BAB 4
METODE PENELITIAN
4.1. Jenis Penelitian
Jenis penelitian yang digunakan adalah penelitian eksperimental laboratoris.
4.2. Tempat Penelitian
1. Identifikasi tumbuhan dilakukan di Laboratorium Biologi Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga Surabaya.
2. Pembuatan ekstrak liquid daun kenikir dilakukan di Unit Layanan Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Airlangga Surabaya.
3. Pembuatan kultur jaringan dan penelitian uji sitotoksisitas dilakukan di laboratorium Pusat Veterinaria Farma (PUSVETMA) Surabaya.
4.3. Sampel Penelitian
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah sumuran yang berisi sel fibroblas BHK-21 sejumlah 2x105 sel. Penentuan banyaknya sampel diperoleh dengan menggunakan rumus sebagai berikut (Lemeshow, 1990):
n = 4,9 ≈ 5
Keterangan:
n = besar sampel
= harga standard δ = standard deviasi
d = penyimpangan yang dapat ditolerir
Dari penghitungan sampel yang dilakukan didapatkan hasil sampel minimal yang dibutuhkan sebesar lima. Dalam penelitian ini digunakan enam sampel pada masing-masing kelompok penelitian.
4.4. Unit Analisis
Unit analisis yang digunakan dalam penelitian ini berupa kultur sel fibroblas BHK- 21.
4.5. Identifikasi Variabel Penelitian 4.5.1. Variabel Bebas
Variabel bebas dari penelitian ini adalah ekstrak liquid daun kenikir dengan konsentrasi 6,25 mg/ml, 12,5 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml, dan 100 mg/ml (Rasdi et al., 2010).
4.5.2. Variabel Terkendali
Variabel terkendali dari penelitian ini adalah alat, bahan, dan metode kerja.
4.5.3. Variabel Terikat
Variabel terikat dari penelitian ini adalah jumlah sumuran yang berisi sel fibroblas BHK-21 yang hidup dan yang mati pada kultur sel setelah pengujian.
4.6. Definisi Operasional
4.6.1. Ekstrak Liquid Daun Kenikir
Ekstrak liquid daun kenikir adalah hasil dari penyaringan dan rangkaian proses laboratoris dengan metode maserasi (menggunakan pelarut etanol) hingga didapatkan ekstrak murni berupa liquid kental yang selanjutnya dilakukan pengenceran dari konsentrasi 100 mg/ml menjadi, 50 mg/ml, 25 mg/ml, 12,5 mg/ml, dan 6,25 mg/ml.
4.6.2. Uji Sitotoksisitas
Sitotoksisitas adalah kematian sel yang terjadi oleh karena paparan ekstrak liquid daun kenikir pada kultur sel fibroblas BHK-21 dan diamati menggunakan MTT-assay serta dihitung dengan ELISA reader yang menunjukkan warna biru keunguan (formazan).
4.6.3. Tingkat Sitotoksisitas
Tingkat sitotoksisitas dihitung melalui perbandingan jumlah sel fibroblas BHK-21 yang hidup dengan sel yang mati dengan memakai standard IC50.
4.6.4. Sel Hidup
Sel yang hidup adalah sel fibroblas BHK-21 yang dapat menghasilkan warna biru keunguan (formazan) setelah paparan ekstrak liquid daun kenikir dan pemberian MTT. Persentase sel yang hidup dibaca dengan ELISA reader.
4.7. Alat dan Bahan 4.7.1. Alat
Alat – alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut:
1. Nampan aluminium, 2. timbangan digital, 3. blender,
4. kertas saring,
5. mesin rotary evaporation, 6. botol Roux,
7. mikroskop inverted, 8. TC plate 96-sumuran, 9. 5% CO2 incubator 10. BSC,
11. shaker, 12. tabung reaksi, 13. oven,
14. timbangan analitik, 15. timer,
16. kamera digital,
17. mikro pipet multichannel/single, 18. ELISA reader,
19. sterilitator ultraviolet.
4.7.2. Bahan
Bahan – bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut:
1. Daun kenikir yang diambil dari Perkebunan Desa Jarak, Kabupaten Kediri, dan sudah diidentifikasi di Laboratorium Biologi Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga Surabaya,
2. etanol 96%, 3. aquadest steril, 4. kultur sel BHK-21, 5. media Eagle
6. larutan FBS 10%, 7. larutan PBS,
8. larutan Trypsine Versene, 9. MTT-assay,
10. DMSO.
4.8. Cara Kerja
4.8.1. Sterilisasi Alat dan Bahan yang Digunakan
Semua alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini disterilkan dengan autoclave. Sterilisasi dengan autoclave pada suhu 1210 C selama 15 menit.
4.8.2. Pembuatan Ekstrak Liquid Daun Kenikir
1. Bahan ekstrak yang digunakan dalam penelitian ini adalah 1 kg daun kenikir yang sudah dikeringkan dalam oven pada suhu 600 C selama 24 jam.
2. Daun kenikir yang sudah kering selanjutnya dihaluskan dengan blender dan diayak sehingga didapatkan serbuk.
3. Serbuk lalu ditimbang sebanyak 150 gram.
4. Serbuk kemudian direndam dengan etanol 96% sebanyak 2,25 liter selama 5 hari dan terlindung dari cahaya sambil diaduk berulang-ulang.
5. Dilakukan penyaringan dan hasil saringan disuling pada tekanan rendah (untuk membebaskan pelarut etanol dalam ekstrak) dengan mesin rotary evaporation pada suhu kurang dari 500C selama 3 jam hingga didapatkan ekstrak yang kental (Salma et al., 2012)
4.8.3. Persiapan Kultur Sel
1. Persiapan dilakukan di dalam BSC. Kultur BHK-21 dalam bentuk monolayer dengan Media Eagle dan FBS 10% ditanam dalam botol kultur roux, kemudian dinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam
2. Sel yang telah penuh, dipanen, lalu dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali yang bertujuan untuk membuang sisa serum yang tersisa. Setelah itu ditambahkan Trypsine Versene untuk melepaskan sel dari dinding botol dan memisahkan ikatan antar sel agar tidak menggerombol. Kultur sel dalam botol roux diganti dengan Media Eagle yang baru.
3. Kultur sel yang sudah diganti dengan media baru dibagi dalam TC-plate 96 well sesuai dengan jumlah sampel dan kontrol. Masing-masing sumuran berisi 2 x 105 sel fibroblas dengan rincian yang terdiri dari 30 sumuran yang terdapat 2 x 105 kultur sel yang akan diberi paparan ekstrak liquid daun kenikir, 6 sumuran berisi sel dan media yang berfungsi sebagai kontrol positif, dan 6 sumuran berisi media saja yang berfungsi sebagai kontrol negatif, sehingga keseluruhan sumuran yang dipakai adalah 42 sumuran.
4. Selanjutnya plate diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C (CCRC, 2012).
4.8.4. Pengenceran Ekstrak Liquid Daun Kenikir
1. Penimbangan ekstrak liquid daun kenikir dilakukan hingga diperoleh kadar 1000 mg. Setelah ditimbang, ekstrak liquid daun kenikir dipindahkan ke BSC untuk dilakukan pengenceran.
2. Konsentrasi 100 mg/ml diperoleh dengan mengambil sejumlah 1000 mg dari ekstrak dan dilarutkan dengan aquadest steril 10 cc.
3. Konsentrasi 50 mg/ml diperoleh dengan mengambil sejumlah 5 cc ekstrak dengan konsentrasi 100 mg/ml dan dilarutkan dengan aquadest steril 5 cc.
4. Konsentrasi 25 mg/ml diperoleh dengan mengambil sejumlah 5 cc ekstrak dengan konsentrasi 50 mg/ml dan dilarutkan dengan aquadest steril 5 cc.
5. Konsentrasi 12,5 mg/ml diperoleh dengan mengambil sejumlah 5 cc ekstrak dengan konsentrasi 25 mg/ml dan dilarutkan dengan aquadest steril 5 cc.
6. Konsentrasi 6,25 mg/ml diperoleh dengan mengambil sejumlah 5 cc ekstrak dengan konsentrasi 12,5 mg/ml dan dilarutkan dengan aquadest steril 5 cc (Salma et al., 2012; CCRC, 2012)
4.8.5. Persiapan Sampel
1. Daun kenikir yang sudah diekstrak, disterilkan dalam sinar Ultra Violet selama 1 jam sebelum dilakukan perlakuan.
2. TC-plate dikeluarkan dari inkubator, kemudian media yang ada dalam tiap sumuran, dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali.
3. Ekstrak liquid daun kenikir yang sudah diencerkan lalu dimasukkan dalam 30 sumuran yang berisi kultur sel pada kelompok penelitian konsentrasi 6,25 mg/ml, 12,5 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml, dan 100 mg/ml. Masing-masing sumuran berisi 150 μl. 6 sumuran pada kelompok kontrol sel diberi Media Eagle sebanyak 150 μl dan 6 sumuran pada kontrol media berisi hanya media Media Eagle sebanyak 150 μl. Untuk setiap perlakuan dibuat replikasi sebanyak 6 kali kemudian diinkubasi dalam inkubator CO2 5% selama 24 jam pada suhu 370C.
4. Setelah 24 jam, ekstrak liquid daun kenikir dan media dalam TC-plate dibuang lalu dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali kemudian ditambahkan Trypsine Versene agar sel yang menggerombol dapat terpisah dan lepas dari dinding sumuran (CCRC, 2012)
4.8.6. MTT-Assay pada Kultur Sel
1. 10 μl pereaksi MTT 5 mg/ml yang telah dilarutkan, ditambahkan dalam media sumuran.
2. Diinkubasi dalam inkubator selama 3 jam pada suhu 370C
3. Pelarut DMSO ditambahkan sebanyak 50 μl dan dimasukkan ke setiap sumuran.
4. Dilakukan shaking dengan kecepatan 30 rpm selama 5 menit.
5. Nilai densitas optik formazan dihitung dengan ELISA reader pada panjang gelombang 620 nm. Makin pekat warna yang dihasilkan menandakan tingginya nilai absorbsi dan semakin banyak jumlah selnya (CCRC, 2012).
4.9. Penghitungan
Penghitungan dilakukan menggunakan standard IC50 (Latha et al., 2010;
Naritasari, 2010; CCRC, 2012)
4.9.1. Persentase Sel Hidup
Persentase sel hidup dari penelitian ini dihitung dengan rumus sebagai berikut (Meizarini, 2005):
Keterangan:
% Sel hidup : persentase jumlah sel hidup setelah pengujian.
Perlakuan : nilai densitas optik formazan setiap sampel setelah pengujian.
Media : nilai densitas optik formazan pada kontrol media.
Sel : nilai densitas optik formazan pada kontrol sel.
4.9.2. Persentase Sel yang Mati
Persentase sel yang mati dihitung dengan rumus sebagai berikut
% sel mati = 100% - % sel hidup
4.10. Analisis Data
Data yang diperoleh ditabulasi kemudian dilakukan analisis menggunakan uji normalitas Kolmogorov-Smirnov dan dilanjutkan dengan uji One-way ANOVA dilanjutkan dengan Tukey High Significant Difference (HSD) untuk mengetahui signifikansi.
4.11. Alur Penelitian
