29
BAB IV
METODE PENELITIAN
4.1 Jenis dan Rancangan Penelitian
Rencana penelitian yang digunakan adalah penelitian true eksperimental,
dengan menggunakan post test only control group design. Metode yang dipakai
adalah difusi cakram dan dilusi tabung untuk mengetahui efek antimikroba ekstrak
daun papaya terhadap bakteri P. acnes. Metode dilusi tabung untuk menentukan
KBM. Sedangkan metode difusi cakram untuk menentukan KHM.
4.2 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan pada Bulan November 2019, di Laboratorium
Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang.
4.3 Populasi dan Sampel Penelitian
4.3.1 Populasi
Populasi dalam penelitian ini adalah bakteri P. acnes yang diperoleh
dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas
Muhammadiyah Malang.
4.3.2 Sampel
Sampel dalam penelitian ini adalah bakteri P. acnes yang diperoleh
dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas
Muhammadiyah Malang yang diambil dengan teknik sampling.
4.3.3 Teknik Sampling
Sampel dalam penelitian ini diambil dengan menggunakan Simple
4.3.4 Estimasi jumlah pengulangan
Penelitian menggunakan 8 kelompok perlakuan ekstrak daun pepaya
dan 2 kelompok kontrol sehingga ada 10 kelompok. Berdasarkan rumus
Federer berikut r adalah jumlah perlakuan dan t adalah jumlah pengulangan,
maka : (t-1) (r-1) ≥ 15 (t-1) (10-1) ≥ 15 9(t-1) ≥ 15 9t-9 ≥ 15 9t ≥ 15 + 9 9t ≥ 24 t ≥ 2, 67 ≈ 3
Berdasarkan rumus berikut t adalah jumlah kelompok dan r jumlah
pengulangan. Dari perhitungan diatas, diperlukan tiga kali perhitungan
sampel (Muntaha, et al., 2015).
4.4 Variabel Penelitian
4.4.1 Variabel bebas
Variabel bebas pada penelitian ini adalah ekstrak daun pepaya
(Carica papaya L.) menggunakan konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%,
4.4.2 Variabel tergantung
Variabel tergantung pada penelitian ini adalah zona hambat
pertumbuhan bakteri P.acnes yang dapat dilihat dari KHM dan jumlah
koloni bakteri yang dapat dilihat dari KBM.
4.5 Definisi Operasional
Tabel 4. 1 Definisi Operasional Variabel
No Variabel Definisi Operasional Cara
Pengukuran Indikator Penilaian Skala Variabel Bebas 1. Ekstrak daun papaya (Carica papaya L.)
Ekstrak daun pepaya muda yang berasal dari 3 lapis daun dari pucuk tanaman dengan metode ekstraksi maserasi dengan larutan etanol
96% kemudian
dilakukan penyaringan untuk memisahkan filtrat dari ampas kemudian diuapkan dengan rotatory evaporator sehingga dihasilkan ektrak daun pepaya muda yang bebas dari pelarut etanol 96%. Diekstrasi dan dimaserasi dengan etanol 96% lalu diuapkan dalam rotatory evaporator. Konsentrasi: 1. 100% 2. 50% 3. 25% 4. 12,5% 5. 6,25% 6. 3,125% 7. 1,56% 8. 0,78% 9. 0,39% 10. 0% Ordinal Variabel Terikat 2. Pertumbuhan P.acnes Pertumbuhan bakteri yang dilihat dengan menghitung jumlah koloni. Penghitungan dengan Colony Counter. Jumlah koloni pada media agar padat . Rasio
4.6 Alat dan Bahan Penelitian
Tabel 4. 2 Alat dan bahan identifikasi bakteri
Alat Bahan
Ose lurus, ose lengkung Isolat P.acnes
Minyak emersi Pewarnaan gram (Kristal, violet,
lugol,alkohol 96%, safranin)
Mikroskop Media pembenihan kosong : NAP
dan Nutrient Broth
Gelas objek Bahan tes katalase, koagulase
Lampu spirtus
Tabel 4.3 Alat dan bahan pembuatan ekstrak daun pepaya
Alat Bahan
Kain saring Simplisia daun pepaya muda
Tabung ekstraktor Etanol 96%
Pendingin spiral Aquades
Water pump Evaporator
Tabel 4. 4 Alat dan bahan pembuatan Nutrient Agar Plate
Alat Bahan
Labu Erlenmeyer Agar nutrient
Pengaduk kaca Aquades
Microwave Autoklaf
Cawan Petri 3. KBM (Kadar
Bunuh Minimal)
Konsentrasi minimal ekstrak daun papaya (Carica papaya L.) muda yang dapat membunuh bakteri ditandai dengan penurunan 99,9% koloni bakteri pada Nutrient Agar Plate.
Penghitungan dengan Colony Counter yang dibandingkan dengan kontrol bakteri. Jumlah koloni pada Nutrient Agar berjumlah kurang dari 0,1%. Rasio 4. KHM (Kadar Hambat Minimal) Konsentrasi minimal ekstrak daun papaya (Carica papaya L.) muda yang mampu menghambat
pertumbuhan bakteri P.acnes yang ditandai dengan terdapatnya zona inhibisi pada difusi cakram Metode difusi cakram yang dilihat zona inhibisi disekitar cakram Diameter zona inhibisi di sekitar cakram pada metode difusi cakram Rasio
Tabel 4. 5 Alat dan bahan pembuatan Nutrient Broth
Alat Bahan
Labu Erlenmeyer Beef ekstrak 3 gr
Tabung reaksi Bacto peptone 5 gr
Kapas Aquades 1000 cc
Autoklaf
Tabel 4. 6 Alat dan bahan pembuatan Mueller Hinton Agar
Alat Bahan
Labu Erlenmeyer Cawan petri
Tabung reaksi MHA
Kapas Aquades 1000 cc
Autoklaf
Tabel 4. 7 Alat dan bahan uji kepekaan ekstrak daun pepaya
Alat Bahan
Tabung reaksi steril Perbenihan cair bakteri
Mikropipet 1 ml Ekstrak daun papaya muda
Lampu spirtus Nutrient broth
Vortex Medium (Nutrient Agar Plate)
Colony counter Ose lengkung Inkubator Label Spektrofotometer Neraca analitik 4.7 Prosedur Penelitian 4.7.1 Sterilisasi alat
a. Mencuci alat yang akan digunakan menggunakan sabun hingga bersih
dan kering.
b. Alat-alat dibungkus dengan kertas dan disterilisasi menggunakan
autoklaf pada suhu 1210C dan tekanan 15 atm selama 15
disterilisasi menggunakan alcohol 70% selama 20 menit (Hafsan &
Masri, 2015).
4.7.2 Ekstraksi daun pepaya
a. Simplisia daun papaya muda yang terletak di bagian pucuk tanaman
diperoleh dari Kota Batu.
b. Simplisia dimaserasi menggunakan pelarut etanol 96% dan direndam
dalam etanol selama 24 jam.
c. Filtrat daun pepaya dipekatkan dengan menggunakan vacuum rotatory
evaporator dan didapatkan ekstrak kental (Sari, et al., 2016).
4.7.3 Identifikasi bakteri P.acnes ( Bukti identifikasi bakteri bisa dilihat
dilampiran)
4.7.3.1 Pewarnaan gram
Sampel bakteri P.acnes berdasarkan penelitian Dewi, 2013,
diidentifikasi dengan pewarnaan gram. Cara melakukan pewarnaan Gram:
a. Ambil satu ose aquades steril diteteskan pada gelas objek, kemudian
diambil sedikit bakteri dan dibuat hapusan setipis mungkin,
dikeringkan dan difiksasi di atas spirtus.
b. Preparat ditetesi dengan karbol gentian violet selama 2 menit dan
warna dibuang.
c. Teteskan lugol dan tunggu selama 1 menit.
d. Kemudian, preparat dilunturkan dengan alkohol 96% dan biarkan 1
e. Cuci preparat dengan aquades dan beri pewarna fuschine selama 2
menit dan bilas dengan aquades.
f. Keringkan dan amati morfologi sel dan warna di mikroskop.
g. Bakteri P.acnes termasuk bakteri gram positif karena selnya
berwarna ungu (Dewi , 2013).
4.7.3.2 Uji Katalase
a. Sediakan isolate bakteri di atas gelas objek
b. Teteskan larutan H2O2 dengan konsentrasi 3% diatasnya
c. Bakteri P.acnes menunjukkan hasil positif yang berarti bakteri
membentuk katalase yang ditandai dengan timbulnya
gelembung-gelembung udara (Thahirah , 2016).
4.7.3.3 Uji Koagulase
a. Teteskan aquades atau Nacl fisiologis pada gelas objek
b. Lalu suspensikan 1 ose biakan P.acnes
c. Teteskan 1 tetes plasma kemudian aduk hingga tercampur dan
goyangkan
d. Reaksi positif terjadi apabila dalam waktu 2-3 menit terbentuk
presipitat granuler (Dewi, 2013).
4.7.4 Pembuatan medium Nutrient Agar Plate
a. Menimbang agar nutrient 7,25 gram dan dimasukan ke dalam labu
erlenmeyer
b. Tambahkan aquades hingga volume menjadi 250 cc dan diaduk
c. Rebuslah larutan agar sampai agar nutrient campur merata selama
10 menit
d. Larutan yang telah direbus disterilisasi menggunakan autoklaf
pada suhu 1210C selama 15 menit
e. Tunggu hingga suhu menjadi lebih dingin sekitar 40-450C
f. Tuangkan larutan yang telah disterilisasi ke dalam masing-masing
cawan petri sebanyak 20 cc
g. Larutan dibiarkan hingga memadat (Narulita, 2017).
4.7.5 Pembuatan Nutrient brooth
Tujuan dari pembuatan nutrient brooth adalah untuk pembiakan dan
pengenceran konsentrasi bakteri dan pengenceran konsentrasi larutan antara
ekstrak daun papaya dengan bakteri, dengan langkah sebagai berikut:
a. Pembuatan media NB dilakukan dengan cara menimbang sebanyak 3.25
gram NB. Kemudian dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer
b. Tambahkan dengan 250 ml aquades. NB dan aquades dalam labu
erlenmeyer dipanaskan dengan menggunkan hotplate selama ±10 menit
hingga NB larut.
c. Media yang telah homogen disterilisasi di dalam autoklaf selama 15 menit
pada suhu 121°C (Narulita, 2017).
4.7.6 Pembuatan Mueller Hinton Agar
a. Larutkan 38 gram MHA dalam 1 L akuades kemudian dipanaskan dan
b. Sterilkan media dengan mengguanakan autoklaf pada suhu 1210C,
tekanan 1,5 atm dan selama 15 menit.
c. Setelah disterilisasi dimasukkan ke dalam cawan petri sebanyak 15 ml
yang akan digunakan sebagai medium dalam uji antibakteri (Hudaya, et
al., 2014).
4.7.7 Pembuatan Suspensi Bakteri 106 bakteri/ml
Suspensi bakteri P.acnes yang akan digunakan dalam penelitian ini
adalah bakteri dengan kepadatan 106 bakteri/ml. Pembuatan suspensi
bakteri tersebut distandarisasi dengan menggunakan metode Mc. Farland 1
yaitu setara dengan kepadatan bakteri 108 bakteri/ml.
Pembuatan suspensi bakteri 106 bakteri/ml bisa melalui
langkah-langkah berikut:
a. Ambil 4-10 ose bakteri dari media NAP yang telah diinkubasi selama
24 jam, dimasukkan ke dalam tabung yang berisi aquadest, kemudian
dihomogenkan. Suspensi bakteri tersebut disetarakan kekeruhannya
dengan larutan standar Mc Farland 1, sehingga menjadi suspensi bakteri
dengan kepadatan 108 bakteri/ml.
b. Ambil 1 ml suspensi bakteri dengan kepadatan bakteri 108 bakteri/ml
tersebut, dan masukkan ke dalam tabung yang telah diisi 9 ml aquadest.
Kepadatan bakteri sekarang menjadi 107 bakteri/ ml.
c. Ambil lagi 1 ml suspensi bakteri dengan kepadatan bakteri 107
ml NB. Kepadatan bakteri sekarang menjadi 106 bakteri/ ml (Munfaati,
2015).
4.7.8 Uji kepekaan ekstrak daun pepaya terhadap P.acnes
4.7.8.1 Metode dilusi tabung
Uji kepekaan ekstrak daun papaya terhadap kuman P.acnes dengan
cara sebagai berikut :
Hari ke-1 :
a. Sediakan 10 tabung steril dan ditandai dengan tabung 1, tabung 2,
tabung 3, tabung 4, tabung 5, tabung 6, tabung 7, tabung 8, tabung 9
dan tabung 10. Masing – masing diberi perlakuan ekstrak daun pepaya
8 konsentrasi yang berbeda dan 2 tabung kontrol (kontrol ekstrak dan
kontrol bakteri).
b. Masukkan 1 ml nutrient broth pada tabung 3, 4, 5,6,7,8,9 dan 2 ml
ekstrak daun pepaya pada tabung 1 serta 2 ml bakteri pada tabung 10.
c. Memasukkan masing – masing 1 ml ekstrak (tabung 1) ke dalam tabung
3 dan 4. 2 ml ekstrak daun pepaya 1 ml nutrient broth 2 ml Propionibacterium acnes
2 3 2 3
d. Campur hingga rata nutrient broth dengan ekstrak daun pepaya pada
tabung 3, kemudian pindahkan 1 ml ke dalam tabung 4.
3 4 3 4
e. Lakukan hal yang sama terhadap tabung 4, 5, 6, 7, 8 dan 9.
f. Pada tabung 9 setelah larutan tercampur rata dibuang 1 ml.
g. Dari pengenceran diatas, maka konsentrasi awal antimikroba dari
masing – masing tabung adalah :
100% 50% 25% 12,5% 6,25% 3,125% 1,56% 0,78%
Setelah itu tabung 2 sampai 9 ditambahkan dengan perbenihan cair
bakteri 1 ml dan menambahkan 2 ml ekstrak pada tabung 1.
h. Dengan demikian, volume masing – masing tabung menjadi 2 ml
sehingga konsentrasi akhir antimikroba berubah seperti berikut ini :
Konsentrasi ekstrak daun pepaya :
Tabung 3 1 ml (50%) Tabung 4 2 ml (25%)
Konsentrasi ekstrak daun pepaya :
Tabung 2 1 ml (100%) Tabung 3 2 ml (50%)
100% 50% 25% 12,5% 6,25% 3,125% 1,56% 0,78% 0,39% 0%
Kemudian semua tabung diinkubasikan ke dalam inkubator pada suhu 37oC
selama 18-24 jam.
Hari ke-2
Pada hari ke-2 tabung dikeluarkan dari inkubator, didapatkan KHM
dengan cara melihat kejernihan tabung. Tingkat kejernihan tabung dinilai
sebagai berikut :
1= jernih ( berwarna sama dengan nutrient brooth)
2= keruh ( belum beerwarna sama dengan nutrient brooth)
Kemudian dari masing – masing tabung diambil 1 ose dan
diinokulasikan pada medium NAP. Lalu diinkubasikan lagi 18-24 jam pada
suhu 37oC.
Hari ke-3
NAP dikeluarkan dari inkubator lalu dilakukan pengamatan
kuantitatif pada masing-masing konsentrasi dengan cara menghitung
jumlah dari koloni bakteri dengan menggunakan colony counter sehingga
4.7.8.2 Metode difusi cakram
Uji kepekaan ekstrak daun pepaya terhadap P.acnes metode difusi cakram
sebagai berikut :
a. Untuk pembuatan konsentrasi awal siapkan tabung 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,
9, 10 tanpa tabung kontrol kuman
b. Lakukan pengenceran ekstrak dengan cara seperti metode dilusi tabung
mulai dari tahap b, c, dan d.
c. Lakukan hal yang sama terhadap tabung 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10.
d. Pada tabung 10 setelah tercampur rata, larutan dibuang sebanyak 1 ml,
dari pengenceran diatas maka konsentrasi ekstrak dari masing-masing
tabung adalah :
100% 50% 25% 12,5% 6,25% 3,125% 1,56% 0,78% 0,39% e. Siapkan MHA yang sudah di streaking bakteri P.acnes.
f. Tempelkan 9 disk blank pada cawan MHA, jarak disk blank dengan tepi
plate tidak kurang dari 15 mm dan jarak disk blank dengan tepi disk
blank lainnya tidak kurang 24 mm.
g. Tetesi 9 disk blank dengan masing-masing konsentrasi (100%, 50%,
h. Diamkan 3 menit agar konsentrasi meresap kedalam cakram.
i. Kemudian cawan diinkubasi ke dalam inkubator selama 18-24 jam
dengan suhu 300C.
j. Setelah diinkubasi, tentukan KHM dari ekstrak daun pepaya dengan
melihat zona inhibisi terendah pada cakram dengan cara diameter
4.8 Alur penelitian
4.8.1 Metode Dilusi
Gambar 4. 1 Skema alur penelitian dilusi tabung Volume menjadi 2 ml dan konsentrasi menjadi
12,5% 6,25%
25% 3,125% 1,56% 0,78% 0,39%
Identifikasi bakteri P.acnes (bisa dilihat di lampiran)
Pengenceran larutan ekstrak daun pepaya dalam tabung dengan 8
konsentrasi, @ 1 ml Ekstrak daun pepaya muda (Carica papaya l.)
50%
Penambahan 1 ml bakteri pada masing-masing tabung konsentrasi ekstrak daun pepaya
Inkubasi 18-24 jam, 370C
Inkubasi 18-24 jam, 370C
Kekeruhan yang telah terjadi diamati dan dibandingkan dengan kontrol positif (kontrol bahan), kemudian tentukan KHM
Penggoresan pada NAP pada setiap tabung dengan konsentrasi yang berbeda beda
Hitung jumlah koloni dan tentukan KBM 100%
Analisis hasil
4.8.2 Metode Difusi Cakram
Gambar 4. 2 Skema alur penelitian difusi cakram Cawan NAP yang sudah di
streaking bakteri P. acnes
Menempelkan kertas cakram pada cawan
Pembuatan ekstrak daun pepaya muda
Pengenceran larutan ekstrak daun papaya dalam tabung
dengan 9 konsentrasi
Meneteskan pada kertas cakram sebanyak 10µl
Inkubasi selama 18-24 jam dengan suhu 300C
Menentukan KHM dengan mengamati zona inhibisi terendah
4.9 Analisis Data
Pada penelitian ini, data yang akan dianalisis yaitu jumlah koloni P.acnes
yang tumbuh pada NAP berdasarkan tingkat konsentrasi ekstrak daun papaya
(Carica papaya L.).
1. Uji normalitas dilakukan menggunakan uji Saphiro – Wilk (n < 50) untuk
mengetahui apakah kelompok data penelitian terdistribusi normal atau tidak
normal. Distribusi data normal jika p > 0,05.
Namun, jika pada penelitian ini data terdistribusi tidak normal (p < 0,05) dilakukan
transformasi data agar distribusi data menjadi normal. Lalu dilakukan uji normalitas
kembali sehingga data menjadi terdistribusi normal. Jika data hasil transformasi
tidak terdistribusi normal, maka pilih uji nonparametrik yaitu Kruskal-Wallis dan
lanjut dengan uji Post Hoc Mann-Whitney.
2. Jika data terdistribusi normal dilanjutkan dengan menggunakan uji homogenitas
Levene untuk mengetahui varian data termasuk sama atau homogen. Varian data sama atau homogen bila sig > 0 ,05.
3. Jika data termasuk sebaran normal dan varian data sama. Lakukan uji one way
ANOVA lalu Post Hoc Bonferroni. Namun, jika varian data tidak sama, maka
