PENGHAMBATAN PELEPASAN ENZIM -HEXOAMINIDASE DARI SEL MAST OLEH ZEORIN, SENYAWA DARI AEGLA MARMELOS CORREA

PENGHAMBATAN PELEPASAN ENZIM

-HEXOAMINIDASE DARI SEL

MAST OLEH ZEORIN, SENYAWA DARI AEGLA MARMELOS CORREA

Agung Endro Nugroho

1

, Sugeng Riyanto

2

, Mohd. Aspollah Hj. Sukari

3

, dan

Kazutaka Maeyama

4

1

Department of Pharmacology and Clinical Pharmacy, Faculty of Pharmacy,

Gadjah Mada University, Indonesia,

2

Department of Pharmaceutical Chemistry, Faculty of Pharmacy, Gadjah Mada

University, Indonesia,

3

Faculty of Science and Environmental Studies, Universiti Putra Malaysia

4

_{Department of Pharmacology, Informational Biomedicine, Ehime University}

Graduate School of Medicine, Shitsugawa , Toon-shi, Ehime 791-0295, Japan

E-mail: agungendronugroho@yahoo.com

ABSTRACT

Zeorin or 6,22-Dihydroxyhopane is a compound isolated from Aegle marmelos Correa collected in Yogyakarta Indonesia. The molecular structure was confirmed in Universiti Putra Malaysia. This compound was obtained from petroleum ether extract of the leaves of Aegle marmelos Correa. In present study, we investigated the effects of zeorin on the -hexoaminidase enzyme release from mast cell culture. The experiment was performed by using rat basophilic leukemia (RBL-2H3) cell line, a tumor analog of mast cells. DNP24-BSA and thapsigargin were used as immunologic and

non-immunologic inducers for-hexoaminidase enzyme release from mast cells, respectively. The release of -hexoaminidase enzyme was determined by using colorimetric methods with an enzyme substrate, p-nitrofenil-2-Acetamido-2-deoksi--D-gluko-piranosida, and a microplate reader at 405 nm. In this study, treatment of 20 ng/mL DNP24-BSA and 0.5M

thapsigargin could stimulate the release of-hexoaminidase enzyme from RBL-2H3 cells by 25.421.62 % and 33.163.72 %, respectively. Zeorin showed potent inhibitory effects on the -hexoaminidase enzyme release, when the release induced by DNP24-BSA. In

contrast, zeorin show weak inhibitory effects, when the-hexoaminidase enzyme release from RBL-2H3 cells induced by a Ca2+stimulant, thapsigargin. The IC50values ofzeorin’s

effects on DNP24-BSA and thapsigargin experiments were 33,71 M and >100 M,

respectively. Based on the results, the inhibitory effect of zeorin on the -hexoaminidase enzyme release from RBL-2H3 cells involving mechanisms related to the interaction of IgE on the mast cell surface or intracellular signal transductions involved in mast cell degranulation.

Keywords : Aegle marmelos Correa, zeorin, sel mast,-hexoaminidase enzyme

PENDAHULUAN

Aegle marmelos Correa (familia Rutaceae) merupakan tanaman asli dan

tumbuh secara luas di daerah Asia Tenggara dan Asia Selatan. Di Asia Selatan,

tanaman tersebut disebut juga dengan nama Maja, Majapahit, Modjo, Bilak;

sedangkan di Asia Selatan disebut dengan nama Bael, Beli, Bergiri, Sirphal.

Tanaman tersebut secara meluas digunakan dalam pengobatan tradisional di

Asia Tenggara maupun Asia Selatan. Aegle marmelos Correa mempunyai

beberapa aktivitas farmakologi antara lain : antiproliferative, antiinflamasi,

antipiretik, analgesik, antifungal dll (Lampronti et al., 2003; Arul et al., 2005;

Upadhya et al., 2004; Rana et al., 1997). Dr. Sugeng Riyanto (2003) berhasil

mengisolasi beberapa senyawa dari tanaman tersebut yang diperoleh dari

daerah Yogyakarta, Indonesia. Senyawa tersebut antara lain aureptene,

epoksiaureptane, marmin, skimmianine, zeorin, dustanin, lupene-ol, lupene-on,

aegeline dll .

Enzim

-hexosaminidase merupakan suatu enzim lisosomal, dikenal juga

dengan nama

-N-asetilhexosaminidase (Hex, EC 3.2.1.52). Terdapat dua

isoenzim yaitu hex A, tersusun oleh subunit

dan ; dan hex B, tersusun hanya

oleh subunit

. Kedua isoenzim tersebut berbeda pada sifat keasaman, mobilitas

elektroforesis dan termostabilitas, sedangkan mempunyai kesamaan dalam berat

molekul, nilai Km, aktivitas penghambatan pada produk tertentu, maupun sifat

imunologinya (Casal et al., 2005; Mahuran, 1995). Kedua hexosaminidase

tersebut berfungsi katalisis proses hidrolisis dari asetilgalaktosamin atau

N-asetilglukosamin dari jembatan

-glikosidic. Dengan kata lain : hexosaminidase

lisosomal

mengkatalisis

hidrolisis

dari

gugus

N-asetilgalaktosamin

dari

ganglioside GM

2

[Cer-Glc-Gal (AcNeu)-GalNac]. Dalam hal ini, defisiensi dari

enzim hexosaminidase terutama hex A, akan mengakibatkan akumulasi

ganglioside GM

2

dalam beberapa jaringan, lebih lanjut bisa menimbulkan

penyakit lisosomal (GM

2

gangliosidosis) misalnya penyakit Tay-Sachs (TSD) dan

penyakit Sandhoff (Marinkovic dan Marinkovic, 1977). Adanya mutasi gen yang

menkode subunit

menyebabkan defisiensi isoenzim hex A pada penyakit

Tay-Sachs, dan mutasi gen yang menkode subunit

 sehingga menyebabkan

def

i

si

ensi

bai

k

hex

A

dan

B

pada

Sandhof

f

’

s

di

sease

(

Casal

et al., 2005). Enzim

hexosaminidase juga dijumpai pada sel mast bersama-sama dengan enzim

lainnnya:

asam

eksoglikosidase

dan

-glukuronidase. Sel mast akan

mensekresikan

enzim-enzim

tersebut

apabila

mendapatkan

pacuan

baik

imunologis maupun non-imunologis (Schwartz et al., 1979; Mahuran 1995).

Pada penelitian kali ini akan dipelajari pengaruh zeorin

(6,22-Dihidroksihopan) yang diisolasi dari Aegle marmelos Correa terhadap pelesapan

enzim

-hexosaminidase dari rat basophilc cell line yang diinduksi secara

imunologi. Antigen yang digunakan dalam proses imunologi tersebut adalah

dinitrophenylated bovine serum albumin (DNP

24

-BSA).

Gambar 1. Struktur kimia dari zeorin atau 6,22-dihidroksihopan

METODE PENELITIAN

Bahan uji utama yaitu zeorin yang diisolasi dari Aegle marmelos Correa

yang diperoleh dari daerah Yogyakarta, Indonesia. Penetapan struktur molekul

dari zeorin dilakukan di Faculty of Science and Environmental Studies, Universiti

Putra Malaysia. Isolasi dan penetapan struktur tersebut dikerjakan oleh Dr.

Sugeng Riyanto, Bagian Kimia Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah

Mada. Sebagai substrat bagi enzim hexosaminidase digunakan

p--nitrophenyl-2-Acetamido-2-deoxy-



-D-glucopyranocide (Wako Pure Chemical Co., Osaka

Japan). Sebagai antigen digunakan dinitrophenylated bovine serum albumin

(DNP

24

-BSA)

dari

Bethesda,

MD,

sedangkan

Ca

2+

stimulant

digunakan

thapsigargin (Sigma Chemical, USA). Monoclonal Imunoglobulin E diperoleh dari

Department of Pharmacology, School of Medicine, Ehime University. Bahan

lainnya adalah medium MEM and antibiotika (kombinasi natrium penisilin G dan

streptomisin sulfat) (Grand Island, NY), fetal calf serum (JRH Biosciences),

PIPES (Dosindo, Kumamoto Japan).

Preparasi rat basophilc cell line (RBL-2H3) dilakukan dengan cara sel line

RBL dikultur menggunakan medium MEM yang mengandung FCS dan

antibiotika ), diinkubasikan dalam inkubator suhu 37C dan CO

2

5%. Sel tersebut

ditumbuhkan dalam plate 24 sumuran dengan kepadatan sel 5 x 10

5

tiap

sumuran dengan volume medium 400

L tiap sumuran kemudian disensitisasi

2 1 3 4 5 6 7 9 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 24 25 26 10 8 27 29 28 30 OH 23 H

OH

dengan Monoklonal IgE. Sel diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator suhu

37C dan CO

2

5%. Setelah itu, sel dicuci dua kali dengan larutan dapar PIPES

500

L, kemudian dipreinkubasi dengan PIPES (sebagai kontrol) atau larutan

senyawa uji dalam PIPES (konsentrasi 1-100

M) sebanyak 180 L selama 10

menit pada suhu 37C. Kemudian, ditambahkan larutan penginduksi enzim

hexosaminidase, DNP

24

-BSA 200 ng/mL, sebanyak 20

l tiap sumuran untuk

kemudian diinkubasi pada suhu 37C selama 30 menit. Plate disentrifugasi

selama 5 menit dengan kecepatan 3000 rpm, dan supernatan sebanyak 50

l

dipindah ke tube 1,5 mL. Supernatan ditambahkan asam perklorat 3 % sebanyak

250

l, dan di-mixer. Kemudian, ditambahkan larutan KOH 2M/ KH

2

PO

4

1 M

sebanyak 30

l, dicampur kemudian disentrifugasi selama 15 menit dengan

kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4

C. Supernatan siap ditetapkan kadar enzim

hexoaminidasennya. Untuk penetapan total enzim hexosaminidase, sebanyak

350

llarutan dapar PIPES ditambahkan pada 6 sumuran, kemudian disonifikasi.

Larutan homogenat sel siap dilakukan penetapan enzim hexosaminidase.

Pada penetapan enzim



-hexosaminidase, supernatan sebanyak 50

L

diinkubasi dengan 2,5 mM p-nitrofenil-2-Acetamido-2-deoksi-



-D-glukopiranosida

100

L (dalam 50 mM larutan dapar natrium sitrat pH 4,5) selama 1 jam pada

suhu 37 C. Setelah itu, sebanyak 20

L 2M KOH/ 1 M KH

2

PO

4

ditambahkan

pada campuran larutan tersebut, kemudian aktivitas enzim



-hexosaminidase

ditetapkan menggunakan analisis kolorimetri dengan microplate reader pada

panjang gelombang 405 nm.

Semua data disajikan dalam bentuk mean

SEM. Analisis statistika

menggunakan Kruskal Wallis test, dilanjutkan dengan Mann Whitney test.

Tingkat kepercayaan yang digunakan adalah 95%.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari efek penghambatan enzim

-hexosaminidase oleh zeorin yang diisolasi dari Aegle marmelos Correa pada rat

basophilc cell line yang diinduksi secara imunologis menggunakan DNP

24

-BSA,

dan non-imunologis menggunakan thapsigargin. Dinitrophenylated bovine serum

albumin (DNP

24

-BSA) merupakan antigen spesifik terhadap antibodi monoklonal

IgE (Bottcher et al., 1980; Liu et al., 1980; Orida et al., 1983). DNP

-BSA

menstimulasi mediator dari sel mast dengan melakukan interaksi secara

cross-linking terhadap bagian karbohidrat molekul IgE yang terikat pada reseptor FcRI

receptors. Interaksi tersebut pada akhirnya akan merangsang serangkaian

proses signaling intraseluler dalam sel mast dan akhirnya mampu melepaskan

mediator dari sel tersebut (Dale et al., 1994; Metcalfe et al., 1997). Hasil

penelitian pengaruh zeorin terhadap pelepasan enzim

-hexosaminidase dari

kultur sel RBL-2H3 yang diinduksi antigen disajikan pada Gambar 2.

0 5 10 15 20 25 30 Control 1 10 100 Concentration H ex oa m in id as e En zy m e R el ea se (% )

Gambar 2. Histogram pengaruh zeorin terhadap pelepasan enzim

-hexosaminidase dari kultur sel RBL-2H3 yang diinduksi DNP

24

-BSA 20

ng/mL (* P<0.05 berbeda bermakna dbandingkan kontrol,

=tanpa antigen,



=dengan antigen)

Hasil percobaan yang ditunjukkan pada Gambar 2 menunjukkan bahwa

zeorin dapat menghambat pelepasan enzim

-hexosaminidase dari kultur sel

RBL-2H3 yang diinduksi antigen. Konsentrasi zeorin yang digunakan dalam

percobaan ini adalah 1, 10 dan 100

M. Pemberian zeorin 10 dan 100 M pada

kultur sel RBL-2H3 secara bermakna menghambat enzim

-hexosaminidase

berturut-turut sebesar 17,164,78% dan 54,405,01% dengan nilai IC

50

sebesar

33,71

M, hal tersebut dapat terlihat pada Tabel I. Semakin tinggi kosentrasi

zeorin, semakin besar pula efek penghambatannnya (dose-dependent manner).

Dalam hal ini, nilai IC

50

merupakan parameter potensi efek penghambatan zeorin

terhadap enzim tersebut.

*

*

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Control 1 10 100 Concentration H ex oa m in e En zy m e R el ea se (% )

Gambar 3. Histogram pengaruh zeorin terhadap pelepasan enzim

-hexosaminidase dari kultur sel RBL-2H3 yang diinduksi thapsigargin 0,5

M

(* P<0.05 berbeda bermakna dbandingkan kontrol,

=tanpa thapsigargin,



=dengan thapsigargin)

Thapsigargin merupakan senyawa sesquiterpen lacton yang diisolasi dari

tanaman Thapsia garginica. Senyawa ini merupakan penginduksi pelepasan

mediator dari sel mast melalui peningkatan ion kalsium intraseluler (Patkar et al.,

1979; Brayden et al., 1989). Pada percobaan kali ini, pemberian thapsigargin 0,5

M mampu menginduksi pelepasan mediator sel mast yaitu enzim

-hexosaminidase sebesar 33,163,72 %.

Pada Gambar 3, terlihat bahwa

pemberian zeorin pada konsentrasi 1

M justru meningkatkan pelepasan enzim

-hexosaminidase dari kultur sel RBL-2H3. Zeorin menunjukkan efek

penghambatan terhadap enzim tersebut secara bermakna pada konsentrasi 100

M yaitu sebesar 21,142,73%. Nilai ini dibandingkan pada percobaan

sebelumnya (DNP

24

-BSA) adalah lebih rendah pada konsentrasi zeorin yang

sama (100

M). Nilai IC

50

penghambatan enzim oleh zeorin adalah > 100

M, hal

tersebut dapat terlihat pada Tabel I.

Tabel I. Prosentase penghambatan enzim

-hexosaminidase dari kultur sel

RBL-2H3 oleh zeorin, beserta nilai IC

50

-nya.

Konsentrasi (M)

Prosentase penghambatan enzim

-hexosaminidase

Antigen DNP

24

-BSA

Thapsigargin

1

15,386,16

-9,0411,21

10

17,164,78

14,323,18

100

54,405,01

21,142.73

IC

50

33,71

M

> 100

M

Pada kesempatan ini juga diteliti kemampuan induksi enzim

-hexosaminidase oleh zeorin (spontaneous release). Mengacu pada tulisan

Ikawati dkk (2001) yang menggunakan histamin sebagai paramater mediator sel

mast. Efek induksi akan dipertimbangkan bermakna jika melebihi nilai 10 %.

Prosentase pelepasan enzim

-hexosaminidase secara spontan oleh zeorin

(spontaneous release) disajikan pada Tabel II.

Pemberian zeorin dengan

konsentrasi 1, 10 dan 100

M tidak menunjukkan efek pelepasan enzim secara

spontan secara bermakna pada sel kultur RBL-2H3.

Tabel II. Prosentase pelepasan enzim

-hexosaminidase secara spontan

(spontaneous release) oleh zeorin

Konsentrasi (M)

Pelepasan enzim

-hexosaminidase

secara spontan (%)

1

0,580,32

10

-0,251,48

100

2,592,35

Reaksi imunologis pada sel mast melibatkan reaksi antara antigen

dengan antibodi. Imunoglubulin E (IgE), yang ditambahkan pada kultur sel

RBL-2H3 sebelum penelitian akan menempel pada permukaan membran sel mast

pada reseptor FcRI pada sel mast. Setelah inkubasi kultur sel tersebut dengan

DNP

24

-BSA yang berfungsi sebagai antigen, mengakibatkan DNP

24

-BSA tersebut

segera berikatan dan membentuk jembatan antara 2 molekul IgE yang

menempel pada sel mast (cross-linking) yang kemudian akan mengaktivasi

tirosin kinase dan mengaktifkan fosfolipase C. Selanjutnya, fosfolipase C lalu

menghidrolisis fosfatidil inositol (PI) menjadi inositol trifosfat (IP

3

) dan

1,2-diasilgliserol (DAG). Inositol trifosfat akan menghasilkan peningkatan kadar ion

kalsium intraseluler baik dari intracellular Ca

2+

pool maupun influks Ca

2+

,

sehingga mengakibatkan degranulasi sel mast. Sedangkan 1,2-diasilgliserol

mengaktifkan

protein

kinase

C

(PKC),

kemudian

secara

sinergis

juga

merangsang degranulasi sel mast. Degranulasi terjadi melalui proses eksositosis,

yang

akhirnya

melepaskan

beberapa

mediator

diantaranya

adalah

-hexosaminidase (Dale et al., 1994; Subowo, 1993; Metcalfe et al., 1997).

Thapsigargin, sesquiterpen lacton yang diisolasi dari tanaman Thapsia

garginica, bekerja pada pompa ion kalsium yang tergantung pada ATP

(ATP-dependent Ca

2+

pump) pada retikulum endoplasmik (Patkar et al., 1979; Brayden

et al., 1989). Penghambatan ATP-dependent Ca

2+

pump akan memacu

pelepasan ion kalsium dari retikulum endoplasmik dan mencegah pengisian ion

kalsium pada retikulum endoplasmik. Pelepasan ion kalsium tersebut kemudian

mengaktivasi kanal ion kalsium pada membran sel (calsium release activated

calcium channels in membran) atau CRACM, yang kemudian memacu influks ion

kal

si

um menuj

u i

nt

r

asel

ul

er

.

Pr

oses t

er

akhi

r

i

ni

di

namakan “

store operated

calcium influx

”

.

Hasi

l

akhi

r

dal

am

pr

oses

i

ni

adal

ah

peningkatan konsentrasi ion

kalsium intraseluler pada sel mast (Alonso et al., 2008).

Pada penelitian kali ini, zeorin yang diisolasi dari Aegle marmelos Correa

mampu menunjukkan efek penghambatan terhadap pelepasan mediator sel mast

yaitu

-hexosaminidase yang diinduksi oleh antigen (reaksi imunologi). Namun,

senyawa tersebut kurang sukses dalam menghambatn enzim tersebut ketika

distimulasi oleh thapsigargin (Ca

2+

stimulant). Berdasarkan fakta tersebut,

mekanisme penghambatan enzim

-hexosaminidase oleh zeorin pada sel mast

kemungkinan besar melibatkan penghambatan pada proses interaksi antara

antigen-antibodi (imunologi) atau proses sinyal transduksi intraceluler pada sel

mast akibat reaksi imunologis tersebut.

KESIMPULAN

Zeorin, senyawa yang diisolasi dari Aegle marmelos Correa, mampu

menunjukkan efek penghambatan terhadap pelepasan mediator sel mast yaitu

enzim

-hexosaminidase dengan melibatkan penghambatan pada proses

interaksi antara antigen-antibodi (imunologi) atau proses sinyal transduksi

intraceluler pada sel mast akibat reaksi imunologis tersebut.

DAFTAR PUSTAKA

Alonso, E., Alfonso, A., Lober, K.,et. al., 2008, The effect of rottlerin in calcium

regulation in HMC-1(560) cells is mediated by a PKC-delta independent

effect, J Cell Biochem., 105 (1), pp 255-261

Arul, V., Miyazaki, S., Dhananjayan R., 2005, Studies on the anti-inflammatory,

antipyretic and analgesic properties of the leaves of Aegle marmelos

Corr., J Ethnopharmacol., 96(1-2), pp 159-163

Brayden, D. J., Hanley, M, R., Thastrup, O., et. Al., 1989, Thapsigargin, a new

calcium-dependent epithelial anion secretagogue, Br J Pharmacol., 98

(3), pp 809-816

Bottcher, I., Ulrich, M., Hirayama, N., et. al., 1980, Production of monoclonal

mouse IgE antibodies with DNP specificity by hybrid cell lines, Int Arch

Allergy Appl Immunol., 61 (2), pp 248-250

Casal, J, A., Cano, E., Tutor, J, C., 2005, Beta-hexosaminidase isoenzyme

profiles in serum, plasma, platelets and mononuclear, polymorphonuclear

and unfractionated total leukocytes, Clin Biochem., 38 (10), pp 938-942

Dale,

M.M.,

Foreman,

J.C.,

and

Fan,

T.D.,

1994,

Textbook

of

Immunopharmacology, Edisi Ketiga, Blackwell Scientific Publication,

Oxford, pp 21-34

Ikawati, Z., Wahyuono, S., Maeyama, K., 2001, Screening of several Indonesian

medicinal plants for their inhibitory effect on histamine release from

RBL-2H3 cells, J Ethnopharmacol., 75 (2-3), pp 249-256.

Lampronti, I., Martello, D., Bianchi, N., et. al., 2003, In vitro antiproliferative

effects on human tumor cell lines of extracts from the Bangladeshi

medicinal plant Aegle marmelos Correa., Phytomedicine, 10 (4), pp

300-308

Liu, F. T., Bohn, J. W., Ferry, E, L., et. al., 1980, Monoclonal

dinitrophenyl-specific murine IgE antibody: preparation, isolation, and characterization,

J Immunol., 124 (6), pp 2728-2737

Mahuran, D. J., 1995,

-hexosaminidase: biosynthesis and processing of the

normal enzyme, and identification of mutations causing Jewish Tay-Sachs

disease, Clin Biochem., 28 (2), pp 101-106

Marinkovic,

D.V.

and

Marinkovic,

J.

N.,

1977,

Purification

of

Two

Hexosaminidases from Human Kidney, Biochem. J., 163, pp 133-140

Metcalfe, D.D., Baram, D., Mekori, Y.A., 1997, Mast cells, Physiol Rev., 77, pp

1033-1064

Orida, N., Feldman, J.D., Katz, DH., et. al., 1983, IgE-mediated chemotaxis of rat

basophilic leukemia cells towards specific antigen, J Exp Med., 157 (6),

pp 2166-2171

Patkar, S.A., Rasmussen, U., Diamant, B., 1979, On the mechanism of histamine

release induced by thapsigargin from Thapsia garganica L., Agents

Actions, 9 (1), pp 53-57

Rana, B.K., Singh, U.P., Taneja, V., 1997, Antifungal activity and kinetics of

inhibition by essential oil isolated from leaves of Aegle marmelos, J

Ethnopharmacol., 57 (1), pp 29-34

Riyanto, S., 2003, Phytochemical Studies and Bioactivity Tests of Murraya

paniculata Jack, Aegle marmelos Correa, and Zingiber amaricans Blume,

Dissertation, Universiti Putra Malaysia

Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I., 1979, Immunologic release of

beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal

mast cells, J Immunol., 123 (4), pp 1445-1450

Subowo, 1993, Imunologi Klinik, Angkasa, Bandung, pp 9-35

Upadhya, S., Shanbhag, K. K., Suneetha, G.,et. al., 2004, A study of

hypoglycemic and antioxidant activity of Aegle marmelos in alloxan

induced diabetic rats, Indian J Physiol Pharmacol., 48 (4), pp 476-480