BAB IV
METODE PENELITIAN 4.1 JENIS DAN RANCANGAN PENELITIAN
Jenis penelitian ini adalah penelitian eksperimental (true experiment design)dengan menggunakan metode Post Test Randomized Group Design.
4.2 TEMPAT DAN WAKTU PENELITIAN
Waktu penelitian direncanakan selama 35 hari pada tahun 2020 di Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang.
4.3 POPULASI DAN SAMPEL 4.3.1 Populasi
Populasi dalam penelitian ini adalah tikus putih jantan (Rattus novergicus) strain wistar karena memiliki kemiripan fungsi metabolik dengan manusia (Krisnansari,2014). Tikus diperoleh dari Laboratorium Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang.
4.3.2 Sampel
Penelitian ini menggunakan sampel tikus putih jantan (Rattus novergicus) strain Wistar yang sesuai dengan kriteria inklusi.
4.3.3 Besar Sampel
Pada penelitian ini untuk menentukan besar sampel menggunakan rumus Federer (1999). Kelompok perlakuan terdiri
dari 5 kelompok yaitu, satu kelompok kontrol positif, kelompok kontrol negatif, dan tiga kelompok perlakuan.
(𝑛 − 1)(𝑡 − 1) ≥ 15 Keterangan:
n= Jumlah replikasi tiap perlakuan t= Banyaknya kelompok perlakuan
Karena terdapat 5 kelompok, maka didapatkan:
(𝑛 − 1)(5 − 1) ≥ 15 (𝑛 − 1)4 ≥ 15
4𝑛 − 4 ≥ 15 4𝑛 ≥ 19
𝑛 ≥ 4,6
Atau dibulatkan menjadi 5 ekor untuk setiap kelompok.
Ʃ hewan = n x Ʃ kelompok perlakuan = 5 x 5
= 25 ekor
E (besar sampel) = Ʃ hewan – Ʃ kelompok perlakuan
= 25 – 5
= 20 ekor
Rumus besar sampel untuk mengantisipasi kemungkinan sampel terpilih mengalami drop out (Saryono, 2011) sebagai berikut:
n’ = [n/1-f]
n’ = 5 / (1-0,2) n’= 6,25 n’ = 7 : 5
n’ = 1,4 n’ = 2 ekor Keterangan :
n’ = jumlah sampel penelitian n = besar sampel yang dihitung
f = perkiraan proporsi drop out, kira-kira 20% (f = 0,2) Setelah dimasukkan rumus replikasi Frederer, dilanjutkan dengan rumus Resource Equation Method sehingga dibutuhkan 20 ekor tikus untuk penelitian ini.
Ditambah dengan jumlah sampel cadangan sebanyak 20% (f=0,2) dari total sampel sehingga diperoleh 2 ekor tikus untuk cadangan masing- masing kelompok. Jadi total sampel tikus yang dibutuhkan beserta cadangan adalah 30 ekor tikus dibagi ke dalam 5 kelompok yang berarti 1 kelompok terdiri dari 4 ekor tikus dan 2 ekor tikus cadangan.
4.3.4 Teknik Pengambilan Sampel
Teknik pengambilan sampel dalam penelitian ini menggunakan purposive sampling, yaitu pengambilan sampel dengan cara mengambil sample tikus putih jantan (Rattus norvegicus) strain wistar menyesuaikan dengan kriteria penelitian yang sudah ditentukan.
4.3.5 Karakteristik Sampel Penelitian
a. Kriteria Inklusi :
1. Tikus putih (Rattus norvegicus) strain wistar 2. Jenis kelamin jantan
4. Berat tikus150-200 gram
5. Tikus sehat (gerak aktif, bulu tebal putih, mata jernih,tidak cacat)
b. Kriteria eksklusi:
1. Tikus yang mengalami cacat fisik 2. Tikus yang mengalami infeksi c. Kriteria dropout:
Tikus yang sakit atau mati selama proses penelitian 4.3.6. Variabel Penelitian
a. Variabel Bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah dosis ekstrak umbi rumput teki (Cyperus Rotundus L.).
b. Variabel Tergantung
Variabel tergantung pada penelitian ini adalah kadar kolesterol trigliserida pada tikus putih jantan (Rattus norvegicus strain wistar).
4.3.7. Definisi Operasional
Tabel 4.1 Definisi Operasional
No Variabel Definisi Operasional Alat Ukur Hasil Ukur Skala Ukur
1
Ekstrak umbi rumput teki (Cyperus rotundus L.)
Tanaman rumput teki (Cyperus rotundus L.) yang diperoleh dari Materia Medika. Bagian rumput teki yang digunakan untuk ektraksi
diambil dari bagian umbinya.
Neraca ohaus digital, Spuit
Jumlah ekstrak sesuai dosis yang di dapat yaitu 125 mg/kgBB, 250 mg/kgBB, 500 mg/kgBB secara peroral setiap hari selama 35 hari.
Ordinal (kategorik)
2
Kadar trigliserida darah pada tikus
Pengamatan kadar Trigliserida pada tikus wistar.
Kadar Trigliserida mengalami penurunan disebabkan oleh adanya aktivitas
antioksidan dari ekstrak umbi
rumput teki.
Spektrofotometri Kadar
trigliserida darah pada tikus normal adalah 26-145 mg/dl
Pengukuran kadar Trigliserida diambil dari darah jantung sebanyak 3 ml.
Kadar Trigliserida ditempatkan dalam vacutainer EDTA dan di sentrifuge dan di lanjutkan ukur menggunakan spektrofotometri .
Rasio (numerik)
4.4 Alat dan Bahan Penelitian Alat Pemeliharaan Tikus
a. Kandang pemeliharaan tikus
b. Botol minum dan tempat makan tikus c. Anyaman kawat untuk penutup kandang d. Timbangan
Alat dan Bahan Pembuatan Ekstrak Umbi Rumput Teki
Timbangan analitik (0,001 gram), Pisau,, saringan, wadah, rotary tabung evaporator, pengaduk, corong buchner, dan gelas.
Alat Pengambilan Darah Tikus
Handscoon, jarum, pipet mikro 50μl, tabung kuvat pirex, dan EDTA.
Alat dan Bahan Pengukuran Trigliserida
Micro pipet, tabung reaksi, rak tabung, kuvet, spektrofotometer, dan reagen untuk pemeriksaan Trigliserida.
Alat dan Bahan Pembuatan Diet Hiperlipidemi.
Baskom, pisau, wajan, telur puyuh, minyak jelantah dan lemak sapi.
4.5 Prosedur Penelitian 4.5.1 Adaptasi
Proses adaptasi hewan coba di dalam kandang dilakukan selama 7 hari dengan tujuan agar tikus dapat menyesuaikan diri terhadap lingkungan yang baru sebelum diberi perlakuan sambil diamati kesehatannya. Pada tahap ini dilakukan pengamatan terhadap keadaan umum dan penimbangan berat badan setiap hari.
4.5.2 Pembagian Kelompok Tikus
Tikus yang digunakan sebanyak 30 ekor yang terbagi menjadi lima kelompok dan tiap kelompok terdiri dari 6 tikus:
a. Kelompok kontrol positif (K+): Diberi pakan standar BR-1 sebanyak 10 g/hari/tikus serta minum ad libitum ditambah diet
hiperlipidemi yang diberikan dengan metode sonde sebanyak 1 ml/tikus/hari selama 28 hari tanpa pemberian ekstrak umbi rumput teki (Cyperus Rotundus L.).
b. Kelompok kontrol negatif (K-): Diberi pakan standar BR-1 sebanyak 10 g/hari/tikus serta minum ad libitum tanpa ditambah diet hiperlipidemi dan ekstrak umbi rumput teki (Cyperus Rotundus L.) selama 28 hari.
c. Kelompok perlakuan 1 (P1): Diberi pakan standar BR-1 sebanyak 10g /tikus/hari serta minum ad libitum ditambah dengan diet hiperlipidemi sebanyak 1 ml/tikus/hari selama 28 hari dan pemberian ekstrak umbi rumput teki (Cyperus Rotundus L.) dengan dosis 125 mg/KgBB/hari dengan metode sonde lambung sekali dalam sehari selama 28 hari.
d. Kelompok perlakuan 2 (P2): Diberi pakan standar BR-1 sebanyak 10g /tikus/hari serta minum ad libitum ditambah dengan diet hiperlipidemi sebanyak 1 ml/tikus/hari selama 28 hari dan pemberian ekstrak umbi rumput teki (Cyperus Rotundus L.) dengan dosis 250 mg/KgBB/hari dengan metode sonde lambung sekali dalam sehari selama 28 hari.
e. Kelompok perlakuan 3 (P3): Diberi pakan standar BR-1 sebanyak 10 g/hari/tikus serta minum ad libitum ditambah dengan diet hiperliidemi sebanyak 1 ml/tikus/hari selama 28 hari dan pemberian ekstrak umbi rumput teki (Cyperus
Rotundus L.)dengan dosis 500 mg/KgBB/hari dengan metode sonde lambung sekali dalam sehari selama 28 hari.
4.5.3 Pembuatan Ekstrak Rumput Teki
Umbi rumput teki yang dipakai adalah umbi umur 3-5 bulan yang ditandai dengan besarnya umbi 1-3 cm. Umbi secara eksternal berwarna hitam dan daging umbinya berwarna putih kemerahan. Pada penelitian ini untuk mendapatkan ekstrak umbi rumput teki digunakan metode remaserasi.
Satu kilogram umbi rumput teki yang didapatkan dibersihkan lalu dipotong- potong kemudian dikeringkan dengan cara diangin anginkan sampai kering.
Setelah kering (simplisia) umbi rumput teki diblender sehingga menjadi serbuk dan di ayak sehingga besar partikel serbuk sama. Kemudian dilakukan remaserasi yang merupakan cara penyarian sederhana dengan merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari. Cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif. Zat aktif akan larut karena ada perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif dalam sel dengan yang diluar sel. Remaserasi digunakan untuk penyarian simplisia yang mengandung zat aktif yang mudah larut dalam cairan penyari. Serbuk halus umbi rumput teki dimaserasi dengan pelarut etanol 97% dan asam malat 0.5% sebanyak 5 kali bobot bubuk simplisia (bubuk simplisia : pelarut = 1:5) sambil diaduk kemudian disaring.
Maserasi dilakukan sebanyak tiga kali filtrat yang diperoleh kemudian di uapkan dengan rotavapour sampai pelarut tidak tersisa dan diperoleh ekstrak kental sebanyak 90 ml, dilanjutkan dengan pembuatan berbagai konsentrasi ekstrak umbi rumput teki.
Pembuatan dosis ekstrak umbi rumput teki didahului dengan pembuatan larutan, yaitu larutan ekstrak umbi rumput teki yang telah diencerkan dengan air hingga homogen. Buat larutan stok sebanyak 500mg/mL. Sebanyak 500mg ekstrak umbi rumput teki diencerkan dengan 5mL air. Rumus yang digunakan: V1.M1=V2.M2, V1 adalah volume larutan sebelum pengenceran, M1 adalah molaritas larutan sebelum pengenceran, V2 adalah volume larutan setelah pengenceran dan M2 adalah molaritas larutan setelah pengenceran. Kemudian larutan ekstrak ini dicampur dengan DMEM dan diteteskan pada kelompok perlakuan. Dosis ekstrak umbi rumput teki dengan dosis ½xIC50, IC50 dan 2xIC50. Dosis ekstrak umbi rumput teki yang diberikan ditentukan berdasarkan “dose doubling design”, yaitu 20 µg/mL, 40 µg/mL dan 80 µg/mL.maserasi selama 3x24 jam. Dilakukan penyaringan dengan kasa berlapis kapas steril.
Kemudian dilakukan penyaringan ulang dengan cellulose nitrate membrane filter steril yang dipasang pada vaccum flask yang dihubungkan dengan vaccum pum. Lalu maserasi diuapkan dengan rotary evaporator sampai bebas dari ethanol 95% yang dipakai sebagai pelarut (Oktania et al.2012).
4.5.4 Dasar Penentuan Dosis Umbi Rumput Teki
Pada penelitian yang pernah dilakukan terdahulu dosis efektif umbi rumput teki sebagai hipolipidemia yaitu 250 mg/kgBB/hari (okwu et al.
2011). Pada penelitian ini dosis 100mg/kgBB/hari digunakan sebagai dosis empiris (n). Pada penelitian ini menggunakan tiga dosis dengan menaikkan dan menurunkan dari dosis empiris berdasarkan rumus deret hitung yaitu
1/2n, n, 2n (Sagunawan, 2015). Dosis ekstrak umbi rumput teki yang digunakan dalam penelitian ini adalah:
Dosis I: ½ n = ½ x 250 = 125 mg/kgBB/hari Dosis II: n=250 mg/kgBB/hari
Dosis III: 2n = 2 x 250 = 500 mg/kgBB/hari 4.5.5 Pelaksanaan Perlakuan Penelitian
Peneliti mengambil tikus yang sudah dikelompokkan satu per satu secara perlahan sehingga tikus tidak stress. Tikus yang stress akan mempengaruhi kerja hormonnya, sehingga akan berpengaruh pada absorbsi ekstrak di dalam tubuh tikus. Setelah itu tikus dipegang dengan cara memegang badan tikus dan menaruh bagian ekor serta menjepitnya pada jari antara kelingking dengan jari manis, lalu menyilangkan kaki depan tikus dan menjepitnya pada jari antara jari telunjuk dengan jari tengah, sedangkan posisi tikus siap untuk diberi diet tinggi lemak dan ekstrak umbi rumput teki.
Pemberian diet hiperlipidemi diberikan dengan komposisi lemak sapi 10 %, minyak jelantah 17ml, telur puyuh 1 buah diberikan melalui sonde lambung sebanyak 1cc/tikus (Bary Azhary, Sriluliana, 2017).
Pemberian ekstrak umbi rumput teki dilakukan secara peroral dengan sonde setiap hari selama 28 hari dengan dosis 125 mg/kgBB/hari, 250 mg/kgBB/hari, dan 500 mg/kgBB/hari. Pemberian melalui peroral dilakukan melalui sudut mulut agar tikus tidak menggigit sonde. Pemasukan sonde dilakukan ketika tikus melakukan gerakan menelan atau menggerak- gerakkan lidahnya, sehingga sonde tidak melukai bagian dalam mulut tikus.
Setelah sonde masuk sampai bagian esofagus, ekstrak umbi rumput teki
dimasukkan. Esktrak umbi rumput teki diberikan 4 jam setelah pemberian diet hiperlipidemi (waktu pengosongan lambung tikus adalah 4 jam).
Kemudian untuk menentukan dosis dalam ml (mililiter) yaitu dengan cara:
𝜌 (Massa Jenis) = massa volume
Dimana massa jenis ekstrak umbi rumput teki (Cyperus Rotundus L.) diperoleh dari hasil pengukuran dengan menggunakan neraca analisis (piknometer). Kemudian volume dicari dengan rumus:
Volume = massa 𝜌
4.5.6 Pemberian Diet Hiperlipidemi
Pemberian diet hiperlipidemi diberikan dengan komposisi lemak sapi 10 %, minyak jelantah 17ml, telur puyuh 1 buah diberikan melalui sonde lambung sebanyak 1cc/tikus. Sebelum diberikan lemak sapi dipanaskan terlebih dahulu hingga mencair, lalu masukkan minyak jelantah dan disusul dengan telur puyuh kemudian diaduk hingga merata (Bary Azhary, Sriluliana, 2017).
4.5.7 Proses Anastesi dan Pembedahan Hewan coba a. Proses Anastesi
Proses anastesi dilakukan dengan memasukkan hewan coba ke dalam toples kaca yang sebelumnya sudah diberi kapas yang mengandung kloroform. Pembiusan dilakukan satu persatu dengan harapan pembiusan dapat dilakukan secara inhalasi dengan dosis
menggunakan stopwatch. Hewan coba yang teranastesi ditandai dengan tidak adanya respon nyeri, kemudian diletakkan pada meja parafin dan keempat kaki tikus difiksasi menggunakan jarum pentul (Alexandru, 2011).
b. Proses pembedahan
Setelah hewan coba teranastesi dengan baik (pingsan), hewan coba diletakkan pada papan lilin dan keempat kakinya difiksasi dengan menggunakan jarum pentul. Kemudian hewan coba dibedah menggunakan gunting dari abdomen hingga setinggi leher, kemudian dengan menggunakan spuit 3 cc, darah hewan coba diambil dari ventrikel kiri sebanyak ± 3 cc.
c. Proses penanganan hewan coba setelah pembedahan
Setelah hewan coba dibedah, harus dipastikan bahwa hewan coba tidak mengalami recovery. Sebelum mengubur hewan coba, dipastikan bahwa denyut nadi sudah berhenti. Jika hewan coba mengalami recovery maka harus dilakukan prosedur euthanasia, salah satunya dengan prosedur Cervical Dislocation, yaitu dengan cara memisahkan tengkorak dan vertebrae. Teknik ini dilakukan dengan memberikan tekanan ke bagian posterior dasar tulang tengkorak dan vertebrae. Bila vertebrae terpisah dari otak, reflek kedip menghilang dengan segera, rangsangan rasa sakit menghilang sehingga hewan tidak merasakan sakit. Selanjutnya hewan coba yang sudah dipastikan mati, dikumpulkan menjadi satu lalu dikubur (Alexandru, 2011).
4.5.8 Pengukuran Kadar Trigliserida
Pengukuran kadar trigliserida darah tikus menggunakan metode tes kolorimetrik enzimatik. Sampel darah diambil dari ventrikel kiri dan ditampung dalam ependorf. Selanjutnya didiamkan selama 15 menit, kemudian disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 3600 rpm untuk mendapatkan serum. Serum dan larutan standar dimasukkan dalam kuvet untuk mendapat perlakuan sebagai berikut:
1) Sampel serum 10 µl + reagen enzim 1000 µl 2) Larutan standar 10 µl + reagen enzim 1000 µl
3) Reagen enzim 1000 µl sebagai blangko Selanjuntnya kuvet dimasukkan dalam inkubator dengan suhu 370C selama 5 menit.
Spektrofotometer diatur pada panjang gelombang 500 nm.
Kemudian kuvet yang berisi larutan standar diperiksa dan dicatat
absorbansinya sebagai absorbansi standar. Kemudian berturut-turut kuvet yang berisi sampel dimasukkan ke dalam spektronik dan diamati
absorbansinya. Untuk mendapatkan kadar trigliserida darah dihitung menggunakan rumus:
Trigliserida (mg/dl) = ∆ 𝑆𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
∆ 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 X Konsentrasi larutan standar
4.6 Alur Penelitian
Gambar 4.1 Alur penelitian
Menganastesi dengan kloroform secara inhalasi
Pengambilan sediaan darah hewan coba
KONTROL NEGATIF Hari ke-8 hingga 35 diberikan pakan standar
BR-1 sebanyak 15 mg/hari/tikus dan minum ad
libitum.
KONTROL POSITIF
Hari ke-8 hingga 35 diberikan
pakan standar BR-1
sebanyak 15 mg/hari/tikus , minum ad libitum, dan
diet hiperlipidemi
KELOMPOK P1 Hari ke-8 hingga 35 diberikan pakan
standar BR-1 sebanyak 15 mg/hari/tikus,
minum ad libitum, diet hiperlipidemi,
dan ekstrak umbi rumput
teki 125 mg/kgBB
KELOMPOK P2 Hari ke-8 hingga 35 diberikan pakan
standar BR-1 sebanyak 15 mg/hari/tikus,
minum ad libitum, diet hiperlipimi, dan
ekstrak umbi rumput teki 250
mg/kgBB
KELOMPOK P3 Hari ke-8 hingga35 diberikan pakan
standar BR-1 sebanyak 15 mg/hari/tikus,
minum ad libitum, diet hiperlipidemi,
dan ekstrak umbi rumput
teki 500 mg/kgBB Adaptasi pada hari ke-1sampai hari ke-7
Analisis data Pemeriksaan Triserida darah
4.7 Analisis Data
Data yang telah diperoleh dalam penelitian ini dianalisis menggunakan uji normalitas, uji homogenitas, uji One Way ANOVA, dan uji post hoc yang pengolahannya menggunakan SPSS. (Dahlan, 2016).
a. Uji normalitas merupakan uji untuk mengetahui data memiliki distribusi normal atau tidak dengan menggunakan metode analitik parameter Shapiro-Wilk. Dikatakan distribusi normal jika (p>0,05) dan (p<0,05) apabila tidak normal. Apabila data memiliki distribusi tidak normal maka akan dilakukan transformasi log / In x2, √x kemudian hasil transformasi diuji normalitas. Jika distribusi data normal (p>0,05) maka dilanjutakn dengan uji One Way ANOVA dengan Post hoc apabila tidak normal maka menggunakan uji non parametric Kruskal- Wallis dengan Post hoc Mann-Whitney.
b. Uji homogenitas merupakan uji untuk mengetahui apakah dua atau lebih kelompok data mempunyai varian yang sama atau tidak dengan uji varian Levane’s test.
c. Uji One Way ANOVA digunakan untuk membuktikan adanya perbedaan yang bermakna antara kontrol dengan kelompok dengan pemberian ekstrak. Hasil uji One Way ANOVA dikatakan ada perbedaan bermakna jika signifikan (sig) < 0,05.
d. Post Hoc merupakan uji kelanjutan dari uji One Way ANOVA, digunakan untuk mengetahui perbedaan yang bermakna antar masing- masing kelompok perlakuan dalam penelitian. Jika varian data berbeda
maka digunakan uji Post Hoc Tamhane’s dan jika homogen maka menggunakan uji Post Hoc Bonferroni.
e. Uji regresi merupakan uji regresi linier yang digunakan untuk melihat besar pengaruh dosis ekstrak umbi rumput teki (Cyperus rotundus L.) dengan menggunakan rumus (R2) dan untuk memprediksi pengaruh dosis ekstrak umbi rumput teki (Cyperus rotundus L.) dengan menggunakan rumus ( y = a + bx )
