# Ko r esp o n d e n si: Balai Rise t Per ikan an Bu d id aya Air Payau d an Pe nyu lu h an Pe rikan an. Jl. Makm u r Dg . Sitakka No .1 2 9 , Mar o s 9 0 5 1 2 , Su lawe si Se lat an , In d o n e sia.
Te l. + 6 2 4 1 1 3 7 1 5 4 4
E-m ail: mulyani ngrum@ kkp.go.i d
Tersedia online di: ht t p://ej ournal-balit bang.kkp.go.id/index.php/j ra
RESPONS IM UN UDANG W INDU Penaeus monodon TERHADAP VAKSIN dsRNA VP-24 PADA DOSIS BERBEDA
Sri Redjeki Hesti M ulyaningrum#, Andi Parenrengi, Bunga Rant e Tam pangallo, dan Ike Trismawanti
Balai Riset Perikanan Bu didaya Air Payau dan Penyu luhan Pe rikanan
(Naskah dit erima: 10 November 2017; Revisi final: 12 Febr uari 2018; Diset ujui publikasi: 12 Februar i 2018)
ABSTRAK
Peningkatan produksi udang windu Penaeus monodon terus diupayakan, salah satunya dengan peningkatan respons imun udang terhadap infeksi penyakit WSSV. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui respons imun udang terhadap pemberian vaksin dsRNA VP-24 pada berbagai dosis. Konstruksi vaksin dsRNA VP-24 dilakukan menggunakan Megascript kit dengan DNA genom VP-24 sebagai t emplat e. Vaksinasi dilakukan dengan metode injeksi pada udang windu yang berukuran rata-rata 15,88 ± 3,50 g; dosis vaksin yang diujikan adalah 0,02 µg; 0,2 µg; 2 µg; dan sebagai kontrol adalah udang yang tidak diberi vaksin. Penelitian terdiri atas empat perlakuan dosis vaksin dengan masing-masing dua ulangan dan dipelihara selama lima hari. Uji tantang dilakukan selama enam hari dengan menginjeksi virus WSSV dalam saline solut ion (1:3 v/v). Pengamatan terhadap sintasan udang windu dilakukan setiap hari, sedangkan penghitungan total hemocyte (THC) dan ProPO diamati pada hari I, III, dan VI setelah diinfeksi WSSV. Pada akhir pengujian dilakukan pengambilan jaringan hepatopankreas untuk analisis histopatologi. Analisis data dilakukan secara statistik dengan analisis ragam (ANOVA). Hasil yang diperoleh memperlihatkan bahwa injeksi vaksin dsRNA VP-24 dengan dosis 0,2 µg memiliki pengaruh yang signifikan terhadap sintasan dan respons imun udang windu (P< 0,05). Vaksin dsRNA VP-24 dengan dosis 0,2 µg mampu memberikan sintasan udang windu P. monodon sebesar 65% dan meningkatkan respons imun udang dengan THC (1.550 x 10t sel/mL) dan ProPO (0,042 Abs).
KATA KUNCI: dsRNA; VP-24; P. monodon; WSSV; dosis
ABSTRACT: Response immune of black tiger shrimp Penaeus monodon to dsRNA VP-24 vaccine on different doses. By: Sri Redjeki Hesti M ulyaningrum, Andi Parenrengi, Bunga Rante Tampangallo, and Ike Trismawanti
One of t he effort s t o increase t he product ion of t iger shrimp Penaeus monodon is increasing t he immune response against WSSV disease. This st udy aims t o evaluat e shrimp immune response t o dsRNA VP-24 vaccinat ion at various doses. The const ruct ion of dsRNA VP-24 vaccine was performed using M egascript kit wit h t he VP-24 DNA genome as a t emplat e. The vaccinat ion was done by inject ion met hod on shrimp sized 15.88 ± 3.50 g. The t est ed vaccine doses (t reat ment s) were 0.02 ¼ g; 0.2 ¼ g; 2 ¼ g; and unvaccinat ed shrimp as t he cont rol. The st udy consist ed of four t reatment s of vaccine doses wit h two replicat es for each t reat ment . The challenge test was performed by inject ing t he WSSV virus in saline solut ion (1:3 v/v). The obser vat ion on shrimp sur vival rat e was done daily, while the t otal hemocyt e count (THC) and ProPO obser vat ion were performed on t he 1st day, 3rd day, and 6t h day aft er WSSV infect ion. At t he end of t he experiment , samplings of hepat opancreas for analysis were performed. Dat a were st at ist ically analyzed using ANOVA. The present st udy indicat ed t hat t he inject ion of 0.2 ¼ g dsRNA VP-24 vaccine had a significant effect on t he survival rat e and immune response of shrimp (P< 0.05). The dose of 0.2 ¼ g dsRNA VP-24 had result ed in 65% of sur vival rat e and increased immune response of P. monodon wit h THC (1,550 x 10t cell/mL) and ProPO (0.042 Abs).
PENDAHULUAN
Udang merupakan salah satu sumberdaya perikanan ya n g b e r n ila i e k o n o m is t in g g i ya n g b a n ya k dib udid ayakan t e rut am a ud ang vanam e Lit openaeus vannamei dan udang windu P. monodon (Tassanakajo n et al., 2013). Kemampuan replikasi yang cepat dan viru le nsi p at o ge n yan g ekst rem m enjad ikan WSSV sebagai isu glo bal. Invert ebrat a sepert i udang t idak m e m ilik i lim fo s it d a n a n t ib o d i fu n g s io n a l (imunoglobulin) dan karenanya sistem kekebalan tubuh udang dikenal sebagai sist em kekebalan ‘no n-spesifik’ at au ‘bawaan’. Pada art hro poda, udang merupakan satu di ant ara spesiesnya, mengandalkan sist em kekebalan bawaan, yang t erdiri at as sist em kekebalan humo ral dan seluler t erhadap infeksi virus (Li & Xiang, 2013). Pada invert ebrat a, vaksin berfungsi sebagai st imulan kekebalan t ubuh no n-spesifik (Ro wley & Po pe, 2012).
Virus WSSV merupakan virus double-st randed DNA (dsDNA) t erbent uk dari makro molekul ko mpleks yang s e c a r a s p e s ifik m e le k a t d a n d is u s u n u n t u k perlindungan dan transfer geno m virus. Gen-gen WSSV yan g dit ranskripsikan pada fase lanjut (lat e phase) meliput i gen-gen yang menyandi pro t ein st rukt ural ut ama WSSV yait u VP-28, VP-26, VP-24 , VP-19, dan VP-15. Viral pro t ein ini berpeluang un t uk dijadikan se b aga i va ksin re ko m b in an (Sá n ch e z-Paz, 2 0 1 0 ). Tekno lo gi int erferensi RNA (RNAi) merupakan t eknik vaksinasi DNA reko mbinan yang spesifik dan efekt if unt uk menghambat replikasi virus dengan int ro duksi smal l int er fer ence (si)RNA m au p u n double-st r anded (d s)RNA p ad a t arge t ge n viru s (Haq et al., 2 0 1 2 ; Jayachandran et al., 2012; Thammaso rn et al., 2015). Tekno lo gi vaksinasi menggunakan agen virus dsRNA berkembang sangat pesat t erut ama dibidang medis, pert anian, dan akuakult ur (Jin et al., 2010; Lichner et al., 2003; Ro wley & Po pe, 2012). Di bidang akuakult ur, t e k n o lo g i in i b a n ya k d ik e m b a n g k a n u n t u k menanggulangi penyakit yang disebabkan o leh virus pada udang (Mejía-Ruíz et al., 2011; Ahanger et al., 2 0 1 4 ). Be b e r a p a p e n e lit ia n va k s in a s i u d a n g menggunakan agen WSSV sebagai sumber vaksin telah menunjukkan kemajuan dan mempero leh hasil yang menggembirakan (Huang et al., 2014; Kumar et al., 2015; Puneet h et al., 2017).
Iso lasi dan karakt erisasi gen virulen WSSV VP-24, t elah berhasil dilakukan (Tenriulo et al., 2015), namun p e m a n fa a t a n n ya s e b a g a i va k s in d s RNA u n t u k m e n in gka t kan re sp o n s im u n u d an g win d u m asih memerlukan kajian yan g lebih lanjut . Penelit ian ini b ert u ju an un t u k m en ge t ah ui resp o n s im u n ud an g windu Penaeus monodon t erhadap pemberian vaksin dsRNA VP-2 4 dengan do sis yang berbed a secara in persiapan t emplat e DNA, pro duksi dsRNA, nuclease di-gest ion, dan purifikasi. CGA CTC ACT ATA GGG AGA CGC GGA TCC GAT GCA CAT GTG GGG GGT TTA C-3 ’. VP-24 reverse : 5 ’-TA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA CCG GAA TTC TTA TTT TTC CCC AAC CTT AAA CAG-3’.
Am p lifik a s i fr a g m e n DNA d ila k u k a n p a d a t her macycler (Gen e Am p PCR Syst e m 27 0 0, Ap plie d Bio syst em) dengan suhu annealing 72°C menggunakan kit PureTaq Ready-To-Go PCR Beads (GE Healt h care ). Se b a n ya k 1 µL g e n o m VP-2 4 s e b a g a i t em pl at e direaksikan dengan primer mix (primer T7 VP-24
re-verse dan forward masing-masing 1 µL) dan dH2O hingga volume total 25 µL., amplikon selanjutnya
d ip is a h k a n d e n g a n m e n g g u n a k a n t e k n ik elekt ro fo resis menggunakan marker 100 bp pada gel agaro se 2% pada t egangan 50 vo lt selama dua jam. dengan inkubasi pada 75°C selama lima menit . dsRNA yang dipero leh kemudian didiamkan pada suhu kamar selama 3-4 jam, selanjut nya disimpan pada suhu -20°C at au -80°C.
Nuclease Digestion
Sebanyak 20 µL dsRNA yang dihasilkan direaksikan
dengan nuclease free wat er, 10x digest ion buffer, DNase, dan RNase. Larut an diinkubasi pada suhu 37°C selama s a t u ja m d an d s RNA ya n g d ih a s ilka n k e m u d ia n dipurifikasi.
Purifikasi dsRNA
Purifikasi dsRNA dilakukan d engan mereaksikan
50 µL dsRNA dengan nuclease free wat er, 10x binding
se n t r ifu gas i, u n t u k m e m is ah k an su p e rn at a n d an homogenat . Ho mogenat yang dipero leh dicuci dengan w ash sol ut ion d a n di sent r i fug e, h o m o g e n a t ya n g dipero leh kemudian diberi elut io n so lutio n (95°C) dan di sent r i fuge ke m b ali. Su p e rn at a n ya n g d ip e ro le h merupakan dsRNA murni sebagai bahan vaksin. Hasil dsRNA yang dipero leh merupakan bahan vaksin dsRNA VP-24 yang akan diaplikasikan pada hewan uji.
Vaksinasi Udang W indu dengan Vaksin dsRNA VP-24
Va k s in a s i d ila k u ka n d e n g a n m e t o d e in je k s i int ramuskular pada udang windu berukuran rat a-rat a (15,88 ± 3,50 g) dan panjang rat a-rat a (11,91 ± 1,11 cm ). Do s is va k s in ya n g d iu jik a n m e r u ju k p a d a penelit ian Lo y et al. (2012) yakni: 0,02 µg/ekor; 0,2
µg/ekor; dan 2 µg/ekor dan udang yang diinjeksi
dengan saline solut ion (SS) tanpa vaksin sebagai ko nt ro l. Ud a n g ya n g t e la h d iva ks in d ip e lih a ra p a d a b a k t erko nt ro l yang berukuran 80 cm x 80 cm x 60 cm yang dilengkapi dengan aerasi, dengan kepadat an 10 e k o r /b a k s e b a n ya k t ig a u la n g a n . Pe m e lih a r a a n d ilaku ka n se lam a lim a h ari, k e m u d ian d ilaku k an pengukuran THC dan pro PO sebagai data awal sebelum dilakukan uji t ant ang. pat o genit asnya. Virus WSSV dipero leh dari hemo lim u d a n g w in d u ya n g t e r in fe k s i W SSV. He m o lim kemudian disent rifuge pada 3.000 g selama 20 menit pada suhu 4°C. Supernat an yang dipero leh diambil dan disent rifuge kembali pada 8.000 g selama 30 menit pada s u h u 4 °C. Su p e r n a t a n ke m u d ia n d ifilt e r d e n ga n menggunakan cellulose nit rat e membrane filt er 0,2 µm. Hasil yang dipero leh disimpan dalam biofreezer (-80°C) s e b a g a i s t o k vir u s WSSV. St o k WSSV ke m u d ia n d ie n ce rkan de n gan SS pe rban din gan 1:3 (v/v) dan
diinjeksikan ke udang dengan volume 100 µL/ekor.
Pengamat an t erhadap udang yang t elah diinfeksi WSSV dilakukan selama enam hari. Sint asan udang diamat i set iap hari, sedangkan pengamat an t erhadap THC dan pro PO dilakukan pada awal sebelum injeksi WSSV, h a r i ke -1 , 3 , d a n 6 . Pe n g a m a t a n p ro PO didasarkan pada pengukuran absorbansi menggunakan L-DOPA se b ag ai s u b s t rat . He m o lim u d a n g d ib e ri
a n t iko a g u la n Tr is o d iu m cit r a t e 3 ,8 % ke m u d ia n disentrifuge pada suhu 4°C dengan kecepatan 1.000 rpm s e la m a 2 0 m e n it . Ho m o g e n a t ya n g d ip e r o le h d ila r u t k a n d e n g a n cocodyl at e ci t r at e buf f er d a n disent rifuge, pro sedur ini diulang hingga dua kali dan ho mo genat yang dipero leh dibagi dua. Sat u sampel ho mo genat digunakan unt uk pengukuran t ripsin dan sat u sam p e l yan g lain u n t u k p e n gu ku ran LDOPA. Masin g-masing sam pe l diukur abso rbansin ya p ad a spekt ra 490 nm. Pada akhir pengujian dengan WSSV, dilakukan pengambilan sampel hepat o pankreas untuk analisis hist o pat o lo gi.
Pe n e lit ia n d ir a n ca n g d e n g a n r an can g a n a ca k lengkap (RAL) menggunakan analisis ragam (ANOVA), d e n gan e m p at p e rlaku an d an d u a u lan gan u n t u k masing-masing perlakuan do sis vaksin. Dat a hist o lo gi dianalisis secara deskript if.
HASIL DAN BAHASAN
Sintasan Udang W indu
Pengamatan t erhadap sintasan udang windu selama uji t ant ang memperlihat kan pemberian vaksin VP-24
dengan dosis 0,2 µg mampu meningkatkan sintasan
udang sebesar 65% dibandingkan kontrol (10%) (Gambar 1). Hasil analisis ragam (ANOVA) menunjukkan bahwa pemberian vaksin dsRNA VP-24 memberikan pengaruh yang signifikan t erhadap sint asan udang (P< 0,05).
Pen elit ian t e rdahu lu o leh Krishnan et al. (200 9) melapo rkan bahwa konst ruksi vaksin DNA reko mbinan m a m p u m e m p r o t e k s i u d a n g w in d u h in g g a 6 2 % t e r h a d a p s e r a n g a n W SSV. Sa r a t h i et a l. (2 0 1 0 ) m em p e ro le h m o rt alit as ko m u lat if u d an g win d u P. monodon seb esar 37% dengan injeksi dsRNA VP-24. Sintasan yang dipero leh pada penelit ian ini lebih t inggi dari hasil yang dipero leh o leh Puneet h et al. (2017) yang mempero leh sint asan udang windu sebesar 50% dengan injeksi vaksin VP-24 in vivo dengan do sis 2,5
µg/g bobot udang.
Fungsi VP-24 pada siklus hidup WSSV belum banyak d ik e t a h u i, VP-2 4 t e r b u k t i t id ak d a p at m e n g ika t m e m b r a n s e l in a n g . Ha s il p e n e lit ia n t e r d a h u lu membukt ikan adanya interaksi langsung 24 dan VP-28 masing-masing membent uk ko mpleks pro t ein dan b erpart isip asi dalam in fe ksi viru s se cara be rsama-sama. Menurut Chen et al. (2007), gen penyandi VP-2 4 m e m iliki p e r a n se b a ga i p e n gh u b u n g p r o t e in st ru kt u ral d ari p ro t e in VP-2 8, VP-26 , WSV-1 0, d an pro t ein lain unt uk membent uk ikat an ko mpleks pada amplo p virus. Anti-VP-24 IgG dapat mencegah serangan WSSV secara signifikan (Xie & Yang, 2006).
d ip e rkirakan me m iliki p e ran dalam p en gikat DNA WSSV, m emben t uk p o ro s nukleo pro t ein ( nucleopro-t ein core) dan berperan dalam infeksi sist emik pada ud an g, d an d ap at m en st im ulasi mu nculnya sist em kekebalan pada udang windu (Underwoo d et al., 2013).
Pa d a h e w a n a k u a t ik t e r u t a m a k r u s t a s e a , mekanisme int ereferensi RNA t erjadi pada beberapa t ahap, pada saat dsRNA diinduksi ke dalam sel t arget t e rle b ih d ah u lu t e rjad i p e m b e n t u kan siRNA yan g
pemberian vaksin sebesar 0,2 µg (1.550 x 10t sel/mL)
d an t e re n d a h p ad a k o n t ro l (4 9 0 x 1 0t se l/m L).
Pemberian vaksin dsRNA VP-24 t erhadap udang windu m e m b e rika n p e n ga ru h yan g s ig n ifika n t e r h a d a p penghit ungan jumlah hemo sit , THC (P< 0,05). Pada ko nt ro l t erjadi penurunan THC set elah dilakukan uji t an t an g (Ga m b a r 3 ). Me n u r u t Ye h et al. (2 0 0 9 ), t e r ja d in ya p e n u r u n a n THC p a s c a u ji t a n t a n g disebabkan o leh bermigrasinya sel hemo sit dari sistem sirkulasi t ubuh menuju jaringan, dengan banyaknya sel yang t erinfeksi. Infeksi WSSV yang berada pada fase kr it is m e n ye b a b kan t e rjad in ya re aksi s e l-se l h e m o s it u n t u k m e la ku k a n b e rb a g ai m e k a n is m e
pert ahanan t ubuh yang t erdiri atas pro ses pengenalan pat o gen, fago sit o sis, melanisasi, dan sit o t o ksisit as.
Pada pemberian vaksin dengan dosis 2 µg juga terjadi
penurunan jumlah THC, menurut Harikrishnan et al. (2011) pemberian imuno st imulan melebihi do sis o p-t imal dapap-t menyebabkan imuno supresi pada udang uji, t et api dap at mempro t eksi ikan /udang t erhadap se ran gan p e n yakit . Efe kt o r u t am a s e l-se l s ist e m ke ke balan t u b uh p ad a kru st ase a ad alah h e mo sit , sement ara hepat o pankreas bert anggung jawab unt uk bio sint esis dari beberapa fakto r humoral. Peningkatan sel-sel hemo sit dalam t ubuh udang berperan pent ing dalam menghambat atau menghancurkan pato gen yang masuk ke dalam t ubuh udang. Pada ud ang, sepert i dalam krust asea lainnya, t e rdap at t iga jenis ut ama hemo sit (sel darah) yakni sel hialin, sel semi-granular dan sel granular (granulo sit ), yang semuanya berperan dalam kekebalan tubuh dan pertahanan terhadap infeksi penyakit . Pemberian imuno st imulan yang dilakukan s e ca r a t e r u s -m e n e r u s d a p a t m e n g a t u r d a n mempert ahankan sist em imun pada ko ndisi o pt imal s a m p a i d e n g a n p e m b e r ia n b e r h e n t i d ila k u k a n
vaksin dsRNA VP-24 dengan dosis 0,2 µg (0,042 Abs) dan terendah pada dosis 0,02 µg (0,012 Abs) seperti
disajikan pada Gambar 3.
Gambar 1. Sint asan udang windu pada aplikasi vaksin dsRNA VP-24 secara in vit ro.
Figure 1. Sur vival rat e of P. monodon on in vit ro dsRNA VP-24 vaccine appli-cat ion.
Hasil an alisis ragam (ANOVA) m e mp e rlih at kan bahwa perlakuan do sis vaksin memberikan pengaruh yang nyat a pada akt ivit as pro PO (P< 0,05). Akt ivit as Pro PO meningkat pada 24 jam hingga 72 jam set elah d iin jeksi. Paria et al. (2 0 13 ) me m p ero leh h asil u ji t ant an g WSSV p ada p en gu jian d sRNA VP-2 8 pad a u d a n g win d u t id ak m e m b e r ikan p e ru b a h an yan g signifikan pada ekspresi gen pro PO hingga 24 jam, namun t erjadi peningkat an ekspresi hingga t iga kali lipat pada 48 jam set elah injeksi.
Pro PO merupakan ko mpo nen mayo r pada sist em imunit as ‘innat e’ pada udang. Sist em kekebalan no n-spesifik seluler memiliki dua ko mpo nen ut ama yakni sist em humo ral dan seluler, keduanya bekerja secara b e r s a m a -s a m a d a n d ia k t ifk a n p a d a s a a t t e r ja d i t ant angan kekebalan . Ko mp o ne n selu le r d ime diasi o le h h e m o s it s e d a n g k a n h u m o r a l m e lib a t k a n ko mpo nen yang bebas dari sel hemo lymph. Keduanya bersifat int erakt if dan saling t erkait yang berfungsi s e ca r a s in e r g is u n t u k m e lin d u n g i u d a n g d a n Gambar 2. Jumlah hemo sit udang windu pada aplikasi vaksin dsRNA VP-24 dengan
do sis berbeda.
Figure 2. Tot al hemocyt e count of black t iger shrimp P. monodon t est ed wit h dsRNA VP-24 vaccine applicat io n wit h diffenrent doses.
0 500 1000 1500 2000
0 0.02 0.2 2
T
H
C
(
x
1
0
4se
l/
m
L
)
T
H
C
(
x
1
0
4
ce
ll
/m
L
)
Dosis vaksin (Vaccine doses) (µg) Awal (Init ial)
Hari ke-1 (1st day)
Hari ke-3 (3rd day)
Hari ke-6 (6t h day)
Gambar 3. Akt ivit as pro PO udang windu P. monodon dengan aplikasi vaksin pada do sis yang berbeda set elah diuji t ant ang dengan WSSV. Figure 3. ProPO act ivit y of black t iger shrimp P. monodon t est ed wit h different
doses of vaccine applicat ion aft er WSSV challenge. 0.000
0.020 0.040 0.060 0.080 0.100 0.120
0 0.02 0.2 2
P
ro
P
O
(
A
b
s)
Do sis vaksin (Vaccine doses) (µg) Awal (Init ial)
24 jam (24 ho urs)
72 jam (72 ho urs)
144 jam (144 hours) Awal (Initial)
Hari ke-1 (1st day)
Hari ke-3 (3rd day)
Hari ke-6 (6t h
day)
Awal (Initial)
24 jam (24 hours)
72 jam (72 hours)
menghilangkan part ikel asing dan pat o gen. Di ant ara berbagai jenis respo ns kekebalan humo ral, salah sat u t eknik imun invert ebrat a yang paling efekt if melawan part ikel asing adalah enkapsulasi melano t ik seluler. Melanisasi m erupakan ko mpo nen pert ahanan imun pada krust asea di mana sint esis melanin dilakukan dengan mengakt ivasi sist em pro PO yang melibat kan e n z im PO (Tassa n akajo n et al., 2 0 1 3 ). Ra n gka ian m e la n is a s i k o m p le k s m e m e r lu k a n k o m b in a s i p ere d aran h e m o sit in a d an b e b erapa p ro t e in yan g t erkait dengan sist em pengakt ifan pro pheno lo xidase (pro PO). Sist em ini merupakan salah sat u unsur hu-mo ral yang sering berhasil unt uk mengat asi penyakit pada invert ebrat a. Penurunan akt ivit as sist em pro PO d a p a t m e n ye b a b k a n k e g a g a la n fa g o s it o s is d a n menyebabkan kerusakan jaringan (Ampar yup et al., 2013).
Hasil analisis hist o pat o lo gi pada hepat o pankreas udang yang t erserang WSSV memperlihat kan adanya beberapa tingkat kerusakan sel hepatopankreas seperti inklusi badan, nekro t ik sel, peningkat an degenerasi le m ak, d an lisis se l (Gam b ar 4 ). Pad a Gam b ar 4 a t erlihat adanya hipert ro pi pada int i sel (Cowdry t
ype-A) t ipe inklusi yang merupakan t ahap awal infeksi vi-rus WSSV. Tahap t iga infeksi t erlihat pada Gambar 4b, di mana int i membran t erganggu dan zo na pembat as menjadi t ransparan, dan pada Gambar 4c t erlihat sel ya n g t e r in fe k s i r u sa k d a n m e n g ala m i lisis ya n g merupakan t ahap akhir infeksi WSSV.
Menurut Esco bedo -Bo nilla et al. (2008), pada t ahap awal t erin fe ksi virus WSSV, se l m e n u nju kkan in t i s e d ik it h ip e rt r o fi. Da la m s it o p la sm a , re t ik u lu m endo plasma (RE) menjadi membesar dengan berlimpah ribo so m bebas. Pada t ahap-2; dalam int i, mat erial fibril menginduksi pembent ukan membran yang segera diisi dengan mat eri int i virus membent uk ikat an viral. Pada t ahap ini, Cowdry-A jenis inklusi muncul sebagai zo na t ransparan ant ara viro genic st ro ma dan sangat padat elekt ro n berbat as kro mat in . Int i men jadi hipert ro fi dan bulat . Tahap-3 pada int i; n ukleo kapsid mu ncul dengan kerapatan elektron rendah dan secara bertahap t u mb u h d ari sat u u ju ng ke arah yan g lain , m asih t erbuka. Pusat inklusi int ranuklear muncul lebih kecil d ar i d ala m se l d a n le b ih p a d a t e le k t r o n k ar e n a k e h ad ir an p a rt ik e l vir u s ya n g b e r lim p a h . Ke t ik a kro mat in menghilang, int i membran t erganggu, dan
a
b
c
Gambar 4. Profil kerusakan sel hepatopankreas pada udang windu (skala bar= 10 µm): (a) badan inklusi (hit am) dan nekro t ik sel (merah); (b) peningkat an degenerasi lemak; dan (c) lisis sel dan degenerasi lemak.
zo na pembat as menjadi t ransparan menyat u dengan sit o plasma. Tahap-4 dalam int i, nukleo kapsid menjadi b e n ar-b e n ar t e rt u t u p o le h am p lo p viru s. Tah ap -5 merupakan t ahap akhir mo rfogenesis virus. Pada tahap a k h ir in i, s e l ya n g t e r in fe k s i r u s a k p a r a h d a n t erganggu, ruang vo id pada jaringan t eramat i sebagai sel hancur.
Hingga saat ini pe rso alan p en yakit u dan g yang disebabkan o leh virus WSSV belum dapat diatasi secara efekt if. Pem ah am an m en ge nai in t e raksi mo le ku le r virus pat o gen WSSV dengan inang dapat memberikan ko nt ribusi unt uk mengat asi perso alan penyakit WSSV pada udang (Verbruggen et al., 2016). Pro duksi vaksin dsRNA merupakan salah sat u upaya unt uk mengat asi perso alan WSSV yang didasarkan pada pemahaman in t e raksi mo lekuler viru s de ngan inan g. Dari hasil penelit ian ini diharapkan dapat memberikan implikasi pada peningkat an pro duksi udang windu P. monodon khususnya di Indo nesia melalui pencegahan penyakit WSSV.
KESIM PULAN
Hasil penelit ian menunjukkan bahwa do sis vaksin
dsRNA VP-24 sebesar 0,2 µg memiliki pengaruh yang
sign ifikan t e rh adap sin t asan (65 %), m e n in gkat kan jumlah hemo sit (1.550 x 104 sel/mL) dan respo ns imun
udang windu yang diindikasikan dari akt ivit as Pro PO (0,042 Abs).
UCAPAN TERIM A KASIH
Penelit ian ini dibiaya o leh APBN Tahun Anggaran 2017 Balai Rise t Perikanan Budidaya Air Payau dan Pe n yu lu h a n Pe r ik a n a n . Uc a p a n t e r im a k a s ih disampaikan kepada Ibu Andi Tenriulo, M.Si. yang telah banyak berko nt ribusi dalam pelaksanaan penelit ian, Drh . Wah yu n i d alam an alisis h ist o p at o lo gi, se rt a fro m WSSV infect io n using ant isense co nst ruct s. M ar. Biot echnol., 16, 63-73.
Ampar yup, P., Charo ensapsri, W., & Tassanakajo n, A. (2013). Pro pheno lo xidase syst em and it s ro le in shrimp immune respo nses against majo r pat ho -gens. Fish & Shellfish Immunology, 34, 990-1001. Cerenius, L., Jiravanichpaisal, P., Liu, H., & Sö derhäll,
I. (2 010). Crust acean immunit y. In Sö d erhäll, K. (Ed.), Invertebrat e immunity. New Yo rk, USA: Landes
Bio science and Springer Science Business Media, LLC, p. 239-258.
Chen, J., Li, Z., & Hew, C.L. (2007). Charact erizat io n o f a no vel envelo pe pro t ein WSV010 o f shrimp whit e spo t syndro me virus and its interactio n wit h a major viral st ruct ural pro t ein VP24. Virology, 364, 208-213.
Esco b e d o -Bo n illa, C.M., Alday-San z, V., Wille , M., So rge lo o s, P., Pe nsaert , M.B., & Nau wyn ck, H.J. (2008). A review o n t he mo rpho lo gy, mo lecular charact erizat io n, mo rpho genesis, and pat ho gen-esis o f whit e spo t syndro me virus. Journal of Fish Diseases, 31, 1-18.
Haq, MA.B., Vignesh, R., & Srinivasan, M. (2012). Deep insight int o whit e spo t syndro me virus vaccines: A review. Asian Pacific Journal of Tropical Disease, p. 73-77.
Harikrishnan, R., Balasundaram, C., & Heo , M. (2011). Impact o f plant pro duct s o n innat e and adapt ive immune syst em o f cult ured finfish and shellfish. Aquacult ure, 317, 1-15.
He, Y., Jua, C., & Zhanga, X. (2015). Ro les o f small RNAs in t he immune defense mechanisms o f crus-t aceans. M olecular Immunology, 68, 399-403. Huan g, P.Y., Leu , J.H., & Che n, L.L. (2014 ). A n ewly
ident ified pro t ein co mp lex t hat mediat es whit e spo t syndro me virus infect io n via chit in-binding pro t ein. Journal of General Virology, 95, 1799-1808. Jan e , M.S., Am ar, A., & Am ar, E.C. (2 0 1 5 ). Use o f immuno st imulans in shrimp cult ure: An updat e. Bio t echno lo gical advances in shrimp healt h man-agement in t he Philippines. Research Signpost, p. 45-71.
Jayachandran, B., Hussain, M., & Asgari, S. (2012). RNA In t e rfe re n ce as a ce llu lar d e fe n s e m e ch an ism against t he DNA virus baculo virus. Journal of Virol-ogy, 86(24), 13729-13734.
Li, F., & Xiang, J. (2013). Recent advances in researches o n t he innat e immunit y o f shrimp in China. Dev. Com. Immunol., 39, 11-26.
Lichner, Z., Silhavy, D., & Burgya´ n, J. (2003). Do uble-st rand ed RNA-b in ding p ro t e in s co uld su pp re ss RNA int erference-mediated ant iviral defences. Jour-nal of General Virology, 84, 975-980.
Lo y, J.D., Mo gler, M.A., Lo y, D.S., Janke, B., Kamrud, K., Scura, E.D., Harris, D.L.H., & Bart ho lo may, L.C. (2012). dsRNA pro vides sequencedependent pro -t e c-t io n agains-t infe c-t io us myo necro sis virus in Lit openaeus vannamei. Journal of General Virology, 93, 880-888.
Mejía-Ru íz, C.H., Ve ga-Pe ña, S., Alvare z-Ruiz, P., & Esco bedo -Bo nilla, C.M. (2011). Do uble-st randed RNA against whit e spo t syndro me virus (WSSV) VP28 o r VP26 reduced suscept ibilit y o f Litopenaeus vannamei t o WSSV, an d sur vivo rs e xhibit ed d e-creased suscept ibilit y in subsequent re-infect io ns. Journal of Invert ebrat e Pat hology, 107, 65-68. Paria, A., Greeshma, S.S., Chaudhari, A., Makesh, M.,
Pu rusho t h aman, C.S., & Rajen dran, K.V. (2 013 ). No n specific effe ct o f do u ble-st ran ded (ds) RNA o n p r o p h e n o lo xid a s e (p r o PO) e xp r e ss io n in Penaeus monodon. Appl. Biochem. Biot echnol., 169, 281-289.
Pu n e e t h , T.G., Ak h ila , D.S., De c h a m m a , M.M., Shreeharsha, J.M., Shivakumar, S.K., & Venugo pal, M.N. (2017). Co mparat ive efficacy o f dsRNA VP24, VP26, RR1 and WSV477 gene against WSSV infec-t io n in Penaeus monodon. Int . J. Curr. M icrobiol. App. Sci., 6(2), 665-674.
Reshi, M.L., Wu, J.L., Wang, H.V., & Ho ng, J.R. (2014). RNA int erference t echno lo gy used fo r t he st udy o f aquat ic virus infect io ns. Fish & Shellfish Immu-nology, 40, 14-23.
Ro wley, A.F., & Po pe, E.C. (2012). Vaccines and crus-t acean aq uaculcrus-t ure : A mechan iscrus-t ic exp lo racrus-t io n. Aquacult ure, 334-337, 1-11.
Sánchez-Paz, A. (2010). Whit e spo t syndro me virus: an o ver vie w o n an emergent co ncern. Vet . Res., 41(43), 34.
Sarat h i, M., Simo n , M.C., Ven kat esan , C., Tho mas, J., Ravi, M., Madan, N., Thiyagarajan, S., & Hameed, A.S.S. (2 0 10 ). Efficacy o f bact e rially exp re sse d dsRNA specific t o differen t st ru ct ural gen es o f whit e spo t syndro me virus (WSSV) in pro t ect io n o f shrim p fro m WSSV in fe ct io n. Jour nal of Fish Diseases, 33, 603-607.
Th a m m a s o r n , T., Sa n g s u r iya , P., Me e m e t t a , W., Senapin, S., Saro cha Jit rako rn, S., Rat t anaro jpo ng, T., & Saksmerpro me , V. (2015). Largescale pro -d u ct io n an -d an t ivira l e fficacy o f m u lt i-t a rg e t do uble-st randed RNA fo r t he prevent io n o f whit e spo t syndro me virus (WSSV) in shrimp. BM C Bio-t echnology, 15, 110-116.
Tassanakajo n, A., So mbo o nwiwat , K., Supungul, P., & Tang, S. (2013). Disco ver y o f immune mo lecules and t heir crucial funct io ns in shrimp immun it y. Fish & Shellfish Immunology, 34, 954-967.
Tenriulo, A., Tampangallo , B.R., Parenrengi, A., & Dewi, R.A. (2015). Iso lasi dan karakt erisasi gen penyandi pro t ein VP-24 WSSV pada udang windu (Penaeus monodon) unt uk pengembangan t ekno lo gi RNAi. Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakult ur, hlm. 593-598.
Under wo o d, D.J., Co wley J.A., & Jo hnso n, K.N. (2013). An t iviral im m u n it y an d p ro t e ct io n in p e n ae id shrimp. Review Art icle. Versit a, Invert ebrat e Immu-nit y, p. 2-14.
Verbruggen , B., Bickle y, L.K., Ae rle, R.V., Bat em an , K.S., St ent ifo rd, G.D., Sant o s, E.M., & Tyler, C.R. (2016). Mo lecular mechanisms o f whit e spo t syndro me virus infect io n and perspect ives o n t reat -ment s. Viruses, 8(23), 1-29.
