PEMBUATAN DAN PENYIMPANAN STABILAT
TRYPANOSOMA EVANSI DALAM NITROGEN CAIR
FESTA POLITEDY
Balai Penelitian Veteriner, Jl.RE Martadinata No.30, P O Box 30 Bogor RINGKASAN
Surra adalah penyakit parasit darah, yang disebabkan oleh protozoa Trypanosoma evansi dan ditularkan melalui gigitan lalat penghisap darah. Hampir semua hewan berdarah panas, kecuali golongan unggas, dapat ditulari oleh parasit ini. Kuda, anjing dan unta yang terinfeksi Surra akan berakhir dengan kematian, akan tetapi sapi dan kerbau biasanya mempunyai angka mortalitas yang rendah. Walaupun demikian, wabah Surra pada sapi dan kerbau dapat terjadi secara mendadak dan mempunyai dampak ekonomi yang sangat merugikan. Sejak tahun 1983, laboratorium Parasitologi Balitvet, dipromosikan sebagai laboratorium referen, koleksi T. evansi bertaraf internasional, yang mempunyai 319 isolate berasal dari bebagai daerah di Indonesia. Oleh karena itu, proses pembuatan stabilate, penyimpanan, perawatan dan dokumentasi data harus mengikuti standard internasional yang berlaku. Koleksi isolat T.
evansi tertua berasal dari Rumah Potong Hewan Bogor tahun 1975 dan koleksi yang termuda berasal dari
Sumbawa besar tahun 1999. Isolate T. evansi yang disimpan dalam nitrogen cair di laboratorium Balitvet Bogor, mampu bertahan hidup selama 19 tahun 1 bulan.
Kata kunci : Trypanosoma evansi, stabilat, Nitrogen cair.
PENDAHULUAN
Surra adalah penyakit parasit darah yang disebabkan oleh Trypanosoma evansi, yang ditularkan melalui gigitan lalat penghisap darah. Hampir semua hewan berdarah panas kecuali golongan unggas, rentan terhadap penyakit ini, namun respon kekebalan bervariasi terutama pada sapi dan kerbau. Infeksi T. evansi pada kuda, unta dan anjing menyebabkan angka kematian yang tinggi, apabila tidak segera diobati dan sebaliknya pada sapi dan kerbau cukup rendah. wabah Surra masih terjadi terutama di pulau Jawa dan Madura (Rukmana 1979; Soulsby, 1982 ; Sukanto, 1988). Penyebaran penyakit Surra hampir di seluruh wilayah Indonesia dan lalat jenis Tabanus merupakan vektor utamanya, dimana T. evansi dapat bertahan hidup di dalam rongga mulutnya selama 30 menit hingga 6 jam serta mampu menularkan penyakit dalam radius yang cukup luas, sehingga penyakit ini mempunyai arti penting bagi industri peternakan di Indonesia (Adiwinata & Dachlan ,1969; Nieschulz, 1930).
Pada awalnya, Balitvet memelihara beberapa isolat T. evansi pada Cavia, namun banyak kegagalan, yaitu cavianya mati sebelum isolatnya dipindahkan ke hewan percobaan lain. Kerjasama antara Balitvet, James Cook University (Australia) dan Center of Tropical and Veterinary Medicine, Edinburgh University (UK) pada 1983, laboratorium Balitvet dipromosikan menjadi laboratorium referen T. evansi bertaraf internasional, sejajar dengan laboratorium serupa yang ada di Afrika dan Eropa. Sejak saat itu, teknik kriopreservasi, dokumentasi dan perawatan rutin terhadap stabilat mengikuti standard WHO, dengan mengadakan training bagi staff dan teknisi Balitvet (Luckins, 1983). Pada saat ini, telah tersimpan sebanyak 319 isolat T. evansi dalam nitrogen cair , yang berasal dari 34 kota/kabupaten dari 12 provinsi di Indonesia.
27
Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan
BAHAN DAN CARA Bahan dan Alat
Glycerol (sigma), larutan heparin dalam PBS pH7,2 (mengandung heparin 100 IU/ml), asam pikrat dalam aseton, diaethyl Ether pa., kapas dalam toples tertutup, tabung plastik (NUNC) 4,5 ml yang bawahnya sudah dilubangi, tabung kapiler haematocrit (assistent), crystoseal, Mikroskop, timbangan elektrik, gelas objek, gelas penutup, spuit 1 ml, bunsen, sentrifus mikohematrokrit (12000 rpm), freezer (-20 oC dan –70 oC), tangki yang berisi nitrogen
cair, mencit dan pakan. Cara Kerja
Penyiapan dan Perbanyakan Isolasi T. evansi dari Lapangan
Darah hewan tersangka (sapi/kerbau) diambil dengan venoject (EDTA) lewat vena jugularis, beri identitas seperlunya pada masing-masing sampel darah dan disimpan dalam “IGLO” berisi es batu. Sampel darah tersebut harus dilakukan pemeriksaan MHCT kurang dari 24 jam setelah pengambilan dan hasil yang positive T. evansi dipisahkan (Siswansyah dkk, 1987 dan Woo, 1970).
Darah dalam venoject yang mengandung T. evansi dihomogenkan dengan alat vortek, kemudian diambil sebanyak 0,25-0,50 ml untuk disuntikan pada mencit secara intraperitonial dan mencit ditandai dengan larutan asam pikrat serta dicatat dalam buku monitoring (Lumsden et al,1968). Mencit diperiksa di laboratorium selama 35 hari dengan interval pemeriksaan setiap 2 hari sekali. Pemeriksaan mencit dilakukan dengan cara bagian ujung ekor diambil darahnya, lalu ditempelkan pada gelas penutup dan diletakkan pada objek glas. Biasanya T. evansi dapat terdeteksi pada umur 3-7 hari pasca infeksi. Mencit dinyatakan negatif surra setelah dimonitoring selama 35 hari hasilnya tetap negative.
Pembuatan Stabilat T. evansi di Laboratorium
Pembuatan stabilat sebaiknya menggunakan darah mencit terinfeksi yang parasitamia dalam keadaan meningkat (berkisar 100 T. evansi per lapangan pandang, pembesaran 400x). Mencit dibius dengan ether dalam toples, setelah mencit pingsan diterlentangkan pada sebidang gabus kemudian darahnya diambil 1 ml langsung dari jantung dengan spuit 1 ml yang telah berisi 0,1 ml larutan heparin di dalamnya. Darah yang mengandung T. evansi kemudian dipindahkan ke dalam tabung reaksi yang sudah ditempatkan di dalam gelas beker yang berisi es batu. Darah yang terkumpul kemudian diukur volumenya dan ditambahkan glycerol dengan konsentrasi akhir 7,5% v/v. Darah dan gliserol dihomogenkan menggunakan spuit 1 ml kemudian dimasukkan ke dalam beberapa tabung hematokrit yang diletakan secara berjajar pada alat penyangganya. Masing-masing tabung hematokrit diisi darah sebanyak sepertiga bagian dari panjang tabung dan alat penyangga dimiringkan sedikit untuk memudahkan waktu pengisian. Alat penyangga di gerak-gerakan agar darah berada di tengah tabung kapiler, kemudian masing-masing ujung kapiler dipanaskan di atas nyala api bunsen agar tertutup rapat. Masing-masing kapiler digerakkan secara vertikal untuk menyakinkan bahwa kedua ujung kapiler bena-benar tertutup rapat (darah tetap pada posisinya). Segera setelah proses pemanasan
selesai, hasilnya diperiksa di bawah mikroskop (400X) secara natif untuk mengetahui dampak pemanasan terhadap motilitas dan jumlah T. evansi hidup. Tabung kapiler di masukkan ke dalam tabung plastik (Nunc, 4,5 ml) yang sudah diberi nomor identitas tabung dan secarik karton di dalamnya bertuliskan nomer Isolat dan nomer Bakit.
Proses pendinginan secara bertahap, mula mula dalam freezer suhu –20oC selama 3 jam, kemudian dipindahkan dalam “feezer” suhu –70oC semalam dan keesokan harinya dipindahkan ke dalam nitrogen cair (suhu –196oC). Pada setiap tahapan pendinginan dilakukan pemeriksaan jumlah T. evansi hidup dan motilitasnya secara native, hal ini untuk memastikan bahwa stabilat yang di simpan harus dalam keadaan baik. Masing-masing tabung NUNC yang berisi masing-masing isolat T. evansi dijepitkan pada holdernya, beberapa holder diletakkan di dalam sebuah cane kemudian masing-masing cane dimasukkan ke dalam container yang berisi nitrogen cair, sesuai dengan nomer posisinya dalam container (posisi stabilat dalam container harus sesuai dengan catatan kartu indentitas)
Pencatatan Kartu Identitas Masing-Masing Isolat T. evansi
Kartu identitas stabilat sangat penting berisi semua informasi secara detail: antara lain jenis hewan tersangka, lokasi dan tanggal pengambilan sampel, nomer isolat, kode dan lama infeksi pada mencit, tanggal dan metoda pembuatan stabilat, catatan tentang motilitas, morphologi dan jumlah T. evansi secara individual, posisi stabilat dalam tangki, nomer bakit, tanggal pengambilan kapiler dan kegunaan masing-masing.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Sebanyak 319 isolat T. evansi asal berbagai daerah di Indonesia telah tersimpan dalam tangki nitrogen cair , dalam bentuk “Bank Stabilat T. evansi“ di laboratorium Parasitologi Balitvet-Bogor (Tabel 1). Koleksi isolat berasal dari 12 provinsi yaitu Nangroe Aceh Darussalam, Sumatera Utara, Lampung, Kalimantan Selatan, Jawa Barat, Jawa Tengah, Jawa Timur, DI Yogyakarta, NTB, NTT, Sulawesi Utara dan Sulawesi Selatan.
Daya tahan hidup T. evansi yang disimpan dalam tangki nitrogen cair dapat dilihat pada Tabel 2. Isolat 345 asal Garut dapat bertahan hidup setelah disimpan selama 4 tahun 6 bulan, isolat 287 asal Pemalang bertahan hidup selama 6 tahun 7 bulan, isolat 78 asal Pidie bertahan hidup selama 16 tahun 1 bulan dan isolat 36 asal Minahasa bertahan hidup selama 19 tahun 1 bulan.
Hasil pencatatan data stabilat dan letak posisinya dalam tangki nitrogen cair dapat dilihat Tabel 3. Contoh isolat nomer 36 asal Minahasa, mempunyai 3 nomer bakit, masing-masing: B149 dibuat tanggal 9 April 1984 terletak pada tangki nomer 1 posisi 7 dengan nomer box 156 dan 157 (habis); B665 dibuat tanggal 28 Mei 2003 terletak pada tangki 3 posisi 3 dengan nomer box 650 dan B670 dibuat tanggal 5 Agustus 2003 terletak pada tangki 3 posisi 2 dengan nomer box 156.
Perawatan stabilat meliputi: monitoring level nitrogen cair dalam tangki, penambahan nitrogen bila levelnya rendah, monitoring kwalitas stabilat dalam periode tertentu, pembuatan stabilat baru bila mendapat isolat baru dan Bakit baru bila kwalitas stabilat kurang baik ataupun kapilernya hampir habis.
29
Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan
Kegunaan stabilat meliputi: Pembuatan bahan-bahan biologik (serum kebal, antigen), penelitian obat Surra, keperluan penelitian perguruan tinggi maupun instansi tertentu (Pulse Field Gel Electroporesis, Uji patogenitas, Elisa, PCR, Resistensi obat, Immuno-lisis).
Isolat T evansi yang diisolasi pada tanggal 18/02/1975 (Isolat 02, Bakit 28) berasal dari Rumah Potong Hewan Bogor, merupakan isolat tertua yang masih disimpan hidup di laboratorium Balitvet dan sebaliknya isolat 367 Bakit 648 yang diisolasi 16/07/1999 asal Sumbawa Besar, merupakan isolat yang termuda sampai saat ini.
Penyimpanan masing-masing isolat sebaiknya diletakkan pada 2 tangki yang berbeda, untuk menghindari hilangnya isolat tersebut karena pecahnya kapiler, jatuhnya tabung NUNC ke dasar tangki atau kurangnya isi nitrogen cair karena tangki bocor.
Mutu stabilat ditentukan oleh banyaknya individu T. evansi yang masih hidup selama penyimpanan dan bergerak aktif serta mampu menginfeksi hewan percobaan, oleh karena itu pada proses pembuatan stabilat diusahakan memakai darah segar yang terinfeksi tidak lebih dari 24 jam pasca pengambilan darah. Menurut Siswansyah et al (1987), penyimpanan darah yang terinfeksi T. evansi lebih dari 24 jam pada temperatur dingin akan kehilangan daya patogenitasnya (organisme Trypanosoma masih hidup akan tetapi tidak mampu berkembang biak dalam tubuh hewan percobaan)
KESIMPULAN
Sebanyak 319 isolat T. evansi asal berbagai daerah di Indonesia telah tersimpan dalam keadaan beku (nitrogen cair) di laboratorium Balitvet, Koleksi isolat T. evansi tertua tahun 1975 dan yang termuda tahun 1999.
Kelangsungan hidup Trypanosoma yang disimpan dalam nitrogen cair dapat mencapai umur penyimpanan 19 tahun 1 bulan asal proses pembuatan dan perawatannya memadai, dan sebaliknya penyimpanan pada hewan percobaan waktunya singkat dan banyak pasase serta mudah kehilangan isolat.
Balitvet sejak tahun 1983 berfungsi sebagai laboratorium referen Bank T. evansi bertaraf internasional, juga berfungsi untuk memenuhi kebutuhan penelitian dalam negeri, baik untuk instansi pemerintah maupun perguruan tinggi di Indonesia.
Semua data dari masing-masing isolat dicatat secara detail dalam masing-masing record sheet dan biasanya setiap isolat mempunya satu Nomer Isolat dan beberapa Nomer Bakit. Semakin sering isolat tersebut dipakai dalam penelitian maka semakin banyak Nomer bakit yang digunakan.
SARAN
Pengecekan level nitrogen dan pengisian nitrogen cair ke dalam tangki harus dilakukan secara rutin, agar tangki selalu penuh.
Monitoring stabilat harus dilakukan dengan interval tertentu (sesuai kebutuhan). Bilamana jumlah kapilernya tinggal sedikit ataupun kwalitas stabilat menurun, isolatnya perlu diperbanyak lalu dibuatkan “Nomer Bakit” yang baru. Disarankan menggunakan google
pelindung mata kita pada saat monitoring stabilat karena tabung kapiler terbuat dari bahan kaca dan mudah pecah disebabkan oleh perbedaan temperatur secara tiba tiba.
Masing-masing isolat sebaiknya punya duplikasi dan disimpan dalam tangki nitrogen yang berbeda, hal ini untuk menghindari resiko kecelakaan/hilangnya isolat (pecah kapiler, jatuh kedalam tangki ataupun kehabisan nitrogen cair karena bocor).
Pada proses pembuatan stabilat, disarankan menggunakan darah infeksi sesegar mungkin, tidak lebih dari 24 jam pasca pengambilan darah.
UCAPAN TERIMA KASIH
Pada kesempatan ini, penulis mengucapkan banyak terima kasih kepada Drh Amir Husein dan Dr. Sri Muharsini atas segala bimbingan dan sarannya selama penulisan makalah ini, sehingga dapat terselesaikan dengan baik. Ucapan terima kasih juga ditunjukan kepada Dr Luckins dan Dr Sutijono Partoutomo, yang telah memberi kesempatan mengikuti “training pembuatan stabilat” T. evansi pada tahun 1983.
DAFTAR BACAAN
Adiwinata.T and A. Dachlan. (1969). A brief on Surra in Indonesia. ELVEKA. Fol.Vet. 3:11-15
Luckins (1983) Cryopresevation of Trypanosoma evansi from Blood an Infected Rodent, In: Report on Development of serological Assays for studies on Trypanosomiasis of livestock in Indonesia. CTVM, Edinburgh. pp 33 – 37.
Lumsden WHR and Wells EA (1968). Trypanosomiasis. In: D Weinman and M Ristic (Eds).Infectious diseases of Man and Animals.Diseases caused by Protista.Vol II. The Pathogens, the Infections and the Consequenses. Academic Press, New York. pp. 329-385.
Nieschulz.D.193. Surraubertragung versuche auf java and Sumatra veeartsenijkundige Mededeeling Departemen van Lanbbouw, nijverheid en Handle Nederlansh – Indie (Nr.75).Utrecht : Kemmink en zoon N.V.
Rukmana, MP. 1979. Metoda mikrohematrocit sebagai teknologi baru, diagnosa [THESIS]. Universitas Padjadjaran, Bandung. 356 halaman.
Siswansyah DD., Dahlan M. and Payane R.C (1987). Survival time of T. evansi in samples of
blood taken from infected buffaloes. Penyakit Hewan XIX (33) :24 – 25
Soulsby Ejl (1982). Helminths, Arthropods and Protozoa of Domesticated Animals. 7th Ed. Bailliere
Tindall, London. Pp.809
Sukanto IP, Payne RC dan Graydon R (1988). Trypanosomiasis di Madura: Surai Parasitologik dan Serologik. Penyakit Hewan. 20: 85-87
Woo PTK (1970). Evaluation of the haematocrit centrifuge and other techniques for field diagnosis of human trypanosomiasis and filariasis. Can. J. Zoo. 47: 921-923
31
Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan Lampiran :
Tabel 1: Koleksi Isolat T. evansi asal 12 Provinsi, yang disimpan di Balitvet.
Provinsi Kota / Kabupaten asal Isolat Jumlah Isolat
NAD Pidie 1
Sumut Asahan 39
Lampung Lampung Selatan dan Metro 37
Kalsel Amuntai Tengah dan Banjarbaru 2
Jabar. Bekasi, Bogor, Garut, Karawang, Sukabumi dan Tasik 38
Jateng. Batang, Blora, Brebes, Demak, Pekalongan, Pemalang, Purworejo, Semarang dan Tegal
124
Jatim Bangkalan, Banyuwangi, Magetan dan Tuban 45
D.I.Y. Bantul, Kulon Progo dan Sleman 8
NTB Sumbawa Besar 16
NTT Sumba 1
Sulut Bolaangmongondo, Enrekang dan Minahasa 6
Sulsel Gowa 2
12 Provinsi 34 kota / kabupaten asal Isolat 319 Isolat
Tabel 2: Daya tahan hidup beberapa Isolat yang disimpan dalam N2 Cair No.
Isolat & asal isolat Tgl. koleksi Tgl. pembuatan & No. Bakit pengecekan Tgl. Tgl. pembuatan ulang, No Bakit Lama simpan 345 27/10/1998,Garut 02/11/1998, B626 24/05/2003 28/05/03, B667 4 th 6 bl 287 17/09/1996 Pemalang 18/10/1996, B567 24/05/2003 28/05/03, B664 6 th 7 bl 78 18/09/1986,Pidie 22/04/1987, B314 24/05/2003 28/05/03, B666 16 th 1 bl 36 23/03/1984 Minahasa 09/04/1984, B149 24/05/2003 28/05/03, B665 19 th 1 bl
