BAB 4 METODE PENELITIAN 4.1 Jenis Penelitian
Penelitian ini menggunakanxrancangan penelitian eksperimental dan
metode yang digunakanxadalah post test control group design yaitu rancangan
penelitian yang hasilxpenelitiannya diamati setelah perlakuan selesai.
4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas MuhammadiyahxMalang. Pembuatan ekstrak kulit bawang dilakukan
di Laboratorium Biomedik Universitas Muhammadiyah Malang. Penelitianxini
dilakukan selama 1 bulan, mulai bulan November sampaixdengan bulan Desember
2020
4.3 Populasi dan Sampel
4.3.1 Populasi
Populasi pada penelitianxini adalah semua tikus jantanx(Rattus norvegicus
strain wistar).
4.3.2 Sampel
Sampel yang digunakanxpada penelitian adalah tikus putih jantan (Rattus
Norvegicus strain wistar) dengan pengambilanxpopulasi sesuai dengan kriteria
4.3.3 Besar sampel
Terdapat 5 kelompok perlakuan yaituxkelompok kontrol normal (n), kontrol
negatif (-), dan 3 kelompok perlakuan. yaitu kelompok 1 sebagai kontrol negatif hanya diberi pakan, kelompok 2 sebagai kontrol positif diberi pakan serta diinduksi ovalbumin, kelompok 3 selain diberikan pakan dan diinduksi ovalbumin, diberikan juga ekstrak bawang merah (Allium cepa L.) sebanyak 3 ml dengan kadar 15% selama 4 minggu, kelompokx4 diinduksi ovalbumin dan diberi ekstrak bawang
merah (Allium cepa L.) sebanyak 3 ml dengan kadar 20% selama 4 minggu, kelompok 5 diinduksi ovalbumin dan diberi ekstrak bawang merah (Allium cepa
L.) sebanyak 3 ml denganxkadar 25% selama 4 minggu. Penentuan besar replikasi
sampel dalam penelitian ditentukan menggunakan rumus pada Sample Size
Calculation in Animal Studies tahun 2017, yakni sebagai berikut :
Tabel 4. 1 Rumus penentuan jumlah sampel
Annova Design Application Minimum n/grup Maimum n/grup
One-way Annova
Group
Comparasion
10/k +1 20/k+1
Keterangan :
n : Jumlahxsubjek tiap kelompok
k : Jumlah kelompok
Sesuai dengan rumusxtersebut maka untuk mendapat sampel atau jumlah
subjek tiap kelompoknya dapat dikalkulasikan sebagai berikut : Jumlah sampel minimum
n = 10/5 +1 n = 3
Jumlah sampel maksimum n = 20/k +1
n = 20/5 +1 n = 5
Sehingga dalam penelitian ini jumlah sampel tiap kelompoknya adalah 3. Maka jika dijumlahkan pada peneliatian ini digunakan kurang lebih 15 sampel. 4.3.4 Teknik pengambilan sampel
Teknik pengambilan samplingxmenggunakan purposive sampling
4.3.5 Karakteristik sampel penelitian A. Kriteria Inklusi
1. Tikus Rattus NovergicusxStrain Wistar jenis kelamin jantan
2. Umur 2–3 bulan
3. Berat Badanx150 – 200 gram
4. Tikus dalam keadaan sehat, ditandai dengan gerakannya yang aktif, bulu yangxtebal, mata yang jernih
B. Kriteria Eksklusi
1. Tikus yang sudah pernah digunakan dalam penelitian lain
2. Tikus sakit selama prosesxperlakuan (gerakan tidak aktif, tidak mau
makan, rambut kusam atau rontok atau botak dan keluarnya eksudat yang tidak normal)
3. Terdapat penurunan berat badan lebih dari 10% setelah masa adaptasi di laboratorium
4. Tikus yang matixselama penelitian
4.3.6 Variabel penelitian A. Variabel Bebas
Ekstrak bawang merah (Allium cepa L.) berbagai dosis B. Variabel Tergantung
Jumlah sel eosinofilxpada parenkim pulmo tikus putih (Rattus
norvegicus) 4.4 Definisi Operasional No Variabel dan Sub Variabel Definisi Operasional dan Indikator
Instrumen dan Kriteria Hasil Ukur Skala Data 1 Ekstrak Bawang Merah (Allium cepa L.)
Bahan baku dari bawang merah yang akan digunakan untuk pembuatan ekstrak diperoleh dari Materia Medika Batu.
Proses ekstraksi juga dilakukan di Materia Medika menggunakan etanol 70% sebagai bahan utamanya dan dibagi menjadi tiga dosis yakni sebesar : 1. 35mg/kgBB/hari, 2. 70mg/kgBB/hari, 3. 140mg/Kg/hari. Surat determinasi
Allium cepa L dari
Materia Medika digunakan sebagai bukti penggunaan Allium cepa L.. Kategorik (Ordinal)
2 Eosinofil Sel eosinofil merupakan sel yang granula
Gambaran infiltrasi sel inflamatori diamati menggunakan
sitoplasmanya berwarna merah dan memiliki dua lobus. Eosinofil yang diamati pada penelitian ini adalah eosinofil pada jaringan peribronkial paru lobus sebelah kiri menggunakan metode parafin dengan pewarnaan Hematoxcillin-Eosin (HE). mikroskop Olympus BX51 perbesaran 1000x di bawah supervisi ahli patologi anatomi.
Untukxmengetahui jumlah rata – rata sel eosinophil maka dilakukan pengamatan di 5 lapang pandang dengan perbesaran 400x.
4.5 Alat dan Bahan 4.5.1 Alat
a. Alat PemeliharaanxTikus
b. Kandang tikus dan penutup c. Tempat makanxdan minum
d. Timbanganxanalitik
e. Sekam
4.5.1.1 Alat pembuatan ekstrak bawang merah (Allium cepa L.) a. Alcohol 70% b. Pisau c. Timbanganxanalitik d. Pengaduk e. Plastikx f. Handscoon g. Tisux
4.5.1.2 Alat perlakuan a. Nebulizerx b. Handscoon c. Tisux d. Sondexmodifikasi e. Gelasxbeker f. Spuitx5cc
g. Neraca berat badan h. Label
4.5.1.3 AlatxPengambilan Darah
a. Jarum
b. Pipetxmikro 50μi
4.5.1.4 Alat Lain a. Mukosa hidung b. Formalin 10% c. Blokxparafin d. Methylene blue e. Objekxglass f. Coverxglass g. Mikoskop h. Kameraxdigital 4.5.2 Bahan
a. Ekstrak bawang merah (Allium cepa L.) b. Ovalbuminx
c. Al(OH)3
d. Normalxsalin
e. Putihxtelur ayam
f. Aquades
g. Pakanxstandar BR-1.
4.6 Prosedur Penelitian 4.6.1 Adaptasi
Proses adaptasi hewan coba dalam kandang dilakukan selama 7 hari dengan tujuan agar tikus menyesuaikan diri terhadap lingkungan yang baru. Selama adaptasi, tikus diberikan pakan standar BR-1 yang diberikan 1 kali sehari. Jika ada sisa makanan, maka sisanya dibuang lalu diganti dengan yang baru. Tikus juga diberi minum aquades secukupnya. Pada masa aklimatisasi, tikus ditimbang berat badannya.
4.6.2 Pengelompokan hewan coba
Tikus yang digunakanxsebanyak 15 ekor yang terbagi menjadi 5 kelompok
dan tiap kelompok terdiri dari 3 ekor tikus :
a. Kontrol normal: Diberi pakanxstandar BR-1 sebanyak 40 g/hari/tikus
serta minum aquades tanpa diberikan perlakuan selama 29 hari. Kontrol negatif hanyaxuntuk nilai normal tanpa dimasukkan dalam statistik.
b. Kontrol positif: Diberi pakanxstandar BR-1 sebanyak 40 g/hari/tikus
serta minum aquades. Ditambah dengan pemberian ovalbumin 70 µg dan 14 mg Al(OH)3 dalam 1,4 cc normalxsalin secara intraperitoneal
pada hari pertama, hari ke-tujuh dan hari ke-empat belas, dan diberi ovalbumin 7% dalam 10 mlxnormal salin secara inhalasi dengan
menggunakan nebulizer selama 30 menit pada hari ke- sembilan belas dan hari ke-dua puluh dua dan digunakan sebagai pembanding
c. Kelompok III: Diberi pakan standar BR-1 sebanyak 40 g/hari/tikus serta minum aquades. Ditambah dengan pemberian ovalbumin 70 µg dan 14 mg Al(OH)3 dalam 1,4 cc normal salin secara intraperitoneal pada hari
pertama, hari ke-tujuh dan hari ke-empat belas, dan diberi ovalbumin 7% dalam 10 ml normal salin secara inhalasi dengan menggunakan nebulizer selama 30 menit pada hari ke- sembilan belas dan hari ke-dua puluh dua. Serta diberikan ekstrak bawang merah (Allium cepa L.) 2ml dengan dosis 7mg/kali.
d. Kelompok IV: Diberixpakan standar BR-1 sebanyak 40 g/hari/tikus
serta minum aquades. Ditambah dengan pemberian ovalbumin 70 µg dan 14 mg Al(OH)3 dalam 1,4 cc normal salin secara intraperitoneal
pada hari pertama, hari ke-tujuh dan hari ke-empat belas, dan diberi ovalbumin 7% dalam 10 ml normal salin secara inhalasi dengan menggunakan nebulizer selama 30xmenit pada hari ke- sembilan belas
dan hari ke-dua puluh dua. Serta diberikan ekstrak bawang merah (Allium cepa L.) 2ml dengan kadar 14mg/kali.
e. Kelompok V: Diberi pakan standar BR-1 sebanyak 40 g/hari/tikus serta minum aquades. Ditambah dengan pemberian ovalbumin 70 µg dan 14 mg Al(OH)3 dalam 1,4 ccxnormal salin secara intraperitoneal pada hari
pertama, hari ke-tujuh dan hari ke-empat belas, dan diberi ovalbumin 7% dalam 10 ml normal salin secara inhalasi dengan menggunakan nebulizer selama 30 menit padaxhari sembilan belas dan hari
ke-dua puluh ke-dua. Serta diberikan ekstrak bawang merah (Allium cepa L.) 2ml dengan kadar 28mg/kali.
Pada hari pertama, harixke-tujuh dan hari ke-empat belas
dilakukanxsensitisasi denganxpemberianxovalbumin (OVA) 70 µgxsecara
intraperitoneal.xSelanjutnya sensitisasi kedua dilakukan dengan diberikan
ovalbumin 7%xxdalam 10 ml normal salin denganxmenggunakan nebulizer
selamax30 menit secara inhalasi pada hari ke- sembilan belas sampai harixke-dua
puluh dua. Kemudianxpada hari ke-tiga puluh dihentikanxsemua perlakuanxyang
diberikan. Selanjutnyaxdilakukan pembedahanxtikus dan
pengambilanxmukosaxuntuk dilakukanxpewarnaan .
4.6.3 Dasar penentuan dosis
Rekomendasi ekstrak bawang merah (Allium cepa. L.) yang digunakan menggunakan dosis 35mg/kgBB/hari, 70mg/kgBB/hari, 140mg/Kg/hari sesuai penelitian oleh Ghorani, et al (2018) tentang pengaruh ekstrak bawang merah (Allium cepa. L.) terhadap jaringan trakea, sel inflamasi paru, dan tingkat fosfolipase A2 pada tikus model asma.
Pada penelitian yang telah dilakukan Ningrum, et al (2016) tentang pengaruh pemberian kunyit (Curcuma longa) terhadap jumlah eosinofil di jaringan paru pada penyakit alergi yang diinduksi ovalbumin menggunakanxmencit,
didapatkan dosis pemberianxovalbumin adalah 10μg ditambahkan 2 mg Al(OH)3
dalam 0,2 ml normal salin secara i.p, serta pemberian secara inhalasi dengan dosis 1% dalam 10 ml normal salin. Sehinggaxjika dikonversikan dengan menggunakan
tabel konversi dengan faktor pengganti sebesar 7 maka dosis pemberian ovalbumin yang diberikan kepada tikus dengan rata-rata berat 200gram secara i.p pada
penelitian yang akan dilakukan diperoleh sebesar 70μg ditambah 14 mg Al(OH)3 dalam 1,4 ml normal salin, dan dosis pemberian ovalbumin secara inhalasi sebesar 7% dalam 10 ml normal salin.
Tabel 4. 2 Konversi dosis menurut Laurence dan Bacharach (2009)
(Assagaf, 2015)
4.6.4 Pemberian ekstrak bawang merah
Pemberian pelarut aquades sebanyak 3ml didasarkan ukuran lambung tikus sebesar 3-5ml.
Dosis ekstrak bawang merah (Allium cepa L.) yang diberikan, yaitu sebesar: Dosis I : 2ml denganxkadar 7mg/hari (dosis 35mg/kgBB/hari)
Dosis II : 2ml dengan kadar 14mg/hari (dosis 70mg/kgBB/hari)
Dosis III : 2ml dengan kadar 28mg/hari (dosis 140mg/kgBB/hari)
4.6.5 Pembuatan ekstrak bawang merah
Metode ekstraksi bawang yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstraksi menggunakan etanol. Sebanyak 20gram sampel bawang merah dimasukkan ke dalam wadah kemudian direndam dengan 200ml pelarut ethanol dengan kadar 70%, dan dipanaskan selama 3 jam dengan suhu 60℃ didalam air. Campuran ini kemudian di filter dan residu padat telah terekstrak lebih dari dua kali. Setelah itu pelarut di uapkan menggunakan alat pengevaporasi. Ekstrak ini selanjutnya akan disimpan dalam tabung pengeringan. Ekstrak yang telah kering kemudian di simpan di suhu 20℃. Pembuatan ekstrak dengan metode ini
20g Mencitx 200g Tikus 70kg Manusia
20g Mencit 1,0 7,0 387,9
didapatkan hasil yang paling tinggi dibandingkan dengan ekstrasi metode lain.yakni dengan 20g bawang didapatkan kuersetin dengan jumlah 62,39mg/g (Lee, et al., 2014)
4.6.6 Pembuatan larutan ovalbumin
Pembuatan laurtan ovalbumin sebagai alergen dapat dilakukan dengan menggunakan putih telur ayam ras sebanyak 50ml putih telur ayam ras kemudian diaduk hingga tidak terdapat gumpalan. Sensitisasi pada tikus diambil ovalbumin sebanyak 70µg menggunakan pipet mikro dan 14mg Al(OH)3 dalam 1,4cc normal
salin yang selanjutkan diinjeksikan secara intra peritoneal. Pemberian secara inhalasi dilakukan dengan pemberian ovalbuminx7% dalam 10ml normal salin
4.6.7 Pemaparan ulang ovalbumin
Pada proses pemaparanxulang ovalbumin diberikan ovalbumin 7% dalam
10ml normal salin melalui inhalasixmenggunakan nebulizer Omron.
4.6.8 Adaptasi
Aklimatisasi hewan coba dalam kandang yang diletakkan di tempat pemeliharaan tikus laboratorium Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang selama 7 hari dengan tujuan agar tikus menyesuaikan diri terhadap lingkungan yang baru.
4.6.9 Proses anestesi danxpembedahan
Pada tahap ini dilakukan denganxmemasukkan hewan coba ke dalam toples
kaca yang didalamnya telah diletakkan kapas yang mengandung kloroform. Pembiusan dilakukan satuxpersatu dengan harapan pembiusan dapat dilakukan
Selanjutnya, ketika hewan coba sudah teranastesi yang ditandai dengan tidak adanya respon nyeri, kemudian di euthanasia dengan metode cervical dislocation. Selanjutnya tikus diletakkan pada meja paraffin dan keempat kaki tikus difiksasi menggunakan jarum pentul. Setelahxitu dilakukan proses pembedahan.
4.7 Pembuatan SediaanxHistopatologi Paru Tikus
Cara pembuatanxsediaan histopatologi paru:
1. Tikus dibius menggunakan kloroform.
2. Toraks tikus dibedah untuk mengambil paru tikus.
3. Irisan paru diletakkan pada tabung organ dan difiksasi dengan formalin 10 % selama 1 hari.
4. Melakukan dehidrasixdengan merendam pada alkohol bertingkat, yaitu
pada konsentrasi 30%, 50%, 70%, 85%, 95%, dan 2 kali alkohol absolut masing-masing selama 30 menit.
5. Melakukan clearing dengan menggunakan alkohol dan xilol sebanyak 2 kali selama 1 jamxdengan perbandingan xilon : parafin (3:1, 1:1, 1:3)
dengan menggunakan xilol murni sebanyak 2 kali masing-masing selama 60 menit.
6. Melakukan proses infiltrasi dengan xilon dan parafin dengan perbandingan xilon:parafin (3:1, 1:1, 1:3) danx2 kali xilon murni pada
suhu 46º- 25º masing-masing selama 24 jam.
7. Dilakukan blocking dengan parafin keras pada suhu 46º- 25º selama 60 menit.
8. Memotong paru dengan mikrotom yang berukuran 3-5 milimikron dan potonganxdirekatkan pada kaca objek.
9. Memanaskan pada suhu 46º- 25º didalam inkubator selama 24 jam. 10. Melakukan deparafinisasi yaitu denganxperendaman xilol sebanyak 2
kali, serta merendam dalam alkohol absolut 30%, 50%, 70%, 85%, 95% dan H2O masing-masing selama 3 menit.
11. Melakukan pewarnaan hematoxilin eosin dengan langkah-langkah sebagaixberikut :
- Pemberian Hematoxilin selama 15 detik - Eosin staining selama 15-20 menit
- Dehidrasi pada alkohol bertingkat 50%, 70%, 85%, 95% dan 2 kali alkohol absolut
- Pemberian xilol selama 5 menit
- Mounting menggunakan perekat entelan
- Panaskan pada suhu 46º- 25º didalam inkubator selama 24 jam 4.8 Penguburan Hewan Coba
Tikus yang telah diberi perlakuanxakan diteliti dipastikan mati, bangkai
tikus diletakkan dalam wadah baskom. Bangkai tikus percobaan dikubur di tanah dengan kedalaman 50cm danxluas lubang 0, 25m². Setiap lubang hanya digunakan
untuk mengubur 10 tikus secara bersama. Lubang ditutup kembali dengan tanah lalu lubang dipadatkan agar tidak tercium bauxdari bangkai tikus tersebut.
4.9 Pengamatan Sediaan Histopatologi Paru Tikus
Jumlah eosinofil tikus jantan (Rattus norvegicus) diamati dengan menggunakanxmikroskop cahaya dengan perbesaran 400x untuk mengamati
peribronkhial paru di lima lapangan pandang, dan konfirmasi dengan perbesaran 1000x untuk identifikasi eosinofil.
4.10 Alur Penelitian
Diberi pakan standar BR-1 (40gram) dan airxminum.
Diberi ekstrak bawang merah 7mg/2ml melalui sonde Diberi ekstrak bawang merah 14mg/2ml melalui sonde Diberi ekstrak bawang merah 28mg/2ml melalui sonde -Diberi pakanxstandar BR-1 (40 gram) dan air minum. -Pada hari ke-19 sampaixke-22 diberi ovalbumin 7%
dalam 10 ml normal salin dengan menggunakan nebulizer selama 30 menit per hari.
Diberixpaka n standar BR-1 (40 gram) dan air minum. -Diberi pakan standar BR-1 (40 gram) dan airxminum -Pada hari ke-1,
ke-7 dan ke-14 diinduksi ovalbumin 70 µg dan 14 mg Al(OH)3 dalam 1,4 cc normal salinxsecara i.p
-Diberi pakan standar BR-1 (40 gram) dan airxminum
-Pada hari ke-1, ke-7 dan ke-14 diinduksi ovalbumin 70 µg dan 14 mg Al(OH)3 dalam 1,4 cc normal salinxsecara i.p Adaptasixhewan coba
Pengelompokan
Kontrol (n) Kontrol (+) Perlakuan 1 Perlakuan 2 Perlakuan 3
Perlakuan 1 Perlakuan 2 Perlakuan 3
Ha ri 1 -14 Ha ri 15 -22 Prosedur Pembedahan Pengambilan organ Paru - Paru
Pembuatan sediaan paru dengan hematoxilin eosin (HE) Setelah tikus dibedah dan denyutxnadi sudah berhenti. Tikus dikumpulkan dan dimasukkan polybag danxdimasukkan kedalam
lubang tanah kering dengan kedalaman 1 m dan jarak 250 m dari sumber air serta masing-masing lubang tidak lebih dari 10 ekor tikus.
Pengamatan sediaan Analisis Data
Menggunakan uji normalitas, homogenitas, One Way ANOVA, uji post
4.11 Analisis Data
Data-data penelitian dianalisis menggunakan uji normalitas, uji homogenitas, uji One Way ANOVA, uji post hoc Bonferroni, dan uji T yang pengolahannya menggunakan aplikasi SPSS 23 for windows.
a. Uji One Way ANOVA
Uji One Way ANOVA digunakan untuk membuktikan adanya perbedaan antara kontrol positif dengan perlakuan (diberikan ekstrak dosis 7mg/hari, 14mg/hari, 28mg/hari) terhadap jumlah sel eosinofil. Hasil uji ANOVA dikatakanxmemiliki perbedaanxyang cukup
bermaknaxjika hasil dari nilai (sig) <0,05. Sebelumxdilakukan uji
ANOVA wajib dilakukan uji normalitas danxhomogenitas.
b. Uji Post Hoc Bonferroni
Uji Post Hoc Bonferroni merupakanxuji setelah dari ujixOne Way
ANOVA, digunakanxuntukxmengetahui apakah ada perbedaan
yangxbermakna antara 2xkelompok dalamxperlakuan, dengan syarat
jikaxvarian data yang didapatkan adalah homogen. Jikaxvarien data
yang didapat tidakxhomogen maka menggunakanxuji post
hocxTamhane.
c. Uji Test T
Uji T merupakan uji yang dilakukan setelah post hoc bonferroni untuk mengetahui dosis mana yang bisa menurunkan kadar eosinofil ke jumlah normal pada pulmo tikus putih jantan dengan cara membandingkan kelompok normal dengan dosis terkecil. Dosis dikatakan dapat menurunkan kadar eosinofil jika hasil dari nilai (sig) <
0,05. 4.12 Jadwal Penelitian Tabel 4. 3 Jadwal Penelitian
No Jenis Kegiatan Bulan 1 2 3 4 1 Pengurusan Izin 2 Persiapan perasan buah apelxdan hewan coba 3 Adaptasi hewan, memberixmakan hewan coba 5
Perlakuan injeksi i.p ovalbuminxpada hewan coba
6
Pemberian minuman sari apel kextikus coba
7 Pengamatanxhewan coba pasca perlakuan 8 Pengumpulan data
9 Dilakukan analisis jumlahxsel eosinofil 11 Analisis Data 12 Konsultasi dan revisi
