SIMULASI PENAMBATAN MOLEKULER DAIDZEIN PADA
RESEPTOR ESTROGEN ALFA
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh:
Astuti Malyawati Soesanto
NIM: 108114180
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
iv
HALAMAN PERSEMBAHAN
"Tidak semua yang kalian inginkan harus terjadi seketika. Kita tidak
hidup di dunia dongeng. Bahkan banyak orang di luar sana harus
berjuang mati-matian untuk mewujudkan satu keinginan kecil.
Bersabarlah."
Tere Liye
Kupersembahkan buah karyaku ini untuk:
Mom and Dad, the first man and woman in my live
Cita dan cintaku pada negeri ini
Sanata Dharma, almamaterku tercinta
Dan
Rasa syukur yang tak akan ada habisnya untuk
Tuhan ku Yesus Kristus
Dialah yang membuat segalanya menjadi mungkin
vi
PRAKATA
Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas penyertaan dan kasih
setia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang
berjudul “Simulasi
Penambatan Molekuler Daidzein pada Reseptor Estrogen Alfa” sebagai salah satu
syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.).
Dalam penyusunan skripsi ini penulis mendapat banyak bantuan berupa
bimbingan, saran, dan dukungan dari berbagai pihak. Untuk itu pada kesempatan
ini penulis menyampaikan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada:
1.
Enade Perdana Istyastono, Ph.D., Apt. selaku dosen pembimbing yang
telah memberikan pengetahuan yang berharga melalui pengarahan,
bimbingan, dan pendampingannya dalam pengerjaan skripsi ini.
2.
Agustina Setiawati, M.Sc., Apt. selaku dosen pembimbing pendamping
yang telah banyak membantu dan memberikan masukan selama
penyusunan skripsi.
3.
Mama, Papa, dan Adik-adikku yang senantiasa memperhatikan, memberi
dukungan, dan selau mendoakan suksesnya penyusunan skripsi ini.
4.
Ka Dika dan Chris yang senantiasa membantu memecahkan masalah.
5.
Kenny dan Chandra, teman sekelompokku, yang selalu berbagi segala
informasi selama penyusunan skripsi ini.
6.
Mas Otok selaku laboran di Laboratorium Virtual yang selalu menyiapkan
alat-alat yang dibutuhkan selama pengumpulan data.
vii
8.
Teman-teman SERAMS, teman seperjuanganku yang telah menemani dari
awal perkuliahan sampai selesainya skripsi ini.
9.
Teman-teman FST B 2010, teman sekelasku yang selalu menyemangati
dalam penyusunan skripsi ini.
10.
Teman-
teman PELMAT, teman se”geng”ku yang selalu mendoakan
suksesnya skripsi ini.
11.
Semua pihak yang telah membantu dan memberikan kontribusi selama
penyusunan skripsi ini.
Akhir kata, penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih jauh
dari sempurna, mengingat penulis memiliki keterbatasan pengetahuan dan
pengalaman. Oleh karena itu, saran dan kritik yang membangun sangat
diharapkan oleh penulis. Semoga karya ini dapat bermanfaat bagi perkembangan
penelitian kimia komputasi.
ix
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL...
i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING...
ii
HALAMAN PENGESAHAN...
iii
HALAMAN PERSEMBAHAN...
iv
HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI...
v
PRAKATA...
vi
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA...
viii
DAFTAR ISI...
ix
DAFTAR TABEL...
xii
DAFTAR GAMBAR...
xiii
DAFTAR LAMPIRAN...
xiv
DAFTAR SINGKATAN KATA...
xv
INTISARI...
xvi
ABSTRACT...
xvii
BAB I. PENDAHULUAN...
1
A.
Latar Belakang...
1
1.
Perumusan Masalah...
2
2.
Keaslian Penelitian...
2
3.
Manfaat Penelitian...
3
x
b.
Manfaat Praktis...
3
B.
Tujuan Penelitian...
3
1.
Tujuan Umum...
3
2.
Tujuan Khusus...
3
BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA...
4
A.
K
anker………..
4
B.
Kanker Payudara...
5
C.
Reseptor Estrogen (RE)...
7
D.
Daidzein...
9
E.
Kimia Komputasi...
10
F.
Penapisan Virtual (PV
)………..………..…..
11
G.
Sidik Jari Interaksi...
13
H.
Landasan Teori...
14
I.
Hipotesis...
15
BAB III. METODE PENELITIAN...
16
A.
Jenis dan Rancangan Penelitian...
16
B.
Variabel dan Definisi Operasional...
16
1.
Variabel Penelitian...
16
a.
Variabel Utama...
16
b.
Variabel Pengacau...
16
2.
Definisi Operasional...
16
C.
Kelengkapan Penelitian...
17
xi
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN...
21
A.
Penambatan Ulang 4-Hidroksi-tamoksifen...
21
B.
Analisis Hasil Penambatan Ulang 4-Hidroksi-
tamoxifen………
..
21
C.
Persiapan Per
lakuan Daidzein………
58
D.
Penambatan Daidzein………
.
58
E.
Analisa Statistik………
.
58
F.
Elusidasi Pose Ikatan Daidzein pada RE
α………
.
59
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN...
68
A.
Kesimpulan...
68
B.
Saran...
68
DAFTAR PUSTAKA...
69
LAMPIRAN...
74
xii
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel I.
Nilai RMSD 4-hidroksi-tamoxifen dari Tc-PLIF yang
disaring ikatan hidrogen dengan Asp351...
22
Tabel II.
Nilai RMSD 4-hidroksi-tamoxifen dari Tc-PLIF yang
tidak disaring ikatan hidrogen dengan Asp
351………..
30
Tabel III.
Nilai RMSD 4-hidroksi-tamoxifen dari ChemPLP yang
disaring ikatan hidrogen dengan Asp
351…………..…..
39
Tabel IV.
Nilai RMSD 4-hidroksi-tamoxifen dari ChemPLP yang
tidak disaring ikatan hidrogen dengan Asp
351……….
.
47
Tabel V.
Persentase nilai RMSD daidzein dari data Tc-P
LIF……
56
Tabel VI.
Persentase nilai RMSD daidzein dari d
ata ChemPLP….
56
Tabel VII.
Nilai median RMSD daidzein setiap kelompok yang
xiii
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1.
RE
α………...
8
Gambar 2.
Struktur senyawa d
aidzein………...
10
Gambar 3.
Diagram pengambilan k
eputusan………...
18
Gambar 4.
Diagram hasil pengambilan k
eputusan………
.
………...
57
Gambar 5.
Histogram sebaran nilai Tc-PLIF daidzei
n………...
59
Gambar 6.
Histogram sebaran nilai RMSD d
aidzein…………
..
.………..
60
Gambar 7.
Plot p
engelompokkan RMSD daidzein..………...
61
Gambar 8.
Pose 4-hidroksi-tamoxifen, daidzein kelompok 1, dan
daidzein kelompok 2 (A); 4-hidroksi-tamoxifen (B); Daidzein
kelompok 1 (C); dan daidzein kelompok 1 (D) pada
RE
α………
62
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1.
Script untuk melakukan penambatan daidzein dan
4-hidroksi-tamoxifen pada RE
α
dan sidik jari interaksi…...
74
Lampiran 2.
Script untuk melakukan perhitungan RMSD
4-hidroksi-tamoxifen untuk nilai ChemPLP yang disaring ikatan
hidrogen dengan Asp
351…………...
...
76
Lampiran 3.
Script untuk melakukan perhitungan RMSD
4-hidroksi-tamoxifen untuk nilai ChemPLP yang tidak disaring
ikatan hidrogen dengan Asp
351…………..…………...
...
77
Lampiran 4.
Script
untuk melakukan perhitungan RMSD
4-hidroksi-tamoxifen untuk nilai Tc-PLIF yang disaring ikatan
hidrogen dengan Asp351
……….…………...……..
78
Lampiran 5.
Script untuk melakukan perhitungan RMSD
4-hidroksi-tamoxifen untuk nilai Tc-PLIF yang tidak disaring ikatan
hidrogen dengan Asp
351………..
79
Lampiran 6.
Script untuk melakukan perhitungan RMSD daidzein
untuk nilai ChemPLP yang disaring ikatan hidrogen
xv
DAFTAR SINGKATAN KATA
ChemPLP
:
Chemical Piecewise Linear Potential
DUD
:
Directory of Useful Decoys
DMBA
:
7, 12
–
Dimethylbenz (a) anthracene
EF1%
:
Enrichment Factor 1%
ERα
:
Estrogen Receptor Alpha
MCF-7
:
Michigan Cancer Foundation-7
PDB
:
Protein Data Bank
PLANTS
:
Protein-Ligand ANT System
PVBL
:
Penapisan Virtual Berbasis Ligan
PVBS
:
Penapisan Virtual Berbasis Struktur
PyPLIF
:
Python-based Protein-Ligand Interaction Fingerprint
RE
:
Reseptor Estrogen
REα
:
Reseptor Estrogen alfa
REβ
:
Reseptor Estrogen beta
RMSD
:
Root Mean Square Distance
SBVS
:
Structure Based Virtual Screening
SJI
:
Sidik Jari Interaksi
Tc
:
Tanimoto coefficient
Tc-PLIF
:
Tanimoto coefficient Protein-Ligand Interaction Fingerprint
WHO
:
World Health Organization
xvi
INTISARI
Kanker payudara adalah penyakit kanker yang terjadi pada sel-sel payudara
dan 60% kanker payudara terdeteksi sebagai kanker dengan reseptor estrogen alfa
(RE
α)
positif. Senyawa-senyawa alam yang terbukti aktif sebagai antagonis RE
α
telah banyak dilaporkan. Daidzein adalah salah satu senyawa alam kelompok
fitoestrogen yang telah terbukti secara in vivo mampu menghambat proliferasi sel
kanker payudara. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan simulasi penambatan
molekuler daidzein pada RE
α dan melihat interaksi
nya dalam kantung ikatan RE
α
secara in silico.
Penelitian ini memanfaatkan perkembangan kimia komputasi (metode
in
silico)
yang mempunyai berbagai keuntungan dalam menemukan obat baru.
Metode yang digunakan adalah identifikasi
sidik jari interaksi dengan perangkat
lunak
Python-based Protein-Ligand Interaction Fingerprint (PyPLIF) yang telah
terbukti dapat meningkatkan kualitas Penapisan Virtual Berbasis Struktur (PVBS)
dalam proses validasi retrospektif untuk identifikasi ligan bagi RE
α.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa protokol yang dikembangkan Radifar
et al. (2013) tidak dapat mengenali daidzein sebagai ligan RE
α dan
protokol
tersebut tidak dapat digunakan untuk elusidasi moda ikatan daidzein karena tidak
mampu mereproduksi moda ikatan ligan kokristal yang digunakan. Dalam
elusidasi moda ikatan yang menggunakan protokol PVBS tanpa identifikasi sidik
jari interaksi, ditemukan setidaknya dua pose ikatan daidzein pada RE
α.
xvii
ABSTRACT
Breast cancer is cancer which happened in breast cells and about 60% of
breast cancers are detected as estrogen reseptor
alpha (ERα) positive cancer.
There are active natural compounds that have bee
n reported as ERα
antagonist.
Daidzein, one of phytoestrogen that has been proven in
in vivo
studies could
inhibit breast cancer cells proliferation. The purposes of this study are to simulate
molecular docking of daidzein in ERα
and examine how daidzein interact in
binding pocket of the receptor.
This study utilized computational chemistry (
in silico
method) to find new
drugs with various benefits. This study utilized one of advanced methods which is
interaction fingerprint identification using Python-based Protein-Ligand
Interaction Fingerprint (PyPLIF) software that can improve Structure Based
Virtual Screening (SBVS) method quality in retrospective validation for
identification ligand of ER
α
.
The results of this study showed that protocol developed by Radifar
et al.
(2013) could not recognize daidzei
n as ligand for ERα
and could not be employed
to elucidate daidzein binding mode since it could not reproduce co-crystal
reference binding mode. Therefore, another SBVS protocol validated here was
used to elucidate daidzein binding mode. The protocol identified at least two
binding poses of daidzein in ERα.
1
BAB I
PENDAHULUAN
A.
Latar Belakang
Kanker payudara adalah tumor ganas yang berasal dari sel-sel yang
terdapat pada payudara (Price, 2006). Menurut WHO, kanker payudara adalah
jenis kanker yang paling umum diderita oleh wanita dan berdasarkan data
statistiknya, 508.000 orang wanita dari seluruh wanita di dunia meninggal karena
kanker payudara pada tahun 2011 (WHO, 2013). Di Indonesia, kanker payudara
diperkirakan mengakibatkan kematian terhadap 12.352 orang pada tahun 2005
(Ramli, 2003).
2006). Salah satu senyawa alam yang terbukti aktif sebagai penghambat RE
α
adalah senyawa kelompok fitoestrogen, yakni: isoflavon, lignan, dan koumestan.
Daidzein yang merupakan bagian dari isoflavon ini secara
in vivo mampu
menghambat proliferasi sel kanker dengan meningkatkan apoptosis (Liu, Suzuki,
Santosh, Okamoto, dan Shibutani, 2012). Namun, penelusuran mekanisme
molekuler terhadap kanker payudara perlu diteliti lebih lanjut.
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan simulasi penambatan molekuler
secara
in silico terhadap daidzein pada RE
α menggunakan protokol penapisan
yang dikembangkan oleh Radifar,Yuniarti, dan Istyastono (2013).
1.
Perumusan Masalah
Berdasarkan uraian-uraian di atas, maka dapat dirumuskan permasalahan
sebagai berikut:
a.
Apakah protokol penapisan yang dikembangkan Radifar
et al.
(2013)
dapat mengenali daidzein sebagai ligan RE
α secara
in silico?
b.
Bagaimanakah pose daidzein di dalam kantung ikatan RE
α?
2.
Keaslian Penelitian
Sepanjang pengetahuan penulis, penelitian ini berbeda dengan
penelitian sebelumnya karena penelitian ini menggunakan daidzein
sebagai senyawa pembanding dan
Python-based
Protein-Ligand
Interaction Fingerprint (PyPLIF) sebagai salah satu aplikasinya.
3.
Manfaat Penelitian
a.
Manfaat Teoretis
Penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu
pengetahuan khususnya ilmu kefarmasian mengenai senyawa daidzein
pada RE
α
.
b.
Manfaat Praktis
Penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan senyawa pembanding
yang dapat dipakai pada penelitian berikutnya terkait senyawa yang
berpotensi sebagai ligan antagonis pada RE
α
.
B.
Tujuan Penelitian
1.
Tujuan Umum
Secara umum penelitian ini bertujuan untuk
mengetahui dan menguji
apakah protokol penapisan
in silico yang dikembangkan oleh Radifar et
al. (2013) mampu mengenali daidzein sebagai ligan RE
α.
2.
Tujuan Khusus
4
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A.
Kanker
Kanker merupakan suatu penyakit sel yang ditandai dengan hilangnya
fungsi kontrol sel terhadap pertumbuhan sel. Akibatnya, sel akan berproliferasi
terus-menerus sehingga menimbulkan pertumbuhan jaringan yang abnormal yang
dapat menyebar dan menghancurkan organ-organ lain dan jaringan tubuh.
Apoptosis tidak lagi terjadi pada sel-sel abnormal ini (Macdonald, Ford, dan
Casson, 2004).
Patogenesis terjadinya kanker yang sering disebut karsinogenesis dapat
dibagi dalam tiga fase utama yaitu fase inisiasi (perubahan histologis dan
biokimiawi belum terlihat, hanya terlihat nekrosis sel dengan meningkatnya
proliferasi sel), fase promosi (gambaran histologis dan biokimiawi terlihat
abnormal), dan fase progresi (gambaran histologis dan biokimiawi menunjukkan
keganasan) (Kartawiguna, 2001). Pada fase inisiasi, terjadi perubahan pada
material genetik sel normal sehingga sel kanker teraktivasi. Setelah itu,
pembelahan terus menerus terjadi (fase promosi) sampai sel kanker menyebar ke
jaringan di sekitarnya atau dapat juga ke jaringan lain di tubuh (metastasis)
(Chabner dan Thompson, 2013).
diminati oleh masyarakat karena bahan alam tidak berbahaya bagi tubuh
mengingat terapi kanker yang selama ini ada memiliki efek samping yang sangat
berbahaya terhadap tubuh kita (Darma, Pratama, dan Sukamdi , 2008).
B.
Kanker Payudara
Kanker payudara adalah penyakit kanker yang terjadi pada sel-sel
payudara (Purba, 2004). Kanker ini berasal dari kelenjar, saluran, dan jaringan
penunjang payudara, namun tidak termasuk kulit payudara (Purwantaka, 2010).
Berdasarkan penemuan terakhir kaum pria pun bisa terkena kanker payudara,
walaupun masih jarang terjadi (Purwoastuti, 2008).
Penyebab kanker masih belum diketahui dengan pasti. Namun, ada
beberapa faktor yang diduga meningkatkan risiko terjadinya kanker payudara ini,
yakni: (i) mendapat haid pertama pada usia muda; (ii) tidak menikah atau tidak
pernah melahirkan anak; (iii) tidak pernah menyusui anak; (iv) salah satu anggota
keluarga ada yang menderita kanker payudara; (v) pernah melakukan program
KB; (x) kelebihan berat badan; (xi) sering minum minuman beralkohol; dan (xii)
perokok aktif atau pasif (Purwantaka, 2010).
Yogyakarta merupakan kanker dengan angka kejadian tertinggi. Oleh karena itu,
kanker payudara adalah jenis kanker yang mendesak dan penting untuk diteliti dan
dikembangkan terkait terapi dan deteksi dininya (Istyastono, 2013).
Kanker payudara yang bersifat invasif dapat dibedakan menjadi dua
subti
pe berdasarkan ekspresi REα dari sel tumor yakni REα
-positif (kanker
payudara yang melibatkan REα) dan REα
-negatif (kanker payudara yang tidak
melibatkan REα).
Sekitar 75% dari kan
ker payudara adalah REα
-positif dan 25%
lainnya adalah REα
-
negatif. Kanker payudara dengan REα
-negatif ini lebih
mematikan karena
sel terus menerus membelah tanpa ada ekspresi REα. K
anker
payudara dengan REα
-negatif dapat terjadi karena adanya perubahan struktur
kromosom dengan tahapan metilasi DNA. Pengobatan pada kanker payudara
dengan REα
-negatif tidak dapat dilakukan dengan terapi hormon seperti yang
sering dilakukan pada kanker payudara dengan REα
-positif. Pengobatan untuk
kanker payudara dengan REα
-negatif dapat dilakukan dengan cara menghambat
metilasi sehingga mereaktivasi ekspresi dari
REα dan merubahnya menjadi kanker
payudara dengan REα
-positif untuk diobati dengan terapi hormonal seperti pada
C.
Reseptor Estrogen (RE)
RE yang terdiri dari protein twelve helix (helix 12) ini terletak di inti sel
atau sitoplasma sel sehingga RE mempunyai efek langsung dalam transkripsi
DNA dan hanya dapat dipengaruhi oleh molekul kecil yang dapat melewati
membran sel (Lund, 2005). RE memiliki tiga tempat ikatan spesifik, yaitu
terhadap ligan (ligand binding domain
(AF-2)), terhadap growth factor
(AF-1),
dan terhadap DNA (DNA-binding domain) (Shiau et al., 1998).
Ada dua subtipe RE dan beberapa isoform serta sambungan varian dari
setiap subtipe. Subtipe pertama, RE
α, pertama kali diklon tahun 1986 dan su
btipe
kedua, reseptor estrogen beta (RE
β) ditemukan paling terkini. Kedua subtipe
reseptor ini bervariasi dalam struktur dan gen-gen pengkode di dalam
kromosom-kromosom yang berbeda pula (Gruber, Tschuggei, Schneebeger, dan Huber,
2002). Pada RE
α
, jika ligan agonisnya (estrogen) berikatan, kemudian terjadi
perubahan konformasi reseptor yang memungkinkan terjadinya ikatan dengan
koaktivator dan mengaktifkan faktor transkripsi serta mempengaruhi berbagai
fungsi sel tergantung macam dan targetnya (Putra
et al., 2008), sedangkan jika
REα berikatan dengan ligan antagonisnya (tamoxifen), maka perubahan
Menurut Dhanajaya
et al.
(2012) lebih dari 60% kanker payudara
terdeteksi sebagai kanker payudara dengan
REα
positif dan pengobatan dilakukan
dengan
REα sebagai target terapinya
.Kemudian Shiau
et al. (1998) berhasil
memecahkan
truktur kristal REα dengan 4
-hidroksi-tamoxifen (metabolit
tamoxifen yang memiliki afinitas 30-100 kali lipat lebih kuat terhadap RE
α)
sebagai ligan kokristal dan disimpan serta dapat diakses publik di situs
Protein
Data Bank (PDB) dengan kode 3ERT (Istyastono, 2013). Inspeksi visual 3ERT
menunjukkan 70 residu asam amino yang membentuk kantung ikatan dan dua
jejaring ikatan hidrogen yang diduga berperan penting dalam menentukan
interaksi ligan d
an REα: (i) interaksi bagian 4
-hidroksi dari 4-hidroksi-tamoxifen
dengan molekul air yang
conserved dan residu asam amino Glu353 dan Arg394
dan interaksi bagian (2-hidroksi-etil)-dimetilazanium dari 4-hidroksi-tamoxifen
dengan residu asam amino Thr347 dan Asp351 (Shiau
et al., 1998; Anita et al.,
2012).
Gambar 1.
REα
(PhospoSite, 2013)
Kanker jenis RE dependent dapat terjadi melalui 2 tahap: (i) estrogen yang
target di jaringan, dan meningkatnya jumlah sel dapat menyebabkan replikasi
menjadi eror sehingga terjadi mutasi yang akan berpengaruh pada apoptosis,
proliferasi sel, dan DNA
repair; (ii) hasil dari metabolisme estrogen mengarah
pada sifat
genotoxic yang dapat menyebabkan kerusakan DNA sehingga terjadi
mutasi (Deroo dan Korach, 2006).
D.
Daidzein
Daidzein (Gambar 2) adalah salah satu senyawa kelompok fitoestrogen
(isoflavon) yang banyak terdapat pada kacang kedelai dan produk olahannya
seperti tahu dan miso (Barlow, 2007). Senyawa golongan isoflavon menunjukkan
supresi terhadap angiogenesis serta dilaporkan dapat menghambat lipoksigenase
dan hemolisis peroksidase dari eritrosit kambing percobaan (Biben, 2012).
Daidzein dapat berikatan dengan RE (
REα dan REβ) pada beberapa jaringan
terutama jaringan yang terdapat di payudara (Manjanatha, Shelton, Bishop, Cook,
dan Aidoo, 2006) dengan aktivitas agonis, parsial agonis atau antagonis (Barlow,
2007) tergantung waktu pemejanan, konsentrasi yang diberikan, bentuk konsumsi,
bahan makanan, dan status RE (Dhanajaya
et al., 2012). Daidzein banyak
digunakan oleh wanita
postmenopausal
untuk terapi hormon sebagai pengganti
hormon estrogen karena beberapa penelitian menunjukkan bahwa terapi dengan
hormon estrogen dapat meningkatkan potensi kanker payudara dan endometrium
(Aidoo et al., 2009).
penyakit jantung (Aidoo
et al., 2009). Secara
in vivo, Liu
et al.
(2012)
membuktikan bahwa daidzein dapat menekan pertumbuhan kanker payudara
melalui proses peningkatan apoptosis pada tikus yang terinduksi
7,12-dimethylbenz(a)anthracene
(DMBA)
dengan
konsentrasi
1,0
mg
(2,7
µmol)/KgBB.
Gambar 2. Struktur senyawa daidzein.
E.
Kimia Komputasi
Kimia komputasi adalah disiplin ilmu yang berkembang dengan
penggunaan perangkat lunak komputer sebagai sarana untuk mendapatkan
informasi tentang proses kimia yang terjadi dalam suatu sistem (Dearing, 1988).
sehingga hasil perhitungan kimia komputasi dapat dibandingkan secara langsung
dengan hasil skala laboratorium, seperti reaksi pada kondisi tekanan yang sangat
tinggi atau melibatkan gas berbahaya (Pranowo, 2004).
Keunggulan dari studi kimia komputasi dalam menemukan obat baru
adalah kimia komputasi medisinal ini menawarkan metode
in silico yang dapat
menggambarkan senyawa obat secara tiga dimensi (3D) dan melakukan
komparasi atas dasar kemiripan struktur dan energi dengan senyawa lain yang
sudah diketahui memiliki aktivitas tinggi sehingga senyawa dengan aktivitas
rendah dapat langsung dieliminasi tanpa harus diujicobakan lebih lanjut (Pranowo
dan Hetadi, 2010).
F.
Penapisan Virtual (PV)
senyawa di dalam kantung ikatan yang membantu untuk optimasi selanjutnya
(Istyastono, 2013).
Protokol penapisan yang dikembangkan Anita
et al. (2012) divalidasi
secara retrospektif dengan menggunakan antagonis RE
α
dan decoys (diambil dari
website DUD (http://dud.docking.org/r2/)) yang dinilai berdasarkan nilai
Enrichment Factor 1% (EF
1%) (dengan cara membandingkan prosentase senyawa
aktif (true positives) dan
decoys yang diidentifikasi sebagai senyawa aktif (false
positives)
sejumlah 1% (semakin besar nilainya berarti semakin baik protokol
tersebut)). Nilai EF
1%protokol yang dikembangkan oleh Anita
et al. (2012),
mengalami peningkatan dari protokol sebelumnya dari 12.7 menjadi 15.9 dan
mengalami peningkatan lagi menjadi 21.2 setelah ditambahkan molekul air yang
bersifat conserved (Anita et al., 2012).
yang dihasilkan sangat memiliki kecocokan dengan pose struktur ligan kokristal
(Schlosser, 2010).
Hasil dari penambatan molekul dengan aplikasi PLANTS 1.2 (Korb,
Stutzle, dan Exner, 2009) menghasilkan luaran berupa pose penambatan dan nilai
ChemPLP yang akan digunakan sebagai masukkan untuk aplikasi PyPLIF
(Radifar
et al., 2013). ChemPLP merupakan
scoring function dari hasil
penambatan molekular yang bekerja dengan menilai interaksi yang ada
berdasarkan gaya tarik-menarik dan tolak-menolak antara protein dan ligan (Korb
et al., 2009). Nilai ini telah terbukti lebih efektif daripada scoring function lainnya
untuk memprediksi pose dan penapisan virtual (Liebeschuetz, Cole, dan Korb,
2012).
G.
Sidik Jari Interaksi
Susunan bit ligan daidzein maupun ligan standar yang telah didapat dari
SJI, selanjutnya dapat dianalisa menggunakan perhitungan
Tanimoto Coefficient
(Tc). Tc merupakan sebuah perhitungan sederhana yang menunjukkan ukuran
kemiripan aktivitas senyawa-senyawa kimia (Ahmed, 2011). Dalam perhitungan
ini dihasilkan nilai dengan rentang 0,000 yang berarti tidak ada kemiripan sampai
1,000 yang berarti keduanya memiliki kemiripan (Radifar, 2013).
Protokol yang dikembangkan oleh Anita
et al. (2012) telah ditingkatkan
kualitas penapisannya dengan penilaian ulang menggunakan nilai
Tanimoto
Coefficient-Protein Ligand Interaction Finger Print (Tc-PLIF) yang merupakan
hasil identifikasi SJI protein-ligan dan penyaringan pada ikatan hidrogen dengan
Asp351 dengan aplikasi
Python-based Protein Ligand Interaction Finger Print
(
PyPLIF) oleh Radifar
et al. (2013). Protokol ini melakukan penyaringan pada
ikatan hidrogen dengan Asp351 karena asam amino ini merupakan jangkar dari
ligan-ligan RE
α
dengan kata lain semua ligan bagi RE
α
pasti mempunyai ikatan
hidrogen dengan Asp351. Selain itu, dengan disaring ikatan hydrogen dengan
Asp351, nilai EF
1%meningkat secara signifikan menjadi 53,8 (Radifar
et al.,
2013). Suatu senyawa dapat dikatakan sebagai ligan dari RE
α jika
memiliki nilai
Tc-PLIF yang lebih besar atau sama dengan 0,600 (nilai standar)
(Rognan dan
Marcou, 2007).
H.
Landasan Teori
payudara. Salah satu titik tangkap pengobatan kanker payudara ini adalah
penghambatan RE
α yang merupakan reseptor faktor transkripsi yang terdapat
pada inti sel payudara.
Belakangan ini pencegahan menggunakan bahan-bahan alami sedang
banyak dikembangkan daripada pengobatannya. Daidzein, senyawa fitoestrogen
yang banyak terdapat dalam kacang kedelai, telah terbukti secara
in vivo
dapat
menghambat pertumbuhan sel kanker payudara. Dengan menggunakan protokol
PyPLIF yang telah divalidasi retrospektif dengan EF1% lebih besar daripada
protokol sebelumnya dan validasi internal dengan RMSD < 2 Å, akan dilakukan
simulasi penambatan daidzein pada RE
α
dan melihat pose daidzein pada RE
α
tersebut secara in silico.
I.
Hipotesis
1.
Daidzein dapat dik
enali sebagai ligan REα secara
in silico berdasarkan
protokol penapisan yang dikembangkan Radifar et al. (2013).
16
BAB III
METODE PENELITIAN
A.
Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental komputasi dimana
terdapat intervensi terhadap variabel yang dilakukan berbantukan komputer
dengan rancangan penelitian studi dokumentasi yakni pengumpulan data lewat
berbagai dokumen yang telah ada.
B.
Variabel dan Definisi Operasional
1.
Variabel Penelitian
a.
Variabel Utama
1)
Variabel bebas: Protokol penapisan
2)
Variabel tergantung: Nilai Tc-PLIF, ChemPLP, dan Pose daidzein
b.
Variabel Pengacau
1)
Variabel pengacau terkendali: Perangkat lunak dan peralatan
komputasi.
2)
Variabel pengacau tak terkendali: Sifat algoritma yang stokastik
(kebolehjadian).
2.
Definisi Operasional
a.
Protokol penelitian: Algoritma yang digunakan oleh Anita
et al. (2012)
dan telah direvalidasi oleh Radifar et al. (2013).
C.
Kelengkapan Penelitian
1.
Bahan visualisasi didapatkan dari
PDB (www.rcsb.org) dan
ZDD berupa struktur
3 dimensi (3D) (Irwin dan Schoichet, 2005; Irwin, Sterling, Mysinger, Bolstad,
dan Coleman, 2012).
2.
Berkas konfigurasi water_plantsconfig didapatkan dari hasil penelitian Anita et
al. (2012) dan config.txt didapatkan dari hasil penelitian Radifar et al. (2013)
3.
Penelitian
ini
menggunakan
seperangkat
alat
kimia
komputasi
@pharmacomp.usd di Laboratorium Virtual Universitas Sanata Dharma HP
Proliant ML1|0-67 dengan spesifikasi prosesor Intel Xeon® E31220 @3.10
GHz dan
random acess memory (RAM) 8GB terinstal sistem operasi Ubuntu
12.04, versi kernel 3.5.0-23-genetic dan aplikasi-aplikasi berikut: Open Babel
2.2.3 (O’Boyle
et al., 2011), SPORES (Ten Brink dan Exner, 2009), PLANTS
1.2 (Korb
et al., 2009), PyPLIF (Radifar et al., 2013), PyMOL1.2rl (Lill dan
Danielson, 2011), dan R 2.14.0 (R Development Core Team, 2008).
D.
Tata Cara Penelitian
1.
Penambatan Ulang 4-Hidroksi-tamoxifen
Tc-PLIF tidak disaring ikatan hidrogen dengan Asp351, (iii) nilai ChemPLP
disaring ikatan hidrogen dengan Asp351, dan (iv) nilai ChemPLP tidak
disaring ikatan hidrogen dengan Asp351.
2.
Analisis Hasil Penambatan Ulang 4-Hidroksi-tamoxifen
Pose dengan nilai terbaik dari masing-masing bagian luaran dipilih
sebagai pose standar untuk menghitung nilai RMSD di masing-masing bagian
tersebut secara berurutan dimulai dari nomor i sampai poin iv.
Pengambilankeputusan ditampilkan pada Gambar 3.
Simulasi yang dilakukan pada daidzein disesuaikan dengan bagian data yang
dinyatakan valid dari Gambar 3 di atas.
3.
Persiapan Perlakuan Daidzein
Dilakukan pengunduhan senyawa daidzein dari ZDD (Irwin dan
Schoichet, 2005; Irwin
et al., 2012) dengan kode ZINC18847034 dan
disiapkan dengan menggunakan Open Babel (O’Boyle
et al., 2011) dan
SPORES (Ten Brink dan Exner, 2009).
4.
Penambatan Daidzein
Daidzein ditambatkan pada RE
α
sebanyak 1000 kali dengan tiga
replikasi. Setelah itu, hasil penambatan dilakukan identifikasi sidik jari
interaksi menggunakan aplikasi PyPLIF (Radifar
et al., 2013) dilanjutkan
penyaringan pada ikatan hidrogen dengan Asp351 (Radifar
et al., 2013) dan
pengurutan dari nilai yang didapatkan. Pengurutan hanya dilakukan pada
bagian data yang telah dinyatakan valid dari Gambar 3.
5.
Analisa Statistik
6.
Elusidasi Pose Ikatan Daidzein pada RE
α
21
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A.
Penambatan Ulang 4-Hidroksi-tamoxifen
Tahap penambatan ulang 4-hidroksi-tamoxifen ini bertujuan untuk
melakukan validasi internal terhadap protokol yang digunakan. Hasil awal
yang diperoleh adalah pose hasil penambatan molekul, nilai ChemPLP, dan
nilai Tc-PLIF. Hasil awal yang didapatkan diproses lebih lanjut dengan
melakukan pengurutan nilai ChemPLP dan Tc-PLIF yang disaring ikatan
hidrogen dengan Asp351 maupun yang tidak disaring ikatan hidrogen dengan
Asp351. Penyaringan pada interaksi ikatan hidrogen dengan Asp351
dilakukan karena dipercaya mampu meningkatkan kualitas penapisan virtual
yang dilakukan (Radifar
et al., 2013). Hasil akhir yang didapatkan dari tahap
ini terbagi menjadi empat bagian: (i) nilai Tc-PLIF disaring ikatan hidrogen
dengan Asp351, (ii) nilai Tc-PLIF tidak disaring ikatan hidrogen dengan
Asp351, (iii) nilai ChemPLP disaring ikatan hidrogen dengan Asp351, dan
(iv) nilai ChemPLP tidak disaring ikatan hidrogen dengan Asp351 yang
masing-masing bagiannya berisi 3000 data.
B.
Analisis Hasil Penambatan Ulang 4-Hidroksi-tamoxifen
pose dengan nilai terbaik dari setiap bagian (pose standar). Hasil nilai RMSD
ditampilkan pada Tabel I, II, III, dan IV.
Tabel I. Nilai RMSD 4-hidroksi-tamoxifen dari Tc-PLIF yang disaring
ikatan hidrogen dengan Asp351
No. Rep1 (Å)
Rep2 (Å)
Rep3 (Å)
1 1,827 1,726 1,263
2 5,293 1,426 1,446
3 1,639 1,183 1,149
4 1,71 1,726 1,263
5 1,174 1,426 1,446
6 1,487 1,183 1,149
7 1,705 1,644 1,592
8 1,875 1,218 1,133
9 1,977 1,423 1,768
10 1,178 0,912 1,471
11 1,596 5,363 1,458
12 1,662 1,358 1,547
13 1,596 1,742 1,731
14 1,14 1,419 1,591
15 1,891 1,656 1,808
16 1,395 1,464 1,438
17 2,027 1,146 1,452
18 1,448 1,452 5,42
19 0,808 1,79 1,681
20 1,679 1,187 1,691
21 1,147 5,306 0,797
22 1,182 1,586 1,441
23 1,155 5,204 1,626
24 1,215 1,387 1,281
25 1,896 1,139 1,16
26 5,446 1,153 1,597
27 5,422 0,814 5,362
28 1,536 1,638 5,418
29 0,757 1,409 1,445
30 1,139 1,316 1,435
31 1,491 1,486 0,789
No. Rep1 (Å)
Rep2 (Å)
Rep3 (Å)
32 1,232 1,226 1,169
33 1,141 1,421 1,14
34 1,165 1,979 0,741
35 1,431 1,705 1,706
36 1,074 1,18 1,231
37 1,709 1,439 1,141
38 1,076 1,126 1,704
39 1,596 1,642 1,183
40 1,155 1,06 1,439
41 1,828 1,591 1,817
42 0,63 1,857 1,076
43 0,813 0,873 1,429
44 0,749 1,692 1,072
45 1,377 1,139 1,668
46 1,807 1,323 1,878
47 1,861 5,402 1,52
48 0,749 1,511 1,596
49 1,825 1,653 1,655
50 1,827 1,591 1,384
51 5,42 1,142 1,45
52 1,439 5,436 1,18
53 1,919 1,701 1,423
54 5,446 1,54 0,789
55 1,579 1,155 1,588
56 5,401 2,031 0,817
57 1,579 1,467 0,71
58 1,143 5,439 1,745
59 1,817 0,989 0,855
60 1,434 1,146 1,572
61 5,442 1,295 5,451
62 1,914 1,107 1,163
No. Rep1 (Å)
Rep2 (Å)
Rep3 (Å)
63 1,471 1,811 5,44
64 1,764 1,704 1,178
65 1,489 0,802 5,401
66 1,433 5,412 1,862
67 1,909 1,696 1,572
68 0,853 1,788 1,128
69 0,784 0,87 1,422
70 1,954 0,904 1,144
71 1,415 1,792 1,145
72 1,788 1,563 1,672
73 1,479 5,392 1,38
74 1,526 1,199 1,914
75 1,671 1,629 1,486
76 1,436 1,81 1,271
77 1,436 1,119 1,14
78 1,188 1,147 1,42
79 1,373 1,483 1,897
80 0,794 1,17 1,147
81 1,828 1,384 1,178
82 1,129 1,641 1,896
83 1,718 5,387 1,525
84 5,358 1,438 1,447
85 0,784 1,834 1,61
86 1,65 1,591 1,601
87 1,138 1,906 1,135
88 5,333 1,662 1,663
89 1,138 1,456 1,382
90 1,404 1,695 0,86
91 1,493 5,396 5,313
92 1,136 1,189 5,416
No. Rep1 (Å) Rep2 (Å) Rep3 (Å)
94 1,525 1,851 1,837
95 0,789 1,828 1,728
96 1,519 5,447 1,38
97 1,412 1,587 1,436
98 1,124 1,578 1,48
99 1,695 1,16 1,139
100 1,264 1,195 1,906
101 5,292 1,444 1,146
102 5,385 1,629 2,018
103 1,875 0,783 1,765
104 1,887 1,81 1,462
105 1,128 1,767 1,926
106 1,43 1,111 1,607
107 1,412 1,141 1,143
108 1,227 1,17 1,655
109 1,844 1,185 1,91
110 0,677 1,449 1,424
111 1,631 1,471 1,676
112 1,172 1,469 1,168
113 1,625 5,27 1,14
114 1,967 1,836 1,137
115 1,15 1,818 1,697
116 1,594 1,141 0,816
117 1,405 1,148 1,453
118 1,141 0,733 0,767
119 1,695 1,154 5,237
120 0,96 2,021 5,448
121 1,46 1,911 1,461
122 1,454 1,142 1,652
123 1,819 1,331 1,44
124 0,947 1,139 5,372
125 1,596 1,14 1,142
126 1,203 1,079 1,107
127 1,329 1,415 1,496
128 1,852 1,706 1,679
129 1,449 1,141 1,655
130 1,685 1,726 1,127
131 1,449 1,439 1,471
132 1,707 1,802 1,144
133 5,415 1,163 1,15
No. Rep1 (Å)
Rep2 (Å)
Rep3 (Å)
134 1,729 1,129 1,475
135 0,865 1,159 1,963
136 1,821 1,13 0,658
137 5,434 1,142 1,147
138 1,847 1,831 1,61
139 1,954 1,141 1,632
140 1,154 1,46 1,438
141 1,746 1,149 1,698
142 1,082 1,915 1,758
143 1,565 1,914 1,447
144 1,974 1,944 0,781
145 1,758 0,798 1,964
146 0,876 1,137 1,912
147 1,439 1,145 1,779
148 0,754 1,346 1,164
149 0,762 1,827 0,811
150 1,533 1,14 1,438
151 1,616 5,367 1,754
152 1,883 1,75 1,598
153 1,137 1,139 1,565
154 1,942 1,617 1,6
155 1,613 0,8 1,164
156 1,146 1,422 1,161
157 1,437 1,642 1,122
158 1,48 1,819 1,16
159 1,14 1,152 1,72
160 1,592 5,41 1,451
161 1,61 1,14 1,18
162 1,451 1,443 1,155
163 1,439 1,7 1,174
164 1,138 1,119 1,44
165 1,476 1,64 5,362
166 1,458 1,42 1,471
167 1,166 1,659 1,767
168 1,18 5,445 1,145
169 1,515 1,908 1,678
170 1,422 1,081 1,716
171 1,711 1,439 1,423
172 1,397 1,169 1,186
173 1,435 1,702 1,789
No. Rep1 (Å)
Rep2 (Å)
Rep3 (Å)
174 1,238 5,357 5,417
175 1,44 1,438 1,147
176 1,138 1,908 1,867
177 5,348 1,56 5,448
178 1,125 1,661 0,639
179 1,081 1,709 1,747
180 1,838 1,902 1,14
181 1,607 1,652 1,144
182 1,397 1,148 1,426
183 1,596 5,425 0,656
184 1,146 1,882 1,418
185 1,18 1,166 1,597
186 1,225 1,404 1,695
187 1,114 1,441 1,233
188 1,407 1,823 1,123
189 1,497 1,587 1,581
190 1,44 1,439 1,143
191 1,852 1,448 1,727
192 1,899 1,895 1,981
193 1,463 1,898 1,823
194 1,429 1,439 1,601
195 1,322 1,918 1,441
196 1,142 5,478 1,136
197 1,341 1,144 1,594
198 2,05 0,823 1,688
199 1,148 1,179 5,413
200 1,696 1,505 1,138
201 1,439 1,425 1,135
202 1,44 1,97 1,431
203 1,145 1,419 1,376
204 5,426 1,691 1,997
205 1,144 1,927 1,595
206 1,19 1,437 1,187
207 1,271 2,007 1,831
208 1,849 1,722 1,437
209 1,421 1,713 1,147
210 1,424 1,467 1,549
211 1,875 1,477 1,475
212 1,586 1,156 1,369
No. Rep1 (Å) Rep2 (Å) Rep3 (Å)
214 1,758 1,914 1,427
215 2,006 1,196 1,135
216 1,859 1,046 1,44
217 1,356 1,16 5,406
218 1,166 1,146 1,388
219 1,68 0,87 1,664
220 1,143 1,184 1,084
221 5,409 0,584 1,596
222 1,689 1,174 1,14
223 1,638 1,432 1,899
224 1,941 0,782 1,139
225 1,33 1,149 1,593
226 5,211 1,136 1,816
227 1,138 1,142 2,086
228 1,145 1,166 2,08
229 1,507 1,804 1,198
230 1,437 5,454 1,617
231 1,585 1,422 1,435
232 1,702 1,144 1,592
233 5,354 1,915 1,932
234 1,645 1,821 1,44
235 1,72 1,47 1,472
236 1,815 1,558 1,778
237 1,487 5,266 1,622
238 1,614 5,41 1,137
239 1,139 1,326 1,052
240 1,588 1,605 0,751
241 1,422 0,798 5,271
242 5,414 1,21 1,808
243 1,731 1,788 0,859
244 1,14 1,437 1,609
245 1,435 1,428 1,141
246 1,656 1,891 1,438
247 1,057 0,762 1,454
248 1,148 0,718 1,707
249 1,144 1,689 5,311
250 1,819 1,911 1,179
251 5,4 0,796 1,808
252 1,425 1,541 1,15
253 1,731 1,508 1,713
No. Rep1 (Å)
Rep2 (Å)
Rep3 (Å)
254 1,183 1,142 1,72
255 1,441 1,27 1,691
256 1,608 1,729 1,672
257 1,773 2,033 5,369
258 0,793 1,689 0,88
259 1,198 1,188 1,473
260 1,4 1,17 1,428
261 1,595 1,438 1,144
262 2,011 1,139 1,65
263 1,915 0,943 1,528
264 5,347 5,444 1,14
265 1,842 1,413 1,218
266 1,146 1,598 1,609
267 1,308 1,175 0,983
268 1,801 1,15 1,485
269 1,68 1,371 1,41
270 1,614 1,147 1,427
271 1,224 1,807 0,878
272 1,921 1,589 1,808
273 1,177 0,802 1,429
274 1,474 1,702 1,711
275 0,671 0,862 1,791
276 1,823 1,143 1,146
277 1,424 1,886 5,328
278 1,139 0,814 1,142
279 1,482 1,618 1,915
280 1,174 1,686 1,301
281 1,808 1,621 1,437
282 1,735 5,325 1,138
283 1,15 5,391 1,594
284 1,133 1,57 1,77
285 1,196 1,477 1,819
286 0,748 1,144 1,913
287 1,694 5,447 1,134
288 1,083 1,143 1,68
289 1,481 1,526 1,122
290 2,051 1,644 1,537
291 1,594 5,405 1,356
292 1,691 1,072 1,741
293 1,607 5,195 1,816
No. Rep1 (Å)
Rep2 (Å)
Rep3 (Å)
294 1,46 1,651 1,783
295 1,29 1,921 1,394
296 1,442 1,146 1,438
297 1,908 1,164 1,141
298 1,81 1,872 1,145
299 1,306 1,629 1,341
300 1,148 1,687 1,103
301 1,219 1,415 5,42
302 1,766 1,134 1,342
303 1,586 1,146 1,167
304 1,548 1,642 1,644
305 1,141 1,468 5,356
306 5,432 5,46 1,589
307 1,594 1,151 1,909
308 1,447 1,813 5,398
309 1,139 1,441 0,805
310 1,506 1,445 1,595
311 1,593 1,694 5,406
312 0,804 1,415 1,409
313 1,824 1,141 1,423
314 1,132 1,416 1,516
315 1,414 1,907 1,861
316 1,832 1,178 1,442
317 1,662 1,192 1,432
318 1,169 1,429 1,321
319 1,692 1,93 1,359
320 0,788 0,801 1,448
321 1,124 1,141 1,486
322 1,818 1,135 1,636
323 1,44 1,638 1,599
324 5,436 1,916 1,144
325 1,144 1,44 1,157
326 5,428 2,055 1,884
327 0,792 1,69 5,251
328 1,142 1,795 1,821
329 1,62 1,963 1,678
330 1,183 1,766 1,892
331 0,765 1,898 1,73
332 1,921 1,419 1,711
No. Rep1 (Å) Rep2 (Å) Rep3 (Å)
334 5,4 1,137 1,604
335 1,434 1,816 1,197
336 1,86 1,465 1,436
337 1,419 1,44 1,909
338 1,147 1,138 1,167
339 1,529 1,573 1,169
340 1,147 1,138 5,372
341 1,164 1,439 1,457
342 1,665 1,127 5,264
343 1,971 5,408 1,753
344 1,561 1,437 1,479
345 1,989 1,476 1,424
346 1,391 1,188 1,456
347 1,334 1,47 1,595
348 1,883 1,78 1,439
349 1,087 1,139 1,163
350 1,146 1,478 1,908
351 1,171 1,7 1,14
352 1,9 1,545 0,717
353 1,906 1,594 1,153
354 1,628 1,81 1,436
355 0,982 1,14 5,461
356 1,619 5,439 1,169
357 1,143 1,166 1,569
358 1,591 5,417 1,951
359 1,911 1,467 1,443
360 1,438 1,506 0,813
361 1,704 1,467 1,589
362 1,591 1,672 1,63
363 1,128 1,579 1,412
364 0,794 1,692 1,435
365 1,566 1,811 1,139
366 1,439 1,145 1,144
367 1,135 1,354 1,657
368 1,377 1,607 0,837
369 1,76 1,822 1,837
370 1,809 1,144 1,437
371 1,142 1,412 1,604
372 1,146 1,679 1,667
373 1,84 1,797 1,326
No. Rep1 (Å)
Rep2 (Å)
Rep3 (Å)
374 1,611 1,44 1,491
375 1,933 1,295 1,178
376 1,791 5,419 1,669
377 5,388 1,99 1,899
378 1,151 1,777 1,471
379 1,188 1,742 5,405
380 1,926 5,453 1,122
381 1,915 1,484 1,406
382 1,144 1,141 1,175
383 1,375 1,467 0,581
384 5,422 2,015 1,595
385 1,592 1,981 1,911
386 1,727 5,344 1,466
387 1,085 1,808 1,169
388 1,741 1,14 1,154
389 1,891 1,129 1,708
390 1,457 1,552 1,722
391 1,884 1,167 1,898
392 0,81 1,871 1,475
393 0,823 1,144 1,902
394 1,171 0,782 1,434
395 5,427 1,617 1,439
396 5,406 1,971 1,461
397 1,434 1,141 1,399
398 1,139 1,163 5,324
399 1,656 1,674 1,112
400 1,829 1,682 5,394
401 1,235 1,689 1,181
402 1,745 5,412 1,744
403 1,098 1,807 2,051
404 5,46 1,759 1,439
405 1,156 1,392 1,93
406 1,444 0,795 1,424
407 1,148 1,435 1,776
408 1,698 1,381 1,522
409 1,453 1,112 1,388
410 1,135 1,748 1,438
411 0,81 1,461 1,078
412 1,454 1,562 1,15
413 1,437 1,846 0,757
No. Rep1 (Å)
Rep2 (Å)
Rep3 (Å)
414 5,42 5,404 1,14
415 1,479 1,599 1,143
416 0,676 1,727 1,143
417 5,392 1,168 1,426
418 0,809 2,029 1,594
419 1,125 1,397 1,515
420 1,666 1,764 5,418
421 1,146 1,698 1,164
422 1,14 1,932 1,14
423 1,781 1,366 5,404
424 1,382 1,442 1,596
425 1,837 1,614 0,86
426 1,217 1,507 1,579
427 1,487 1,656 1,261
428 5,3 1,61 1,365
429 1,138 5,427 1,573
430 1,136 1,276 1,448
431 5,459 1,772 1,235
432 1,438 1,68 0,782
433 1,138 1,29 1,686
434 0,755 1,18 0,735
435 1,794 2,006 1,807
436 0,757 1,733 1,909
437 1,143 1,282 1,158
438 1,24 1,168 2,098
439 1,15 1,619 1,908
440 0,851 1,148 5,442
441 1,429 0,839 1,172
442 1,472 1,454 1,593
443 1,135 1,874 1,884
444 1,596 1,565 1,32
445 1,437 0,652 2,02
446 1,695 1,809 1,145
447 1,75 1,76 1,137
448 0,725 1,291 1,153
449 1,146 1,937 1,929
450 1,542 1,185 1,506
451 1,418 1,179 1,659
452 1,695 1,384 1,417
No. Rep1 (Å) Rep2 (Å) Rep3 (Å)
454 1,145 1,441 1,137
455 0,778 1,231 1,705
456 5,408 1,081 1,382
457 1,473 1,142 1,14
458 1,437 1,456 1,142
459 1,862 1,458 5,39
460 1,169 1,145 1,59
461 1,575 5,461 5,399
462 1,718 1,464 1,143
463 1,64 1,435 1,315
464 0,794 1,705 1,103
465 1,908 1,907 2,123
466 1,195 1,748 1,243
467 1,427 1,535 0,825
468 1,455 1,699 1,142
469 1,988 0,786 1,437
470 1,115 1,587 1,446
471 1,441 1,418 1,138
472 1,447 1,135 1,144
473 1,441 2,038 1,808
474 1,957 2,065 1,858
475 1,139 1,314 2,039
476 1,735 1,474 1,18
477 1,675 1,678 1,145
478 1,606 1,18 1,394
479 1,479 1,294 1,606
480 1,393 1,652 1,615
481 1,44 1,719 0,863
482 1,142 1,955 1,543
483 1,705 1,906 1,7
484 1,703 1,504 1,454
485 1,151 1,14 1,149
486 1,458 5,405 1,421
487 1,275 0,807 1,606
488 1,744 1,704 5,369
489 1,442 1,434 1,141
490 1,687 5,423 1,515
491 1,877 1,439 1,581
492 1,476 1,183 0,889
493 1,147 1,14 1,819
No. Rep1 (Å)
Rep2 (Å)
Rep3 (Å)
494 1,71 1,241 1,652
495 1,442 1,694 1,694
496 1,854 1,824 5,381
497 1,279 1,293 1,694
498 5,391 1,14 1,696
499 1,136 1,556 1,457
500 2,012 0,774 1,137
501 1,153 5,43 1,855
502 1,156 1,18 1,905
503 1,913 1,825 1,899
504 1,63 1,134 1,69
505 1,479 1,702 1,715
506 5,417 5,444 1,144
507 1,137 1,62 1,825
508 1,433 1,674 1,151
509 1,434 0,793 1,451
510 1,14 1,14 1,882
511 5,436 1,709 1,607
512 1,138 2,014 1,374
513 1,441 0,952 1,141
514 1,907 1,796 1,71
515 1,44 1,424 0,729
516 1,894 1,705 1,174
517 5,352 1,9 1,644
518 1,282 1,432 1,702
519 1,935 1,144 1,59
520 1,83 1,275 1,471
521 5,443 1,903 1,803
522 1,459 1,769 1,148
523 1,551 1,47 1,144
524 1,6 1,695 2,017
525 1,152 1,743 1,88
526 1,849 1,757 1,722
527 1,591 1,387 1,131
528 1,135 0,779 1,186
529 1,572 1,248 1,426
530 1,697 1,984 1,72
531 1,148 1,454 1,928
532 1,321 1,817 1,452
533 1,637 1,437 1,967
No. Rep1 (Å)
Rep2 (Å)
Rep3 (Å)
534 1,156 1,968 1,669
535 1,464 1,156 1,435
536 1,729 5,332 1,765
537 1,88 1,154 1,891
538 1,156 1,151 1,141
539 1,275 1,159 1,577
540 1,478 1,54 1,144
541 1,939 1,609 0,749
542 1,473 1,785 1,142
543 5,265 1,45 1,148
544 5,384 1,64 1,125
545 5,433 2,065 1,574
546 1,805 1,456 1,424
547 0,732 1,736 1,466
548 1,123 1,301 1,447
549 1,604 1,433 1,624
550 1,608 1,146 1,204
551 1,956 5,464 1,39
552 1,661 1,914 1,437
553 1,146 1,443 0,786
554 1,335 1,428 1,458
555 1,442 2,011 1,32
556 2,033 0,595 1,483
557 1,411 1,454 1,696
558 1,431 1,146 1,518
559 1,152 1,816 1,444
560 1,591 1,159 1,36
561 1,504 1,679 1,907
562 1,592 1,887 1,689
563 1,591 1,457 1,472
564 1,144 1,716 1,75
565 1,168 1,685 1,146
566 0,847 1,179 1,423
567 1,767 1,247 1,139
568 1,066 1,202 1,911
569 1,141 1,148 1,148
570 1,703 1,469 1,149
571 1,163 1,151 1,444
572 1,134 1,592 0,782
No. Rep1 (Å) Rep2 (Å) Rep3 (Å)
574 0,794 1,383 5,444
575 1,554 5,417 1,698
576 1,593 1,819 1,37
577 0,697 1,59 1,453
578 1,524 1,934 1,592
579 1,143 1,119 1,474
580 0,754 1,331 0,724
581 5,43 1,815 1,91
582 1,152 1,942 1,187
583 1,857 1,149 1,373
584 0,778 1,748 0,79
585 1,743 1,259 1,446
586 1,431 1,799 1,121
587 1,457 2,086 1,542
588 5,415 1,438 1,902
589 1,455 1,883 1,519
590 1,688 1,438 1,147
591 1,137 1,648 0,747
592 5,415 1,225 1,388
593 1,14 1,709 1,429
594 1,118 1,364 1,205
595 1,153 1,831 1,219
596 2,077 0,766 5,353
597 0,763 1,15 1,144
598 1,884 1,756 1,895
599 1,808 1,891 1,769
600 1,565 1,693 1,725
601 1,187 1,818 5,424
602 1,899 1,697 1,141
603 1,708 1,119 1,144
604 0,805 1,568 1,432
605 1,72 1,146 0,799
606 1,873 1,481 1,456
607 5,424 1,611 1,593
608 1,148 0,631 0,79
609 1,133 1,064 1,142
610 1,138 1,128 1,49
611 1,44 1,384 1,6
612 1,133 1,144 1,437
613 1,692 1,7 1,142
No. Rep1 (Å)
Rep2 (Å)
Rep3 (Å)
614 1,907 1,697 1,651
615 1,686 1,73 1,774
616 1,479 1,727 1,592
617 1,925 1,875 0,77
618 1,421 5,417 1,077
619 0,81 1,424 1,599
620 1,573 1,221 1,653
621 1,81 1,523 1,702
622 5,441 5,425 1,444
623 1,672 1,283 2,009
624 1,66 1,612 5,307
625 1,628 5,377 5,421
626 1,324 5,458 1,337
627 1,756 1,44 1,44
628 1,472 1,266 1,189
629 1,882 5,405 5,461
630 1,16 1,418 5,454
631 1,166 1,34 1,651
632 1,144 1,104 1,121
633 1,953 5,392 1,135
634 1,223 0,795 0,914
635 1,342 1,123 1,329
636 1,32 1,129 1,169
637 1,773 1,829 1,643
638 1,883 1,803 1,478
639 1,146 1,807 1,421
640 1,598 0,722 1,808
641 1,489 1,776 1,863
642 1,169 1,146 1,695
643 1,663 1,72 1,628
644 1,511 1,871 1,86
645 1,592 1,502 1,061
646 0,81 0,983 1,636
647 1,915 1,138 1,997
648 1,913 5,423 1,809
649 1,138 0,961 1,92
650 0,756 1,592 1,814
651 1,464 5,42 1,432
652 1,436 1,593 1,138
653 1,433 1,443 1,449
No. Rep1 (Å)
Rep2 (Å)
Rep3 (Å)
654 1,595 1,436 1,788
655 1,189 1,174 1,141
656 1,489 1,591 1,129
657 1,624 1,347 1,615
658 1,44 0,793 1,232
659 1,143 1,143 1,653
660 5,386 1,693 1,189
661 1,189 1,737 1,892
662 1,656 1,884 1,14
663 1,184 1,827 1,144
664 0,774 1,687 1,42
665 1,838 1,729 1,904
666 1,589 1,805 1,844
667 1,136 5,36 1,143
668 1,271 1,459 1,14
669 1,438 5,266 5,427
670 1,134 0,783 1,652
671 1,496 1,129 1,144
672 1,689 1,726 1,648
673 1,298 1,505 1,139
674 1,463 1,621 0,773
675 1,135 1,899 1,699
676 1,217 1,957 1,799
677 1,633 1,687 1,178
678 1,868 1,138 1,124
679 1,139 1,126 1,534
680 1,453 5,429 1,155
681 1,483 1,142 1,242
682 1,59 1,145 0,745
683 1,621 1,144 0,811
684 1,146 1,851 1,904
685 1,37 1,147 1,83
686 1,233 1,139 1,44
687 1,613 1,543 1,181
688 1,421 1,901 1,209
689 1,815 1,484 1,414
690 5,423 1,141 1,37
691 1,692 0,763 1,726
692 1,608 1,224 1,411
No. Rep1 (Å) Rep2 (Å) Rep3 (Å)
694 1,588 5,406 0,799
695 5,422 1,12 1,806
696 1,763 1,31 1,808
697 5,409 1,148 1,46
698 1,156 1,777 1,81
699 0,666 1,749 1,595
700 1,877 1,87 1,109
701 1,881 1,411 1,457
702 0,76 1,48 1,273
703 1,477 1,362 1,666
704 1,138 1,145 1,732
705 1,192 1,144 1,541
706 5,285 1,999 1,482
707 1,874 1,396 1,755
708 1,101 1,359 5,409
709 5,415 1,143 1,143
710 1,143 1,414 1,177
711 0,727 1,433 1,139
712 1,448 1,679 1,438
713 1,184 1,447 1,126
714 1,42 1,658 1,813
715 1,44 5,288 1,686
716 1,149 0,797 5,402
717 5,429 0,79 1,649
718 1,492 1,7 1,923
719 1,098 1,937 1,426
720 1,684 1,919 1,139
721 1,756 1,105 1,38
722 1,149 0,783 1,237
723 1,17 1,522 1,126
724 1,428 1,486 1,674
725 5,391 1,711 1,671
726 1,673 1,432 1,131
727 1,904 1,537 0,786
728 0,789 1,168 1,138
729 5,403 1,631 1,571
730 1,151 1,14 1,436
731 0,8 1,518 1,689
732 5,37 1,803 1,178
733 1,157 1,833 1,141
No. Rep1 (Å)
Rep2 (Å)
Rep3 (Å)
734 1,477 1,182 1,809
735 1,661 1,152 1,299
736 1,436 1,045 1,083
737 1,352 5,406 1,998
738 1,151 0,742 1,147
739 1,182 1,151 1,562
740 1,362 1,046 1,163
741 1,804 1,831 5,332
742 1,148 1,15 1,698
743 0,889 1,475 1,425
744 1,144 1,229 1,562
745 1,829 1,88 1,439
746 1,933 5,444 1,665
747 1,479 1,789 1,933
748 1,171 1,821 5,422
749 1,141 1,885 1,706
750 1,551 0,817 1,425
751 1,44 1,806 1,102
752 1,231 0,739 1,449
753 1,451 1,682 5,453
754 1,639 1,594 5,455
755 1,509 1,14 1,122
756 1,813 0,762 1,718
757 1,573 1,661 1,456
758 5,397 1,448 1,592
759 1,429 1,183 1,135
760 1,438 1,424 1,42
761 5,42 1,144 1,442
762 1,326 1,819 1,689
763 1,147 1,14 1,143
764 1,165 0,732 1,641
765 1,464 1,139 1,439
766 1,716 1,657 1,354
767 1,95 1,9 1,437
768 1,933 0,788 1,432
769 5,426 1,154 1,429
770 1,14 1,146 5,421
771 1,134 1,746 1,415
772 1,439 1,807 1,928
773 1,136 1,436 1,823
No. Rep1 (Å)
Rep2 (Å)
Rep3 (Å)
774 5,276 5,429 1,15
775 1,464 1,749 1,295
776 1,462 1,184 1,532
777 1,652 1,144 1,142
778 1,197 1,439 1,119
779 1,673 1,555 1,245
780 1,445 1,473 1,155
781 1,436 1,456 1,421
782 1,911 1,009 1,727
783 5,381 1,174 1,751
784 1,44 1,179 1,138
785 5,42 1,03 1,145
786 1,439 1,174 1,745
787 1,145 1,616 1,913
788 0,739 1,432 1,424
789 1,137 1,702 1,816
790 1,767 1,262 1,142
791 1,385 1,765 1,168
792 1,12 1,438 1,461
793 1,362 1,652 1,145
794 1,947 1,415 1,524
795 1,19 1,446 1,679
796 1,145 1,744 1,767
797 1,691 1,654 1,232
798 1,68 1,586 1,129
799 1,5 1,467 1,19
800 5,426 1,074 1,493
801 1,808 1,137 1,156
802 5,468 1,794 1,39
803 1,478 1,67 1,717
804 1,441 1,483 1,263
805 1,393 5,417 0,814
806 1,62 1,638 1,7
807 1,693 1,907 1,203
808 1,167 1,945 1,154
809 1,737 1,713 0,719
810 1,721 1,147 1,178
811 1,662 1,262 1,48
812 2,03 0,727 1,569
No. Rep1 (Å) Rep2 (Å) Rep3 (Å)
814 1,144 1,202 1,268
815 1,428 1,925 1,6
816 2,116 1,292 1,403
817 1,864 0,792 1,807
818 1,146 1,408 1,795
819 1,579 1,167 1,135
820 0,758 0,826 1,454
821 1,692 1,438 1,215
822 1,434 1,147 5,44
823 1,269 1,594 1,172
824 1,108 1,597 5,42
825 1,141 1,902 1,535
826 5,471 5,416 1,727
827 1,151 1,987 1,826
828 1,057 1,14 1,67
829 1,144 1,901 1,564
830 5,32 0,788 1,516
831 1,484 1,444 1,147
832 1,621 5,265 1,203
833 1,595 1,496 1,47
834 1,773 0,751 1,598
835 1,628 0,829 1,594
836 1,142 1,403 1,77
837 1,721 2,035 1,916
838 1,719 0,841 1,15
839 1,138 1,426 1,38
840 1,124 1,122 1,706
841 1,51 1,791 0,884
842 0,761 1,464 1,179
843 1,143 1,741 1,229
844 1,141 1,094 1,631
845 1,144 0,799 1,438
846 0,743 1,147 1,588
847 1,13 1,142 0,981
848 1,172 1,457 1,74
849 0,882 1,145 5,424
850 5,392 1,755 1,69
851 1,444 1,078 5,401
852 1,242 0,71 1,979
853 1,667 1,217 1,537
No. Rep1 (Å)
Rep2 (Å)
Rep3 (Å)
854 1,416 1,521 1,424
855 1,143 1,706 1,795
856 1,647 1,84 1,558
857 0,759 1,64 1,811
858 1,438 1,179 1,441
859 1,386 1,849 5,434
860 1,137 2,033 5,352
861 1,904 0,748 1,46
862 0,75 5,422 1,397
863 5,405 1,144 1,143
864 1,457 1,445 1,332
865 0,624 1,178 1,813
866 1,516 1,709 1,137
867 1,485 1,193 1,367
868 1,144 1,426 1,874
869 1,59 1,666 1,95
870 1,146 1,437 1,493
871 1,143 1,641 1,487
872 1,42 1,755 1,475
873 5,377 1,995 1,289
874 1,153 1,143 1,399
875 5,413 1,287 0,782
876 1,148 1,599 1,074
877 1,8 1,66 1,659
878 1,47 1,438 1,183
879 1,18 1,361 1,455
880 1,694 5,303 1,701
881 1,451 1,602 1,76
882 1,387 1,408 1,171
883 1,2 5,405 1,181
884 1,917 1,695 1,135
885 0,781 1,751 1,144
886 1,145 1,922 1,141
887 1,796 1,438 1,157
888 1,142 1,855 1,149
889 1,241 1,437 1,435
890 0,75 1,682 1,67
891 1,261 1,81 1,532
892 5,315 1,777 1,776
893 5,415 1,139 1,441
No. Rep1 (Å)
Rep2 (Å)
Rep3 (Å)
894 1,52 1,147 1,49
895 1,549 1,821 1,584
896 1,43 1,435 1,148
897 1,149 1,186 0,793
898 1,919 1,167 1,725
899 1,589 1,144 1,395
900 0,785 0,799 1,437
901 1,141 1,921 1,515
902 1,108 1,153 1,768
903 1,858 1,672 1,237
904 1,667 1,15 1,557
905 1,603 1,551 1,253
906 1,972 2,107 1,523
907 5,464 1,098 1,462
908 1,175 5,384 1,879
909 1,697 1,502 1,389
910 1,655 1,6 1,879
911 1,323 1,148 1,459
912 1,928 1,82 0,714
913 1,457 1,458 1,793
914 1,13 1,217 1,442
915 1,309 1,898 1,437
916 5,434 1,805 1,723
917 1,807 5,403 1,102
918 1,869 1,141 1,113
919 1,681 1,433 0,781
920 1,474 0,766 1,466
921 1,824 1,493 1,384
922 1,91 1,809 1,145
923 1,664 0,68 1,161
924 1,44 5,41 1,139
925 1,439 1,558 1,318
926 1,441 1,17 5,409
927 1,565 1,592 0,776
928 1,757 1,818 1,744
929 5,416 1,683 1,548
930 1,591 5,444 1,147
931 1,677 1,581 1,437
932 0,963 1,459 1,485
No. Rep1 (Å) Rep2 (Å) Rep3 (Å)
934 1,578 1,438 1,658
935 1,142 1,292 1,463
936 1,439 1,141 1,394
937 1,298 1,703 1,816
938 1,142 1,141 1,14
939 1,137 1,447 1,899
940 1,401 1,335 1,376
941 1,528 1,903 1,145
942 1,553 1,52 1,308
943 1,08 5,442 1,171
944 1,668 1,702 1,476
945 1,6 1,45 1,746
946 1,133 1,845 5,248
947 0,773 1,526 1,698
948 1,183 1,437 1,185
949 1,685 1,811 1,911
950 1,809 5,401 1,697
951 1,431 1,656 1,7
952 1,502 1,44 0,808
953 1,759 0,783 1,573
954 1,447 1,138 1,439
955 1,385 1,591 1,495
956 1,417 1,683 1,527
No. Rep1 (Å)
Rep2 (Å)
Rep3 (Å)
957 1,165 1,329 5,426
958 1,178 1,461 5,449
959 1,699 1,312 1,805
960 1,661 1,157 1,913
961 1,144 1,443 1,708
962 1,157 5,432 1,542
963 5,38 1,896 1,707
964 1,66 1,417 1,168
965 1,823 1,097 1,678
966 1,217 1,751 1,658
967 1,441 1,149 1,509
968 1,938 1,599 1,728
969 1,588 5,436 1,486
970 1,129 1,823 1,454
971 1,641 1,186 1,089
972 1,135 1,146 1,975
973 1,808 1,894 1,486
974 1,608 1,138 5,42
975 1,683 0,739 1,52
976 1,837 1,188 1,164
977 1,452 1,438 5,357
978 0,797 1,818 1,796
979 0,639 1,087 1,439
No. Rep1 (Å)
Rep2 (Å)
Rep3 (Å)
980 1,972 1,612 1,697
981 1,697 1,648 1,595
982 1,38 1,851 5,328
983 1,314 1,662 1,142
