bio.unsoed.ac.id PEMBUATAN MEDIUM KULTUR JARINGAN- Oleh: Drs. Iman Budisantoso, MP**

I.

PEMBUATAN

MEDIUM KULTUR

JARINGAN-Oleh:

Drs.

Iman

Budisantoso, MP**

PENDAHULUAN

Perbanyakan tanaman dengan sistem

Kultur

Jaringan dilaksanakan dalam

suatu laboratorium

yang

aseptik,

baik

peralatan maupun bahan-bahannya. Peralatan

sederhana yang masih sederhana dapat digunakan yaitu almari penabur (ent kas) buatan

sendiri

ataupun dengan peralatan laboratorium

kultur jaringan

khusus

yang

lebih canggih seperti Laminar

Air

Flow Cabinet.

Salah satu

faktor

penentu keberhasilan pelaksanaan

kerja kultur

jaringan

adalah pemberian

nutrisi

dalam

jumlah

dan perbandingan yang benar pada medium

kultur.

Medium yang

dipergunakan pada

kultur

in

vitro

tumbuhan ada

bermacam-macam. Pemilihan medium tergantung pada

jenis

tanaman yang digunakan, selerao

tujuan serta perhitungan masing-masing

peneliti

(George

Z.

Shenington, 1984 dalam

Indrianto,

A,2002).

Pada dasamya

tidak

ada satu macam medium

kultur

yang dapat memberikan pertumbuhan

optimal untuk

ssmua sel, penggantian medium atau salah

satu

komponen

medium seringkali

diperlakukan

untuk

merespon

setiap

type pertumbuhan dan satu macam eksplan.

PEMBUATAN MEDIUM

KULTT]R

Sebelum membuat medium, maka

terlebih

dahulu

kita

harus menentukan

medium apa yang akan

kita

buat. Jenis medium dengan komposisi unsur

kimia

yang berbeda dapat digunakan untuk media tumbuh dari jaringan tanaman yang berbeda pula.

Misalkan, medium Vacin Went sangat baik untuk media tumbuh Anggrek, tetapi tidak

{

cocok untuk media tumbuh tanaman yang lain. Untuk menanam eksplan dari tanaman keras sering menggunakan medium WPM, sedangkan untuk tanaman semusim (sayuran

dan tanaman hias) sering menggunakan medium MS. Medium Knudson C hanya cocok untuk menanam eksplan kelapa Kopyor dan Anggrek.

Untuk

membuat

medium

kultur

jaringan,

biasanya menimbang

setiap

:

bahan

kimia

yang terdapat pada resep media dasar. Bahan

kimia

media seperti hara makro, sukrosa, agar-agar dapat ditimbang biasa, sementara untuk bahan media seperti

*) _{Disampaikan pada Kegiatan Program Keluarga Harapan @KFI) Desa} Banteran Sumbang, pada Tanggal 1 Okt 2015.

**) _{Dosen Tetap Fakultas Biologi Unsoed}

II.

hara

mikro,

besi, vitamin, hormon dan

mio-inositol

karena ukuran sangat

kecil

maka harus dilakukan dengan cara membuat larutan stok supaya takaran sesuai dengan resep

yang

ditentukan.

Untuk

pembuatan larutan

stok

harus cermat,

jangan terlalu

pekat

karena dapat

terjadi

pengendapan

bila

disimpan

dalam

lemari

€S,

bila

terjadi pengendapan

harus

dipanaskan

dulu

sebelum digunakan

dan

bila

terkontaminasi mikoorganisme tidak boleh digunakan lagi.

2.1. Carupembuatan larutan stok, media MS, stok hara mikro.

Sebagai contoh akan diuraikan tentang cara pembuatan larutan stok mikronutrien

pada medium MS. Mikronutrien yang diperlukan jumlahnya sangat sedikit, maka stok

mikronutrien harus dibutat dalam satu wadah sebagai stok campuran.

Di

bawah

ini

akan

dibuat larutan stok

(Ari

Indrianto, 1990) dengan volume 500

ml

(100

kali

konsentrasi). Dalam contoh

ini

sengaja dibuat 100

kali

konsentrasi. Tujuannya adalah supaya dalam penimbangan komponen bahan

kimia tidak

mengalami ksesulitan sebab berat bahan

kimia

tersebut sangat

kecil

(CoCl2.6H2O

beratnya

0,025

mili

gram).

Apabila

konsentrasi

dikalikan

100 maka penimbangan menjadi

2,5

mili

gram sehingga tidak

telalu

kecil

dan

tidak sulit

untuk

ditimbang. Langkah-langkah pembuatannya ialah

sebagai berikut :

(a) Menimbang bahan-bahan

kimia

mikronutrien dengan timbangan

analitik

masing-masing sebanyak: MnSOa.HzO ZnSOq.4HzO

HrBO:

KJ NaMoO+.2HzO CuSOa.SHzO CoClz.6HzO 2.230,0 mg 860,0 mg 620,0 mg 83,0 mg 25,4 mg 2,5 mg 2,5 mg

(b)

Bahan-bahan tersebut dimasukkan satu per satu ke dalam gelas piala 500

ml

yang berisi air suling sebanyak 300

ml.

Setiap

kali

dimasukkan bahan kimia harus segera

dilarutkan (botol erlenmeyer digoyang-goyang pelan-pelan dengna arah memutar).

Kemudian

bahan-bahan

berikutnya

dimasukkan.

Apabila

semua

bahan kimia

*) Disampaikan pada Kegiatan Program Keluarga Harapan _@KH) Desa Banteran Sumbang pada Tanggal I Ok:t 2015.

**) _{Dosen Tetap Fakultas Biologi Unsoed}

dimasukkan secara bersamaan, dapat

terjadi

presipitat (endapan).

Apabila

bahan

kimia tersebut adayang sukar dilarutkan, dapat menggunakan alat magnetic stirer. (c) Larutan yang sudah

jadi

kemudian ditambah air suling sampai volume menjadi 500

ml.

(d) Botol-botol tersebut ditutup dengan rapat, kemudian diberi label :

Mikronutrien

100

kali,5

mVl.

(e) Untuk membuat 1

liter

medium memerlukan 5

ml

stok, dan untuk membuat 50

ml

medium

memerlukan

2,5

ml

stok.

Untuk

larutan

stok besi

karena komponen

Na2.EDTA

dan

FezSO+.7HzO

sukar

larut

di

dalam

air

suling, maka

perlu ditambahkan beberapa tetes HCl, dan kemudian dipanaskan.

2.2.

Stok Zat Pengatur tumbuh

Penentuan

zat

pengafiir

tumbuh yang akan

digunakan memerlukan pengetahuan

tentang

cara

menghitung dosisnya.

Hal

ini

sangat penting karena

apabila perhitungannya

keliru

dapat berakibat fatal bagi pertumbuhan

jaringan.

Seperti telah

diuraikan

di

muka bahwa zat pengatur tumbuh dengan dosis yang terlalu tinggi justru

akan mnghambat pertumbuhan kalus.

Zat

pengafix tumbuh hanya diperlukan dalam

jumlah

sedikit

sekali. Biasanya zat pengatur tumbuh

ini

dibuat dengan kepekaan 1-10

mg/ml.

Menurut Indrianto (1990), cara membuat larutan stok

IAA, NAA,

2,4-D sebanyak 100

ml

dengan dosis 1000 ppm (1

mg/l

ml) adalah sebagai berikut :

(1)

Bahan sebanyak 100 mg ditimbang dan setiap bahan dituangkan ke dalam gelas

piala 100 ml yang berisi air suling kira-kira 70 ml.

(2)

Sambil diaduk, diteteskan

sedikit

larutan

KOH

1

N

dengan

hati-hati

sampai

{

_{larut benar}

_(ernih).

(3) Larutan dipindahkan dalam labu

takar

100

ml

dan ditambah

air

suling sampai volume menjadi 100 ml.

(4) Memindahkan larutan ke dalam wadah stok, kemudian ditutup rapat-rapat, dan

diberi

label

IAA

(1

mg/ml),

NAA

(l

mg/ml),

2,4'D (1

mg/ml), atai

IBA

(l

mg/mD. Selanjutnya disimpan dalam almari es.

(5)

Untuk

membuat perlakuan auksin pada media

I

ml

stok setara dengan

I

mg auksin.

*) _{Disampaikan pada Kegiatan Prograrn Keluarga Harapan @KH)} Desa Banteran Sumbang pada Tanggal I OL1 2015.

**) _{Dosen Tetap Fakultas Biologi Unsoed}

Sisa

dari

larutan stok dapat disimpan dan dapat digunakan

lagi

apabila membuat medium yang lain. Jika larutan stok yang tersedia tadi dalam dosis 1000 ppm, dan diumpamakan pembuatan medium yang baru memerlukan larutan stok dengan dosis

2

ppm sebanyak 500

ml,

maka larutan stok yang akan

kita

ambil

dapat dihitung

dengan rumus sebagai berikut :

VlMl

:

Vzlvlz

Vl

=

Ml

=

volume larutan stok yang dicari (x) dosis larutan stok yang tersedia

V2 :

volume medium Yang akan dibuat

M2 =

dosis medium Yang akan dibuat

Maka perhitungannya adalah sebagai berikut :

VlMl

=

Vzlvl2

x.1000

=

500.2

x

:

l

mVliter

Berarti untuk

membuat medium dengan

volume

500

ml, kita

mengambil larutan stok sebanvuL

'

509 t 1= 0,5m1

"

1000 2.3. Carc Membuat Medium MS

Komposisi hormon dalam media sangat bervariasi, tergantung

dari

spesies

atau varietas tanaman yang dikembangbiakan, eksplan yang dipakai, dan tujuan dari

kultur.

Oleh

karena

itu,

penambahan

zat

pengatur tumbuh

tidak

dapat diterapkan

kadarnya.tidak dapat diterapkan kadarnya.ikut

ini

dijelaskan tahap-tahap pembuat

medium yang diperjelas dengan skema pembuatan medium MS (Gambar- 20).

*) _Disampaikan pada Kegiatan Program Keluarga Harapan (PKII) Desa Banteran Sumbang, pada Tanggal I Okt 20 I 5 _'

**) _{Dosen Tetap Fakultas Biologi} Unsoed

Makro nutrien

Sukrosa

Gambar 20. Skema pembuatan medium MS volume

I

liter

*) _{Disampaikan pada Kegiatan Program Keluarga Harapan (PKII) Desa Banteran Sumbang, pada Tanggal I Okt 2015.}

**) _{Dosen Tetap Fakultas Biologi Unsoed}

tlkurpH

5.7

_-5.

BilapH

kurang tambah KOH

Bila

pH lebih tambah

HCL

Tambahkan aquades sampai volume menjadi 1000

ml

Masukkan

AGAR-AGAR,

pan{Nkan sampai larut sambil diaduk dengan

pengaduk kaca

Tuangkan larutan dalam erlenmeyer atau botol

kultur

Tutup botol dengan kapas dan alumunium

foil,

lalu

STERILISASI

2.4. Keterangan Gambar :

1.

Menyiapkanalat-alat yang

akan

digunakan,

yaitu

:

timbangan

analitilq

tabung erlenmeyer, gelas

ukur,

gelas piala,

pipet,

pengaduk

kac4 stirer,

kompor gas,

kerta pH, botol medikum, aluminium

foil,

kapas (boleh tidak).

2.

Bahan

kimia

makro nutrien dan setiap larutan

stok

sudah dipersiapkan dengan

dosis

l

mfml.

3.

Aquades sebanyak kurang lebih 300 ml dalam labu erlenmeyer dipersiapkan.

4.

Menimbang

komponen-komponen

bahan

kimia

makro nutrien,

kemudian dimasukkan

ke

dalam

labu

erlenmeyer

tadi

satu

per

satu

sambil

digoyangkan secara memutar datar sehingga bahan

kimia

yang dituangkan sungguh-sungguh larut.

5.

Mengambil larutan stok besi,

mikro

nutrien,vitamin dan hormon yang dosisnya

1000 ppm, sehingga untuk

I

liter medium harus

diambil

10

ml

larutan stok. Labu erlenmeyer digoyangkan.

6.

Menimbang mio-inositol dan sukrosa, kemudian dimasukkan ke dalam labu satu

per satu sambil digoyang-goyangkan sampai larut.

7.

Aquades dituangkan sampai kurang lebih menjadi 900 ml(mendekati 1000 ml).

8.

pH-nya diukur dengan menggunakan kertas

pH,

dan

dilihat

angkanya pada skala

warna.

Bila

pH

masih dibawah

5,7

maka perlu ditambah

KOH

1-2 tetes, tetapi bila pH sampai mencapai 6,0 (melebihi 5,8) maka ditambah

HCI

1 tetes.

9.

Menuangkan aquades hingga volume mencapai 1000 ml.

10. Memasukkan agar-agar ke dalam labu.

11. Erlenmeyer dipanaskan

di

atas kompor gas sambil diaduk dengan pengaduk kaca

Vmpai mendidih dan agarnya larut semua.

12. Dituang ke dalam botol medium kurang lebih 5 -10

ml

perbotol, tergantung besar

kecilnya botol.

13. Botol medium ditutup dengan aluminium

foil,

dan diusahakan supaya benar-benar tertutup rcpat.

14. Memasukkan

botol-botol

medium tersebut

ke

dalam autoklaf

dan disterilisasi dengan suhu 1200C, dan tekanan

I,5

kglcm2 selama 15

_-20

menit.

*) _{Disampaikan pada Kegiatan Program Keluarga Harapan EKH) Desa Banteran Sumbang; pada Tanggal I Old 2015.}

**) _{Dosen Tetap Fakultas Biologi Unsoed}

15. Botol-botol yang mediumnya sudah steril diangkat, kemudian disimpan di tempat yang sejuk sampai siap untuk penanaman eksplan.

Daftar

Pustaka

Hendaryono, D.P.S. dan

Ari

Wijayani,l994

Teknik

Kultur

Jaringan. Pengenalan dan Petunjuk Perbanyakan Tanaman Secara

Vegetatif

_-

Modern, Penerbit Kanisius

_-

Jakarta.

*)DlsampaikanpadaKegiatanPro_grarnKeluargaHarapan@KrI)DesaBanteranSumbangpadaTanggal

1Ol11 2015.

**) _{Dosen Tetap Fakultas Biologi}

Unsoed