah benih memberikan informasi kepada pemakai benih akan kemampuan benih tumbuh normal menjadi tanaman yang wajar dalam keadaan biofisik lapangan yang serba optimum. Parameter yang digunakan dapat berupa persentase kecambah normal berdasarkan penilaian terhadap struktur embrio yang diamati secara langsung atau tidak langsung dengan hanya melihat gejala metabolisme benih yang berkaitan dengan kehidupan benih (Sutopo, 1998).
Biasanya benih diuji daya kecambah dan viabilitasnya di laboratorium yang dilengkapi dengan alat dan para pekerja untuk menentukan mutu benihnya. Pada uji daya kecambah, benih dikatakan berkecambah bila dapat menghasilkan kecambah dengan bagian-bagian yang normal atau mendekati normal. Ada suatu pengujian viabilitas yang bertujuan untuk mengetahui dengan cepat semua benih
yang hidup, baik dorman maupun tidak dorman yaitu dengan pengirisan bagian embrio benih dan uji tetrazolium (Justice dan Bass, 1994).
Daya berkecambah benih erat hubungannya dengan tingkat kematangan benih. Daya berkecambah benih akan meningkat dengan bertambah matangnya benih dan mencapai perkecambahan maksimum jauh sebelum masak fisiologis atau bobot kering maksimum tercapai sampai masak fisiologis tercapai, perkecambahan maksimum (100 %) ini konstan, tetapi sesudah itu akan menurun dengan kecepatan yang sesuai dengan keadaan yang tidak menguntungkan di lapangan dan semakin keadaan di lapangan tidak menguntungkan maka semakin cepat penurunan daya kecambah benih (Tim Pengampu, 2011).
