28 BAB IV
METODE PENELITIAN
4.1 Jenis Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental (true experiment design) dengan metode post test only control group design yaitu dengan melakukan perhitungan jumlah sel nekrosis pada korteks prefrontal otak setelah diberi perlakuan.
4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Biomedik Universitas Muhammadiyah Malang dalam waktu 30 hari pada bulan Juni – Juli 2019.
Pembuatan preparat histopatologi otak dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi Kessima Malang pada Juli 2019.
4.3 Populasi dan Sampel 4.3.1 Populasi
Populasi yang digunakan dalam penelitian adalah tikus putih jantan (Rattus norvegicus strain wistar).
4.3.2 Sampel
Sampel diambil dari populasi tikus putih jantan (Rattus norvegicus strain wistar) yang sesuai dengan kriteria inklusi.
4.3.3 Besar Sampel
Rentang besar sampel yang digunakan ditentukan dengan rumus :
DF = N – k = kn – k = k (n – 1)
Dimana DF adalah Degrees of freedom, N adalah total sampel, n adalah total sampel di tiap kelompok, dan k adalah jumlah kelompok.
Sehingga, dengan formula diatas, besar sampel di tiap kelompok ditentukan dengan rumus :
n = DF/k + 1
Rentang DF yang bisa diterima adalah 10 sebagai nilai minimum dan 20 sebagai nilai maksimum. Nilai k yang berupa jumlah kelompok dalam penelitian ini adalah 3. Sehingga rumus nya menjadi :
- Minimum n = 10/k +1 nilai minimum n penelitian ini = 10/3 +1 = 5 sampel/grup
- Maksimum n = 20/k +1 nilai maksimum n penelitian ini = 20/3+1 = 8 sampel/grup
Dan rumus total sampel adalah :
- Minimum N = minimum n x k maka total sampel minimum : 5 x 3 = 15 sampel
- Maksimum N = maksimum n x k maka total sampel maksimum : 8 x 3
= 24 sampel
(Arifin & Zahiruddin, 2017)
Berdasarkan perhitungan besar sampel maka didapatkan nilai minimum dan maksimum total sampel, maka rentang besar sampel pada penelitian ini adalah 15 - 24 sampel. Jumlah sampel yang akan digunakan untuk penelitian ini adalah
sebanyak 24 sampel yang dibagi menjadi 3 kelompok, sehingga setiap kelompok diisi oleh 8 ekor tikus putih jantan (Rattus norvegicus strain wistar).
4.3.4 Teknik Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel menggunakan teknik simple random sampling dari populasi tikus putih jantan (Rattus norvegicus strain wistar).
4.3.5 Karakteristik Sampel Penelitian a. Kriteria Inklusi
1. Subjek penelitian yaitu tikus putih jantan (Rattus norvegicus strain wistar).
2. Berat badan hewan coba antara 150-200 gram.
3. Usia hewan coba antara 8-12 minggu.
4. Kondisi sehat yang ditandai dengan gerakan aktif.
b. Kriteria Eksklusi
1. Tikus yang cacat sebelum diberikan perlakuan.
2. Tikus yang pernah diberikan perlakuan sebelumnya.
3. Tikus yang selama aklimatisasi tidak mau makan.
c. Kriteria Drop Out
1. Tikus yang sakit selama proses perlakuan 2. Tikus yang mati selama proses perlakuan
4.3.6 Variabel Penelitian 4.3.6.1 Variabel Bebas
Paparan asap rokok elektronik (E-cigarette)
4.3.6.2 Variabel Tergantung
Jumlah sel nekrosis pada gambaran histopatologi korteks prefrontal otak tikus putih jantan
4.3.7 Definisi Operasional
a. Paparan asap rokok elektronik yang mengandung 0 mg nikotin dalam 3 ml liquid dan 3 mg nikotin dalam 3 ml liquid kepada hewan coba yang sudah ditempatkan di smoking box. Pemaparan dilakukan sebanyak 2 kali sehari selama 30 hari (Tursinawati, et al., 2017).
b. Sel nekrosis berupa sel dengan inti piknotik (padat dan angular) dan sitoplasma berwarna eosinofilik (Kristianingrum, 2016). Sel nekrosis diamati pada gambaran histopatologi korteks prefrontal otak tikus putih jantan yang telah diberi perlakuan. Pengamatan dilakukan dengan mikroskop perbesaran 400 kali pada 5 lapang pandang kemudian dihitung dan dibuat rerata jumlah sel nekrosis pada tiap kelompok hewan coba.
4. 4 Alat dan Bahan Penelitian 4.4.1 Alat
a. Untuk Pemeliharaan Tikus
1. Kandang dengan kawat sebagai penutup 2. Sekam
3. Tempat minuman hewan coba 4. Timbangan analitik
b. Untuk Paparan Asap Rokok 1. Rokok elektronik
2. Smoking box 3. Smoking pump 4. Handscoon 5. Masker
d. Untuk Pembedahan Tikus 1. Alat bedah minor set 2. Papan bedah
3. Kapas 4. Jarum pentul 5. Handscoon 6. Masker 7. Kertas label e. Alat Lain
1. Mikroskop 2. Jas Laboratorium
4.4.2 Bahan
1. Makanan tikus BR-1 2. Liquid Rokok elektronik 3. Anastesi kloroform 4. Formalin 10%
4.5 Prosedur Penelitian
4.5.1 Proses Adaptasi (Aklimatisasi)
Tahap adaptasi tikus dilakukan dalam waktu 7 hari agar tikus dapat beradaptasi di lingkungan yang baru. Selama proses ini diberikan pakan
berupa BR-1 dan minum serta dilakukan penggantian sekam. Pada tahap ini tikus akan mulai ditimbang untuk memenuhi kriteria inklusi.
4.5.2 Pembagian kelompok tikus
Tikus yang digunakan sebanyak 24 ekor yang dibagi dalam 3 kelompok perlakuan yang masing masing terdiri atas 3 ekor tikus:
a. Kelompok 1: Kontrol Negatif yaitu pemberian pakan BR-1 dan minum standar tanpa diberi paparan asap rokok elektronik dan rokok konvensional selama 30 hari
b. Kelompok 2: Pemberian pakan BR-1 dan minum standar serta diberi paparan asap rokok elektronik yang mengandung 0 mg nikotin sebanyak 3 ml liquid dengan 2 kali pemaparan perhari selama 30 hari.
c. Kelompok 3: Pemberian pakan BR-1 dan minum standar serta diberi paparan asap rokok elektronik yang mengandung 3 mg nikotin sebanyak 3 ml liquid dengan 2 kali pemaparan perhari selama 30 hari (Tursinawati, et al., 2017).
4.5.3 Pemaparan Asap Rokok
Paparan asap rokok elektronik dan konvensional dilakukan di dalam smoking box yang dirancang khusus untuk pengkondisian hewan coba terhadap paparan asap rokok. Smoking box kemudian dihubungakan dengan smoking pump dan rokok. Paparan asap rokok diberikan dengan dosis 3 ml liquid dalam 2 kali pemaparan perhari selama 30 hari.
4.5.4 Anastesi dan Pembedahan Hewan Coba a. Proses anastesi
Proses anastesi inhalasi pada hewan coba dilakukan dengan memasukan hewan coba ke kotak kaca dengan kapas yang dicampur kloroform.
b. Proses pembedahan
Setelah teranastesi dengan baik atau dalam keadaan terbius dengan sempurna, hewan coba diposisikan pada meja lilin lalu keempat kakinya difiksasi dengan menggunakan jarum pentul.
Menggunakan gunting bedah dilakukan pembedahan leher.
Kemudian dilakukan pembedahan otak untuk diambil bagian prefrontal otak. Organ otak disimpan dalam tabung plastik dengan ditambahkan formalin 10%.
c. Penanganan hewan coba setelah pembedahan
Selanjutnya hewan coba yang dipastikan sudah mati, dikumpulkan lalu dikubur.
4.5.5 Pembuatan Preparat Histologi
Pembuatan preparat histologi dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi Kessima Malang, dengan pengecatan Hematoksilin-Eosin.
a. Proses Bahan dan Jaringan 1. Fiksasi dan Pencucian
Organ difiksasi dengan formalin 10% untuk mencegah kerusakan jaringan. Sebelum diproses menjadi preparat histologi,
jaringan dicuci dengan air minimal 1,5 jam untuk menghilangkan bahan fiksasi.
2. Dehidrasi
Dilakukan dehidrasi ringan bertingkat dengan maksud untuk menghilangkan air agar jaringan tidak mengkerut. Dehidrasi ini dilakukan dengan cara sebagai berikut:
Jaringan dimasukkan 1 jam ke dalam alkohol 80%.
Jaringan dimasukkan ke dalam alkohol 95% selama 1 jam, diulang 2 kali
Jaringan dimasukkan ke dalam alkohol 100% selama 1
jam, diulang 3 kali.
3. Clearing
Jaringan dimasukkan ke dalam xylol 2 kali, masing-masing 1 jam, untuk menghilangkan alkohol.
4. Parafinisasi
Jaringan dimasukkan ke dalam parafin yang dipanaskan selama 3 jam agar tetap cair. Hal ini dimaksudkan agar konsentrasi parafin tetap sama dengan jaringan pada waktu diblok.
b. Pembuatan Blok
1. Pada cetakan diberi label untuk identifikasi.
2. Parafin cair dimasukkan ke dalam cetakan.
3. Jaringan ditempatkan pada posisi yang diinginkan ke dalam parafin tersebut, lalu disiram dengan parafin cair secukupnya.
4. Parafin dibiarkan hingga dingin.
c. Pemasangan dan Pemotongan Blok Parafin
1. Letak jaringan dalam blok parafin harus diperhatikan. Bagian blok dibelakang dan dilekatkan pada kayu pemegang blok dengan cara memanaskan parafin.
2. Memasang pemegang blok pada mikrotom dan memasang pisau mikrotom pada posisinya. Mengatur posisi indikator yang menunjukkan ketebalan potongan.
3. Pemotongan secara rutin adalah 6-10 mikron.
4. Hasil pemotongan saling bersambungan membentuk pita.
Ujung pita diangkat dengan kuas dan direntangkan diatas permukaan air hangat (45-50°C). Pita direntangkan secara lembut dan lurus tanpa lipatan.
d. Pemasangan Pita Sayatan pada Object glass
1. Object glass dilapisi dengan lapisan putih telur yang tipis sebagai bahan perekat dan dibiarkan kering.
2. Pita parafin dipotong dengan silet yang dibubuhi xylol dan potongan dibiarkan diatas air.
3. Object glass dicelupkan ke bawah pita parafin, kemudian pita tersebut diangkat dengan object glass.
4. Object glass dimasukkan ke dalam incubator suhu 30°C selama 30 menit sampai 3 jam.
e. Pewarnaan Hematoksilin-Eosin 1. Deparafinisasi
Object glass dimasukkan dan direndam ke dalam xylol dalam waktu 5 menit, diulang 3 kali. Bertujuan untuk menghilangkan sisa parafin pada jaringan yang akan dicat.
2. Hidrasi
Object glass dimasukan ke dalam alcohol 9% lalu direndam selama 2 menit, kemudian dimasukkan ke dalam alcohol 95%
selama 2 menit, selanjutnya dimasukkan ke dalam alcohol 80%
selama 2 menit. Hal ini dimaksudkan untuk menambah air secara bertahap, agar jaringan tidak mengkerut.
3. Object glass dimasukkan ke dalam Hematoksilin selama 15 menit lalu dicuci dengan air mengalir selama 20 menit.
4. Object glass dimasukkan ke dalam alkohol asam 2-3 celup, lalu dibilas dengan air mengalir selama 2 menit.
5. Object glass dimasukkan ke dalam Eosin 1% selama 0,5-1 menit.
6. Dehidrasi
Object glass dimasukkan ke dalam alcohol 80% selama 5 menit, lalu dimasukkan ke dalam alcohol 95% selama 5 menit.
f. Penjernihan dan Mounting
Object glass dimasukkan ke dalam xylol selama 5 menit, diulang 3 kali. Lalu tetesi dengan Canadian Balsem atau Entellan pada permukaan object glass lalu tutup dengan cover glass.
4.5.6 Pengamatan Preparat Histologi
Pengamatan preparat dilakukan dengan mikroskop perbesaran 400 kali di Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran UMM.
4.5.7 Skema Alur Penelitian
Tikus Putih jantan (Rattus norvegicus strain wistar) Aklimatisasi tikus baik pakan dan lingkungan selama 7 hari
Sesuai kriteria inklusi dan eksklusi
Kontrol Negatif
dengan diberi pakan dan air minum standar
selama 30 hari.
Diberi pakan, air minum, dan dipapar asap rokok
elektronik dengan 0 mg
nikotin sebanyak 3 ml liquid dalam 2
kali pemaparan perhari selama
30 hari.
Tikus dianastesi dan dibedah pada hari ke 30 dan diambil bagian otaknya
Pembuatan sediaan dengan pewarnaan hematoxilin eosin
Pengamatan sediaan yang mengalami nekrosis pada korteks prefrontal otak di bawah mikroskop
Pencatatan hasil dan analisis data: Uji Kruskal- Wallis, Uji Post Hoc Mann Whitney, dan Uji Regresi Linear
Kelompok 3 Kelompok 2
Kelompok 1
Diberi pakan, air minum, dan dipapar asap rokok
elektronik dengan 3 mg
nikotin sebanyak 3 ml liquid dalam 2 kali pemaparan
perhari selama 30 hari.
4.6 Analisis Data
Data yang diperoleh dianalisis menggunakan aplikasi SPSS dengan:
a. Uji Normalitas dan Homogenitas
Uji homogenitas bertujuan untuk mengetahui varian data, dikatakan normal jika sig > 0,05. Uji normalitas dilakukan untuk mengetahui apakah sebaran data normal atau tidak, dengan menggunakan uji Saphiro-Wilk karena besar sampel yang digunakan ≤ 50. Sebaran data dikatakan normal jika sig > 0,05. Jika data tidak normal, maka dilakukan transformasi data.
Jika hasil transformasi data tetap tidak normal maka dilanjutkan dengan uji Kruskal Wallis.
b. Uji Kruskal Wallis
Untuk menguji adanya terdapat perbedaan yang bermakna rata-rata sel nekrosis otak antar kelompok setelah pemaparan asap rokok elektrik.
Adanya perbedaan bermakna tiap kelompok didapatkan apabila nilai sig
<0.05.
c. Uji Post Hoc Mann- Whitney
Uji Post-Hoc Mann Whitney digunakan untuk mengetahui perbedaan signifikan antar kelompok. Adanya perbedaan bermakna apabila nilai sig <0.05.
d. Uji Regresi Linear
Uji Regresi Linear digunakan untuk mengetahui besar pengaruh nikotin dalam rokok elektronik terhadap peningkatan rata- rata sel nekrosis otak, kemudian untuk mengetahui kekuatan hubungan antar variabel, dan
memprediksi pengaruh yang timbul pada jumlah sel yang mengalami nekrosis dari pemberian nikotin dalam rokok elektronik.
4.7 Jadwal Penelitian
No Jenis Kegiatan Minggu
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1. Persiapan X
2. Adaptasi hewan coba X
3. Pemberian paparan X X X X
4. Pembedahan X
5. Pengumpulan data X
6. Analisis data X
7. Konsultasi dan Revisi X X
