20 BAB III
METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian yang dilakukan bersifat eksperimental dengan desain penelitian berupa rancangan acak lengkap (RAL). Terdapat dua variabel yaitu variable bebas berupa ekstrak daun Ceremai (Phyllantusacidus (L) skeels) dengan konsentrasi 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%dan variable terikat berupa pertumbuhan jamur Candida albicans. Sebagai kontrol negatifnya adalah aquadest dan sebagai kontrol positifnya adalah ketokonezol.
Pemeriksaan menggunakan metode difusi agar cara kirby bauer dengan melihat zona hambat yang terbentuk. Pengulangan dilakukan sebanyak 4 kali yang didapat dari perhitungan menggunakan rumus fredere yaitu (t-1) (n-1) ≥ 15.
B. Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Poltekkes Tanjung Karang Jurusan Analis Kesehatan yang dilaksanakan pada bulan Februari sampai April 2020.
C. Subyek Penelitian
Daun ceremai (Phyllantusacidus (L) skeels) yang diambil adalah daun yang segar tidak cacat fisik yang diakibatkan oleh jamur. Daun ceremai kemudian dijadikan ekstrak lalu dibuat kosentrasi 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%. Yang digunakan sebagai larutan uji dalam menghambat pertumbuhan Candida albicans. Jamur Candida albicans didapat dari Laboratorium Mikologi Balai Laboratorium Kesehatan Propinsi Lampung.
D. Variabeldan Definisi Operasional Penelitian
Tabel 3.1 variabel dan definisi operational penelitian
No Variabel Definisi Cara ukur Alatukur Hasilukur Skala 1 Variabel
Bebas Ekstrak daun ceremai (Phyllantus acidus (L) skeels)
Daun ceremai dibuat simplisia kemudian dibuat ekstraksi dengan etanol 96% dan dilakukan pengenceran
Pengenceran dengan rumus V1 x %1 V2 X %2
Pipet ukur dan labu ukur
Ekstrak daun ceremai (Phyllantus acidus (L) skeels) 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%.
interval
2. Variabel Terikat Pertumbuhan jamur Candida albicans
Jamur Candida albicans adalah jamur dimorfik yang tumbuh pada suhu 37ºC.
Habitat
normalnya adalah membran mukosa manusia dan hewan berdarah panas, tumbuh sebagai ragi (yeast), jamur ini dapat ditemukan pada mukosa mulut, usus, dan vagina (Soedarto, 2015).
Metode difusi cakram kirby bauer (mengukur diameter zona hambat)
Jangka sorong
Besar zona hambat dalam kategorikan:
1.<10 mm memiliki daya hambat lemah.
2.10-15 mm memiliki daya hambat sedang 3.16-20 mm memiliki daya hambat kuat 4.>20mm memiliki daya hambat sangat kuat (Puthera er al., dalam Alfiah, 2015)
ordinal
E. Pengumpulan Data
Pengumpulan data dilakukan dengan cara sebagai berikut:
1. Prosedur penelitian
a. Pembuatan surat izin penelitian dan pemesanan strain jamur Candida albicans.
b. Pengumpulan bahan-bahan pemeriksaan.
c. Identifikasi sampel
Daun ceremai yang didapat dideterminasikan di Laboratorium Botani Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung. Sedangkan strain dari Laboratorium Mikologi Balai Laboratorium Kesehatan Provinsi Lampung.
d. Pembutan simplisia daun Ceremai
e. Pembuatan ekstrak daun Ceremai di Laboratorium Kimia Organik Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.
f. Pengenceran larutan uji menjadi konsentrasi 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% Pengujian ekstrak daun ceremai terhadap pertumbuhan jamur Candida albicans
g. Mengamati zona hambat yang terbentuk pada masing-masing konsentrasi dan diukur menggunakan alat ukur jangka sorong dalam satuan (mm)
2. Metode pemeriksaan
Difusi cakram dengan agar Kirby bauer
3. Prinsip pemeriksaan
Cakram kertas filter yang mengandung sejumlah obat tertentu ditempatkan diatas permukaan medium padat yang telah diinokulasi pada permukaan dengan organisme uji. Setelah inkubasi, diameter zona jernih inhibisi di sekitar cakram diukur sebagai ukuran kekuatan inhibisi obat melawan organisme uji tertentu (Jawetz, 2008).
4. Alat dan Bahan a. Alat
Alat yang digunakan tabung reaksi, cawan petri, mikropipet+tip, inkubator, autoclave, Erlenmeyer, lampu spritus, pipet ukur, vacum pump, ose, pinset, neracaanalitik, kapas, botolgelap, kainhitam, alumunium foil, kertas kopi, jangkasorong , hot plate, dan oven.
b. Bahan
Aquadest steril, standar MacFarland 0,5, lartan uji ekstrak daun ceremai (Phyllantusacidus (L) skeels) dengan konsentrasi 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, Sabouroud Dextrose Agar (SDA). Strain murni Candida albicans, kontrol negatif menggunakan aquadest sterildan sebagai kontrol positif mengunakan kentonazole.
5. Cara kerja a. Sterilisasi alat
Semua alat gelas yang akan digunakan dicuci dengan bersih dan dikeringkan, lalu masing-masing dibungkus dengan kertas kopi, disterilkan dalam oven suhu 160ºC selama 60 menit (Soemarno, 2000)
b. Pembuatan larutan kloramfenikol
Setiap 1000 ml saboraud dextrose agar memerlukan 400 mg kloramfenikol, setiap 250 mg kloramfenikol dilarutkan dalam 10 ml NaCl 0,85%, maka untuk 400 mg diperlukan NaCL 0,85% sebanyak
x 10 ml
= 16 (Soemarno, 2000).
c. Pembuatanmedia agar dari Saboraud Dextrose Agar
Sebanyak 65 gram Saboraud Destrose Agar bubuk ditambahkan dengan 1000 ml aquades, diaduk kemudian dipanaskan. Setelah larutan sempurna ditambahkan larutan kloramfenikol (untuk mencegah timbulnya kuman
kontaminan), lalu media di sterilkan di autoclave pada suhu 121ºC selama 15 menit pada tekanan 1 atm. Setelah disterilkan media dituangkedalam cawan petri yang telah disterilkan dan dibiarkan dingin (Soemarno, 2000).
d. Uji steril media
Media yang telah selesai dibuat, diambil beberapa plate kemudian inkubasi 35-37ºC selama 2 hari. Apabila ada pertumbuhan 2 koloni saja per plate itu diaggap tidak steril (Soemarno, 2000).
e. Pembuatan larutan standar macfarland 0,5
Dengan cara dicampurkan 9,95 ml larutan H2SO4 1% dengan 0,5 ml larutan BaCl2.2H2O 1% sehingga volume menjadi 10 ml dengan perkiraan jumlah mikroba yaitu 1,5 x 1 , dikocok sampai homogen. Larutan harus dikocok setiap akan digunakan untuk membandingkan suspensi jamur (Soemarno, 2000).
f. Pembuatan NaCl 0,85%
Ditimbang 0,85 gram NaCl dilarutkan dalam 100 ml aquadest steril, homogenkan.
g. Identifikasi jamur Candida albicans
1) ditanam jamur padamedia SDA plate lalu diamati koloni jamur Candida albicans yang tumbuh
2) diambil koloni jamur dari media SDA yang telah ditanam tadi, kemudian diletakan pada permukaan objek glass.
3) Dilakukan pewarnaan gram atau dengan meneteskan LPBC (lactofenol cotton blues) pada koloni yang telah diletakan di objek glass tadi kemudian tutup dengan cover glass.
4) Diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran awal 10X kemudian lanjut perbesaran 40X.
h. Pembuatan suspensi media Candida albicans
i. Biakan murni Candida albicans, dibuat suspensi dengan menambahkan larutan NaCl 0,85% di dalam tabung, homogenkan dengan vortec mixer sampai didapat kekeruhan yang disesaikan dengan standar mac farlan 0,5.
Jika kurang keruh, maka suspensi ditambah koloni jamur Candida albicans sedangkan jika lebih keruh maka ditambah NaCl 0,85% (Soemarno, 2000).
j. Pembuatan simplisia
Pembuatan simplisia diambil 3 kg daun ceremai segar, kemudian dicuci dengan air mengalir dan tiriskan. Daun ceremai dikeringkan dengan cara ditutup dengan kain. Simplisia yang telah kering lalu diserbuk dengan cara diblender dan disimpan dalam wadah yang kering.
k. Pembuatan ekstrak daun ceremai dengan metode maserasi
Simplisia yang telah dihaluskan dimasukkan kedalam botol berwarna gelap volume 2000 ml, sebanyak 10 bagian, ditambahkan larutan etanol 96%
sebanyak 75 bagian dan didiamkan selama 5 hari ditempat yang terlindung cahaya dengan pengadukan 2-3 kali setiap hari, filtrate dan presipitat menggunakan kertas saring (maserat 1).
Presipitat kembali direndam dengan etanol 96% sebanyak 25 bagian (500 ml) kemudian disaring dengan kertas saring (maserat 2).
Maserat 1 dan maserat 2 dicampur dan diuapkan dengan menggunakan evaporator sampai diperoleh ekstrak kental, ekstrak diuapkan kembali d hotplate dengan suhu 60ºC. kemudian dilakukan pengulangan untuk memastikan bahwa ekstrak sudah tidak megandung pelarut lagi (ekstrak 100%). Ekstrak kemudian disimpan diwadah berbahan gelas yang steril, bersih, dan kering.
V1 x %1 = V2 x %2 Keterangan:
V1 = volume larutanuji yang dipipet (ml)
%1 = konsentrasilarutanuji (100%)
V2 = volume larutanuji yang diinginkan (ml)
%2 = konsentrasi yang akandibuat (%) l. Pelaksanaan uji daya hambat
1) Disiapkan media yang telah mengeras.
2) Kedalam suspense jamur yang telah distandarisasi kekeruhannya, dicelupkan lidi kapas steril, ditunggu sebentar agar suspense meresap kedalam kapas, kemudian lidi kapas steril diangkat dan diperas dengan cara menekannya pada dinding tabung dalam sambil diputar-putar.
3) Dipulaskan lidi kapas tersebut ke dalam permukaan media SDA sampai seluruh permukaan tertutup rapat dengan pulasan, dilakukan 3x pulasan pada permukaan media dengan membolak balik lidi kapas pada setiap pulasan, dari pulasan I ke pulasan II plate diputar 90º sedangkan dari pulasan II ke pulasan III plate diputar 45º.
4) Dibiarkan media SDA tersebut diatas meja selama 5 menit agar suspense jamur meresap kedalam media, kemudian dilakukan penempelan disc obat yang telah direndam dalam ekstrak ceremai pada SDA dengan masing-masing media diberi 2-3 disc obat, degan cara menaruh disc diperumukaan media dengan pinset lalu ditekan sedikit sehingga disc obat menempel pada media SDA dengan jarak antar disc obat lebih kurang 15 mm.
5) Lempengan agar diinkubasi pada suhu 25ºC selama 2 x 24 jam (Jawetz, 2008) 6) Zona bening yang terbentuk di sekitar disc obat diukur diameternya dengan menggunakan jangka sorong melalalui tengah disc sebagai diameter daya hambat ekstrak daun ceremai (Phyllantus acidus (L) skeels) terhadap pertumbuhan jamur Candida albicans. Prosedur dilkukan sebanyak 3 kali pengulangan (Soemarno, 2000).
7) Interpretasi penentuan kategorik respon hambatan pertumbuhan jamur dapat dilihat pada tabel 3.1 (Puthera et al., dalam Alfiah 2015).
Tabel 3.2 klasifikasi respon hambatan pertumbuhan jamur
Diameter Zona Bening Respon Hambtan Pertumbuhan
<10 mm 10 - 15 mm 16 - 20 mm
>20 mm
Lemah Sedang Kuat Sangat kuat
m. Skema kerja pemeriksaan
Sumber : (Soemarno, 2000) Disiapkan daun ceremai (Phyllantusacidus (L) skeels)
Pembuatan ekstrak daun ceremai (Phyllantusacidus (L) skeels)
Dibuat konsentrasi 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%
disc obat dimasukan ke dalam larutan uji dan direndam selama 15 menit agar larutan uji menyerap ke dalam disc obat
Biakan murni Candida albicans
Kontrol negatif aquadest steril
Pengolahan data Pengukuran zona hambat dalam
satuan mm
Diinkubasi pada suhu selama 2 x 24 jam
Penempelan disc obat larutan ui serta kontrol positif dan negatif pada media SDA dengan masing maising media berisi 2-3 disc obat Pembuatan suspensi
Candida albicans
Suspensi jamur yang sudah distrandarisasi kekeruhannya, dicelupkan lidi kapas steri, dogoreskan lidi kapas steril pada permukaan media SDA dibirkan media SDA diatas meja selama
5 menit Kontrol
positif kentonazole Pembuatan media
Sabooround Dextrose Agar (SDA) dituangkan ke dalam cawan petri steril dengan ketebalan ± 4 mm.
Kesimpulan
F. Pengolahan Dan Analisa Data
Diantaranya dibagi menjadi dua analisis diantaranya sebagai berikut:
1. Analisa univariat
Analisa univariat yang dilakukan tiap variabel dari hasil penelitian dengan melihat rata-rata diameter zona hambat ekstrak daun ceremai terhadap pertumbuhan Candida albicans.
2. Analisa bivariat
Analisa bivariat dilakukan dengan uji ANOVA, bila ada perbedaan dilanjutkan ke uji T, melihat konsentrasi yang menghasilkan diameter zona hambat. Analisis data bertujuan untuk membandingkan terhambatnya pertumbuhan jamur Candida albicans dilihat dari rerata diameter zona hambat yang terbentuk dari masing-masing konsentrasi ekstrak daun ceremai (Phyllantusacidus (L) skeels) yaitu konsentrasi 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, pada metode difusi cakram agar kirby bauer.
G. Ethical Clearence
Penelitian yangdilakukan atas izin komisi etik, penelitian ini tidak akan menimbulkan bahaya bagi lingkungan, limbah yang dihasilkan dari proses penelitian ini dikumpulkan dan dimusnahkan dalam penanganan limbah.
Limbah larutan uji yaitu ekstrak daun ceremaiditangani dengan cara langsung dibuang pada saluran pembuangan, karena limbah larutan tidak membahayakan lingkungan. Limbah media plate serta limbah suspensi jamurCandida albicans pada tabung dimusnahkan dengan cara perebusan pada suhu 100ºC selama 30 menit, limbah suspensi jamur Candida albicans yang telah direbus dibuang pada saluranpembuangan, lalu plate dan tabung direbus kembali dengan deterjen, setelah itu air bekas rebusan dibuang pada saluran pembuangan, plate dan tabung dicuci menggunakan deterjen pada air mengalir.
