PRINSIP REKAYASA GENETIKA PADA TANAMAN

PRI NSI P REKAYASA GENETI KA PADA

TANAMAN

Suharsono

- Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi, I PB - Departemen Biologi, I PB

Transformasi Tanaman dengan

Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

: - gram negatif

- fitopatogen

- mentransformasi sel tanaman

Æ

tumor

Tumor:

transfer, integrasi dan

Proses pembentukan tumor

Tanaman luka

Æ

acetosyringone,

hydroxyacetosyringone

Æ

induksi gen

vir

Vir

:

• 25 gen di dalam 7 operon • di luar T-DNA

Plasmid Ti

T-DNA

1. iaaM (tms1) 2. iaaH (tms2) 3. tmr (ipt)

4. gen-gen penyandi opine • diekspresikan setelah

terintegrasi ke genom tanaman • ditransfer dalam bentuk utas tunggal linier, ujung 5’

membawa RB dan ujung 3’ LB

Sintesis auxin dan sitokinine

trp 2-monooxygenase

iaaM (tms1)

i-3-a hydrolase iaaH (tms2)

isopentenyl transferase

tmr (ipt)

isopentenyl adenosine monophosphate

Opine

• Sumber N dan C bagi A. tumefaciens

• Beberapa jenis

Kendala pemanfaatan pTi alami

1. Sel tidak dapat diregenerasi

Æ

gen fitohormon harus dibuang

2. Regenerasi sel terhambat karena N, dan C digunakan untuk membentuk opine

Æ

gen opine harus dibuang 3. Ukuran pTi terlalu besar

Æ

segmen DNA yang tidak penting harus dibuang 4. Tidak dapat melakukan replikasi di

E. coli

Vektor derivatif dari pTi Mengandung

1. gen penanda seleksi (

hpt

,

npt

)

2. Ori di

E. coli

(kadang: + Ori di

A. t

) 3. RB dari T-DNA (sering: + LB)

4. Situs pengklonan (MCS)

Vektor ekspresi pTi -tidak mempunyai

vir

1. Vektor biner

1. Vektor biner • Ori E. coli, A.t

• Tidak ada vir

• A.t resipien:

-disarmed pTi: tidak ada T-DNA, ada vir

2. Vektor kointegrasi

Rekombinasi vektor pengklonan + disarmed pTi Æ vektor (vir, T-DNA)

Biolistik

• partikel diselimuti DNA+ CaCl, spermidine/ PEG

Biolistik dengan YAC

GEN REPORTER

• menyeleksi sel yang tertransformasi • kuantifikasi ekspresi gen

2 macam:

• gen penanda seleksi dominan

• gen yang produknya dapat dideteksi: #

β

-D-glucuronidase:

* 5-bromo-4-chloro-3-indolyl

β

-D-glucuronide acid

Æ

biru

* 4-methylumbelliferyl

β

-D-glucuronide

Æ

fluorescent (fluorometer)

# GFP (green fluorescent protein): penanda in vivo; sinar UV atau biru (tanpa substrat)

Æ

Manipulasi ekspresi gen di tanaman • Pilih Promoter

9

Promoter 35S CaMV: konstitutif kuat, di seluruh jaringan, sepanjang hidup

9

Promoter SSU rubisco: aktif di daun (jaringan fotosintetik)

Faktor penentu tingkat ekspresi lainnya

• enhancer: terletak di hulu promoter (1-ratusan bp) • intron: stabilitas mRNA

• terminator

Perbandingan promoter 35S dengan promoter komposit

Produksi protein di kloroplast/ mitokondria

Strategi:

• Gen penyandi fusi protein sasaran+ peptida signal Æ inti sel • Gen penyandi protein sasaran Æ kloroplast/ mitokondria

Sel daun: 50-100 kloroplast @ 10-100 kopi DNA

¾insersi gen di kloroplast Æ produksi protein > insersi di kromosom

¾Cara: GOI + marker diapit oleh sekuen DNA kloroplast Æ

Sekresi protein

Produksi protein di tanaman mahal

9

untuk purifikasi (90% )

APLI KASI REKAYASA GENETI KA TANAMAN

Tujuan utama bioteknologi tanaman: merakit

kultivar baru

Perakitan tanaman resisten terhadap serangga

Strategi:

• insektisidal protoksin oleh Bacillus thuringiensis • inhibitor

α

-amilase

Contoh sifat yang diperbaiki

Kapas-Bt Kapas biasa

Bt

Non Bt

K

a

p

a

Meningkatkan ekspresi

• memotong gen (tersisa N-terminal yang mengandung toksin)

• menggunakan promoter kuat

Perbandingan aa protoksin dari berbagai strain B.t:

ƒ

98% ujung N

Æ

terkonservasi; ujung C bervariasi

ƒ

aktivitas: 646 aa pertama dari ujung N (protoxin: 1156 aa)

Ekspresi toxin Bt

Manduca sexta Heliothis zea

Usaha menaikkan ekspresi protoksin

1. Mutagenesis situs terarah: mengubah sekuen yang menghambat transkripsi dan translasi

Æ

95.6% smdg WT

Æ

10 x produk WT

2. Modifikasi sekuen

Æ

sintesis secara kimia

Æ

kodon yang biasa di tanaman

Æ

78.9% smdg WT

Æ

100 x produk WT

3. Menggunakan promoter SSU rubisco + peptida transit + sekuen termodifikasi

Æ

over produksi di kloroplast

Æ

produk sangat tinggi (1% protein

daun)

Keuntungan ekspresi protoksin di kloroplast

1. Jumlah kloroplast tiap sel banyak

Æ

multi kopi gen protoksin

Æ

produk tinggi

2. Tidak ada resiko penyebaran gen ke lingkungannya melalui polen

Kerugian:

Ekspresi gen penyandi protoksin

B.

Strategi lain mencegah serangan serangga

- Cowpea trypsin inhibitor

• menghambat

H. virescens

- Potato proteinase inhibitor I I

• penggerek batang merah muda (

Sesamia inferens

) - I nhibitor

α

-amylase

• kumbang

Callosobruchus maculatus, C. chinensis

-Cholesterol oxidase

•

Anthonomus grandis grandis

(coleoptera) -Lektin

Pencegahan resistensi serangga terhadap B.t

B.t. sebagai agen seleksi

Æ

serangga resisten

Cara pencegahan:

• Ekspresi protoksin Bt dibatasi pada waktu singkat

Æ

promoter PR-1a

Æ

Bt diinduksi oleh pathogen atau asam salisilat atau asam poliakrilat

• Fusi 2 gen toksin

Æ

protein toksin hibrid

• Kombinasi: Bt + insektisida lain (inhibitor

α

-amilase) • Kombinasi: Bt + insektisida kimiawi dosis rendah

Tanaman resisten terhadap virus

Resistensi alami:

• mencegah transmisi virus

Ekspresi protein mantel

Tanaman transgenik:

Resistensi terhadap banyak virus

Tanaman resisten terhadap herbisida

Tanaman resisten herbisida:

1. Menghambat penyerapan herbisida

2. Produksi protein sasaran herbisida secara berlebihan

Æ

protein aktif masih ada

3. Mengurangi kemampuan protein sasaran mengikat herbisida

4. Menginaktivasi herbisida melalui metabolisme 2-4: melalui perakitan tanaman transgenik

• Nitrilase (dari

Klebsiella ozaenae

) menginaktivasi herbisida bromoxynile

Æ

tanaman resisten

• Herbisida bromoxynil

Tanaman resisten terhadap fungi dan bakteri

Æ

ekspresi pathogenesis-related (PR) protein:

β

-1,3-glukanase, chitinase, thaumatin-like protein, protease inhibitor, asam salisilat

Ekspresi asam salisilat di tanaman • Resisten terhadap fungi dan bakteri

Tanaman toleran terhadap cekaman dan

senesen

Ekspresi SOD:

• tahan panas, herbisida methyl viologen (paraquat), layu (bunga potong)

Toleran terhadap cekaman garam/ kering

• perlu osmoprotectant:

¾

gula, alkohol, prolin, trehalose, D-ononitol, mannitol, sorbitol, glisin betain,

3-methylsulfoniopropionate

Penundaan buah masak dan bunga layu

Buah masak:

• ekspresi polygalacturonase dan cellulase • diinduksi

Æ

dihambat: masak buah tertunda (layu bunga, gugur daun tertunda)

Mengalihkan jalur sintesis etilen

Manipulasi genetik pigmentasi bunga

Antosianin (flavonoid)

Æ

pigmen bunga

Chrysanthemum + cDNA CHS sense/ antisense

Î

bunga putih

Astaxanthin:

• pink (salmon, udang)

• dari bakteri & mikroalga

• mencegah telur rusak karena UV

• meningkatkan daya hidup & laju tumbuh

Æ

antioksidan

Produksi astaxanthin:

-ekspresi cDNA

β

-caroten ketolase (

β

-C-4

Modifikasi kandungan nutrisi tanaman

memperbaiki:

-kualitas nutrisi: jagung, kacang polong (kandungan aa di biji)

-komposisi asam lemak dari tanaman penghasil minyak

Meningkatkan kandungan lisin

Over produksi lisin:

menghentikan feedback

inhibition oleh aspartokinase & dihydrodipicolinic acid synthase

Æekspresi gen DHDPS lysin-feedback-insensitive dari

Corynebacterium & AK lysin-feedback-insensitive dari E. coli

Kandungan lipid

Kanola transgenik: antisense gen stearate

Mengganggu RNA tanaman

Modifikasi fenotipe: downregulation dari ekspresi gen Æ menghambat mRNA

Cara:

• ekspresi kopi tambahan (cosuppression) • ekspresi antisens

• ribozim Æ molekul kecil RNA Æ endoribonuklease spesifik

stearoyl-ACP U9 desaturase: asam stearat Æ asam oleat; stearat meningkat Æ margarin dan minyak goreng

Vitamin A

Mamalia: β-carotene (provitamin A) Æ vitamin A

β-carotene: pigmen karotenoid pada membran tanaman fotosintetik

Ekspresi β-carotene di beras via A. t:

ƒ 1: Phytoene synthase (psy)

(pglutellin) & phytoene desaturase (crt) (p35S) tanpa smg + peptida transit plastid

ƒ 2: Lycopene b-cyclase (lcy)

(pglutellin) + peptida transit plastid

ƒ 1+ 2 Æ padi Æ beras mengandung β -carotene shg berwarna kuning/ emas

Modifikasi rasa dan tampilan tanaman

Polifenol oksidase: oksidasi monofenol/ o-difenol Æ o-quinon

Æ perubahan warna buah/ sayuran

Perubahan warna dihambat dengan menghambat sintesis polifenol oksidase

Kentang:

Æ antisense polifenol oksidase + p35S/ pGBSSÆ resisten thd black spot

Æ Sense polifenol oksidase Æ tidak tahan

(Granule-bound starch synthase)

Pemanis

Monellin:

-Dioscoreophyllum cumminsii

-3000 x lebih manis darpd sukrosa

-Dimer: rantai A 45 aa, B 50 aa dengan ikatan lemah nonkovalen

-Rusak oleh: panas, asam

Kandungan pati

Kentang: 20-30 amilosa (rantai lurus); 70-80% amilopektin (rantai bercabang) Æ rasio keduanya: perubahan sifat fisik & kimia pati

Amilosa: ikatan α-1,4

Amilopektin: ikatan α-1,4 dan α-1,6

Biosintesis pati

Glukan+ glukan Æ α-1,6 Æ amilopektin

Tanaman sebagai bioreaktor

Antibodi

Keunggulan tanaman drpd bakteri: integrasi DNA di genom tanaman lebih stabil, protein mengalami pemrosesan spt di sel hewan, lebih murah

(produksi antobodi per gram di sel hibridoma: $ 5000, bakteri: $ 1000,

Produksi biopolimer

Biosintesis poly (3-hydroxybutyric acid) dari acetyl-CoA

Alcaligenes eutrophus

Acetyl Co-A Acetoacetyl Co-A D-3-Hydroxybutyryl co-A PHA

Acetoacetyl Co-A reductase Poly(3-hydroxybutyric acid) synthase 3-ketothiolase

PHA: bioplastik, di A. eutrophus Æ 1 operon Æ tidak dikenal tanaman Æ ekspresi 3 gen terpisah: A. thaliana Æ target ke kloroplast

@ gen + peptida transit di kloroplast ssu rubisco + p35S Æ pTi biner

Mengubah kandungan lignin

Lignin:

tinggi Æ mutu pulp dan hijauan pakan rendah

PERKEMBANGAN REKAYASA GENETI KA

TANAMAN

• Adopsi tanaman transgenik pesat

– 1996: 2.8 jt ha (AS, Kanada, Argentina,

Brasil, Afsel, China)

Æ

2003: 67.7 jt ha (18 negara)

– 4 komoditas penting: kedelai, jagung, kapas, kanola

– 2 sifat: resisten herbisida, resisten hama (penggerek)

Tahun Jumlah negara Luas (juta ha)

1996 6 1.7

1997 8 11.0

1998 8 27.8

1999 14 39.9

2000 13 44.2

2001 13 52.6

2002 16 58.7

2003 18 67.7

2004 20 81.0

2005 21 90.0

2006 22 102.0

Jumlah negara dan luas tanaman transgenik

No Crop 2002 (% )

2005 (million ha) %

2006

(million ha) %

1 Soybean 62

21 12 5 -100

54.4 50 58.6 57

2 Maize 21.2 24 25.2 25

3 Cotton 9.8 11 13.4 13

4 Canola 4.6 5 4.8 5

5 Alfalfa - - < 0.1 < 1

6 Rice < 0.1 < 1 < 0.1 < 1

7 Others < 0.1 < 1 < 0.1 < 1

TOTAL 90.0 100 102.0 100

No Trait 2005 (million ha) %

2006

(million ha) %

1 Herbicide Tolerance

(HT) 63.7 71 69.9 68

2 I nsect Resistance (Bt) 16.2 18 19.0 19

3 Bt/ HT 10.1 11 13.1 13

4 Virus Resistance < 0.1 < 1 < 0.1 < 1

TOTAL 90.0 100 102.0 100

James 2006