KUALITAS SPERMA SAPI BEKU DALAM MEDIA TRIS KUNING TELUR DENGAN KONSENTRASI RAFFINOSA YANG BERBEDA

KUALITAS SPERMA SAPI BEKU DALAM MEDIA TRIS KUNING TELUR DENGAN KONSENTRASI RAFFINOSA

YANG BERBEDA

(Quality of Cattle Sperm Cryopreserved in Tris Egg Yolk With Several Concentration of Raffinose)

MUHAMMAD GUNAWAN danE.M.KAIIN

Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI, Jl. Raya Bogor Km. 46, Cibinong 16911

ABSTRACT

The objective of this study was to improve the quality of Simmental bull sperm being cryopreserved in Tris Egg Yolk (TEY) with raffinose addition in several concentrations. Concentrations of raffinose used in this experiment were: 0.1% (R0,1), 0.2% (R0,2), 0.3% (R0,3) and 0.4% (R0,4), and TEY was used as control.

The result showed that after thawing, the percentage of motility in R0,4 (50%) was significantly (P < 0.05) higher than that of TEY (45%), R0,1 (45%), R0,2 (45%) and R0,3 (47%). However, percentages of live sperm after thawing were not significantly different between control TKT (51%) and experiment (R0,1 = 53.5%, R0,2 = 56.41%, R0,3 = 58.25% and R0,4 = 59.4%). The percentage of membrane integrity after thawing in TEY (46.49%) was significantly (P < 0.05) lower than that of R0,4 (54.71%). In conclusion, raffinose addition to Tris Egg Yolk diluter increased the quality of frozen Simmental sperm after thawing.

Key Words: Frozen Semen, Raffinose, Simmental Bull, Tris Egg Yolk, Cryopreserved

ABSTRAK

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kualitas sperma sapi Simmental yang dibekukan dengan penambahan beberapa konsentrasi raffinosa. Bahan pengencer yang digunakan adalah Tris Kuning Telur sebagai kontrol (TKT) serta kombinasi Tris Kuning Telur dengan Raffinosa 0,1% (R0,1), 0,2% (R0,2), 0,3%

(R0,3) dan 0,4% (R0,4). Hasil penelitian menunjukkan bahwa persentase motilitas sperma beku sapi Simmental setelah thawing dalam bahan pengencer R0,4 (50%), berbeda nyata (P < 0,05) lebih tinggi dibandingkan dengan TKT (45%), R0,1 (45%), R0,2 (45%) dan R0,3 (47%). Tidak terdapat perbedaan yang nyata (P < 0,05) pada persentase sperma hidup setelah thawing dalam bahan pengencer TKT (51%), R0,1 (53,50%), R0,2 (56,41%), R0,3 (58,25%) dan R0,4 (59,40%). Pada persentase membran plasma utuh (MPU) setelah thawing dalam bahan pengencer TKT (46,49%), berbeda nyata (P < 0,05) lebih rendah dibandingkan R0,4 (54,71%). Dapat disimpulkan bahwa penambahan raffinosa ke dalam bahan pengencer Tris Kuning Telur dapat meningkatkan kualitas sperma beku sapi Simmental setelah thawing.

Kata Kunci: Sperma Beku, Pengencer, Raffinosa, Pembekuan, Pejantan Simmental

PENDAHULUAN

Inseminasi buatan (IB) dan transfer embrio (TE) adalah dua contoh kemajuan bioteknologi dalam bidang reproduksi peternakan yang sangat bermanfaat dalam meningkatkan kualitas maupun kuantitas ternak. Teknologi IB berperan penting dalam meningkatkan mutu genetik ternak dan IB memiliki dua peran dalam persilangan sapi di Indonesia. Pertama, IB secara efektif dapat menyebarkan material genetik yang berkualitas dari induk jantan,

kepada populasi sapi betina. Kedua, IB mencegah penyebaran penyakit seksual (RODRIGUEZ-MARTINEZ, 2000). Tantangan dalam keberhasilan Inseminasi Buatan (IB) di lapangan adalah rendahnya kualitas dan penanganan sperma beku yang digunakan, kondisi reproduksi, manajemen ternak dan ketrampilan inseminator (HERDIS 1998).

Kualitas semen beku yang baik untuk IB adalah yang sesuai dengan standar SNI 01- 4869-1-1998, yaitu motilitas sperma setelah thawing sebesar ≥ 40%. Produksi sperma sapi

beku sudah banyak dilakukan oleh Balai Inseminasi Buatan (BIB) pusat maupun BIB daerah. Untuk mendapatkan straw sperma sapi beku dalam jumlah banyak, maka semen yang dikoleksi kemudian ditambahkan dengan media pengencer yang berfungsi untuk memperbanyak volume, melindungi spermatozoa terhadap cold shock, sumber nutrisi, mencegah pertumbuhan kuman serta mempertahankan tekanan osmotik dan keseimbangan elektrolit (PARTODIHARJO, 1992).

Salah satu media pengencer yang umum digunakan adalah Tris karena memiliki toksisitas rendah dan sistem penyanggah yang baik dengan mempertahankan pH, tekanan osmotik dan keseimbangan elektrolit (AFFANDY

et al., 1999). Namun penggunaan pengencer tris perlu ditambahkan juga kuning telur, karena di dalam kuning telur terdapat lipoprotein dan lesitin yang dapat mengurangi efek cold shock bagi spermatozoa, sehingga kerusakan pada saat pengenceran, pendinginan dan pembekuan berkurang. Sedangkan penambahan gliserol pada proses pembuatan semen beku berfungsi untuk menggantikan air bebas di dalam sel dan mengeluarkan elektrolit intraseluler sampai titik konsentrasi yang tidak merusak sel selama pembekuan (SALISBURY

dan VAN DEMARK, 1985).

Upaya untuk meningkatkan kualitas sperma sapi selama proses pembekuan adalah dengan penambahan gula (karbohidrat) ke dalam larutan pengencer. Fungsi gula dalam larutan pengencer adalah sebagai sumber energi bagi spermatozoa selama inkubasi, mempertahankan tekanan osmosis larutan pengencer dan sebagai krioprotektan pada proses pembuatan semen beku (YILDIZ et al., 2000). Beberapa penelitian tentang penambahan gula dalam pengencer sperma dengan tujuan memperbaiki kualitas semen beku telah banyak dilaporkan, seperti sukrosa pada semen beku sapi (WOELDERS et al., 1997), raffinosa pada semen beku kambing (SUWARSO, 1999), dextrose, raffinosa, trehalosa, dan sukrosa pada semen domba Garut (RIZAL et al., 2006), serta raffinosa pada semen kuda (ARIFIANTINI,2006).

Dalam penelitian ini dipelajari dampak penambahan raffinosa ke dalam pengencer Tris Kuning Telur (TKT) terhadap kualitas sperma beku sapi simmental. Perbaikan dan peningkatan kualitas sperma setelah thawing

diharapkan dapat meningkatkan keberhasilan tingkat kebuntingan pada pelaksanaan inseminasi buatan (IB).

MATERI DAN METODE

Tempat Penelitian. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Mei sampai Juli 2008 di Laboratorium Reproduksi dan Genetika Ternak, Bidang Biologi Sel dan Jaringan, Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI, Cibinong.

Penyiapan semen sapi

Semen sapi simmental ditampung dengan menggunakan vagina buatan, kemudian dievaluasi secara makroskopis (volume, bau, warna, kekentalan dan pH) dan mikroskopis (gerakan masa, konsentrasi, motilitas, persentase sel hidup, persentase abnormalitas dan membran plasma utuh).

Pembekuan sperma dengan berbagai pengencer

Setelah dievaluasi kualitas makroskopis dan mikroskopis, sperma hasil koleksi diencerkan dengan berbagai pengencer sesuai perlakuan. Komposisi pengencer Tris Kuning Telur (TKT) yang digunakan adalah: Tris (hydroxymethyl) aminomethan (3,09 g), Asam Sitrat (1,73 g), Fruktosa (1,27 g), aquabidest (100 ml), ditambah kuning telur 20% (v/v), gliserol 7% (v/v) dan Pen-strep 1% (v/v).

Sperma pada gelas ukur pertama diencerkan dengan pengencer Tris Kuning Telur sebagai kontrol (TKT). Sperma pada gelas ukur kedua diencerkan dengan pengencer Tris Kuning Telur + 0,1% raffinosa (R0,1). Sperma pada gelas ukur ketiga diencerkan dengan pengencer Tris Kuning Telur + 0,2% raffinosa (R0,2).

Sperma pada gelas ukur keempat diencerkan dengan pengencer Tris Kuning Telur + 0,3%

raffinosa (R0,3). Sperma pada gelas ukur kelima diencerkan dengan pengencer Tris Kuning Telur + 0,4% raffinosa (R0,4).

Sperma yang telah diencerkan dikemas dalam mini straw (0,25ml) dengan konsentrasi 25 juta sperma per straw, kemudian diekuilibrasi dalam lemari pendingin dengan temperatur 5⁰C selama 4 jam. Pembekuan

dilakukan dengan meletakkan straw di permukaan uap nitrogen cair, menggunakan rak pembekuan apung dengan ketinggian 6 cm selama 10 menit didalam styrofoam yang tertutup rapat. Selanjutnya straw dimasukkan dalam nitrogen cair dan disimpan dalam kontainer. Setelah disimpan, masing-masing sampel sperma beku dicairkan kembali (thawing) untuk evaluasi selanjutnya. Thawing dilakukan dengan cara memasukkan straw kedalam air bersuhu 37⁰C selama 30 detik.

Parameter Penelitian. Parameter yang diamati dalam penelitian ini adalah kualitas sperma sapi simmental, seperti: tingkat motilitas (%), jumlah sperma hidup (%), dan jumlah sperma dengan Membran Plasma Utuh atau MPU (%) pada tahap pengenceran, ekuilibrasi, thawing dan 4 jam pasca thawing.

Persentase sperma yang motil ditentukan dengan menghitung jumlah persentase sperma yang bergerak secara progresif ke depan (TOELIHERE, 1993), menggunakan mikroskop perbesaran 400 kali.

Persentase sperma hidup ditentukan dengan menghitung persentase sperma yang hidup setelah pewarnaan dengan eosin-negrosin (TOELIHERE, 1993), dan dibuat preparat ulas.

Sperma yang hidup ditandai oleh kepala berwarna putih bening, sedangkan yang mati ditandai dengan kepala berwarna biru.

Persentase MPU sperma ditentukan dengan menghitung persentase sperma yang memiliki membran plasma yang utuh, dengan cara memasukkan sampel semen ke dalam larutan hipo-osmotik 0,032 M NaCl (0,179 g NaCl dalam 100 ml akuabides), kemudian diinkubasi selama satu jam pada suhu 37⁰C. Spermatozoa dengan membran plasma utuh ditandai dengan ekor melingkar dan sperma yang rusak ditandai dengan ekor lurus karena tidak adanya reaksi osmotik (HAFEZ, 2000).

Evaluasi pada persentase sperma hidup dan MPU dilakukan dengan menghitung jumlah spermatozoa minimal sebanyak 100, menggunakan mikroskop perbesaran 400 kali.

Analisis data

Data yang diperoleh dianalisis dengan Analysis of Variance (ANOVA) dalam bentuk rancangan acak lengkap dengan lima perlakuan dan lima kali ulangan. Analisis data

menggunakan program software SPSS (SANTOSO, 2008).

HASIL DAN PEMBAHASAN Kualitas semen hasil penampungan

Secara umum semen yang digunakan dalam penelitian ini memiliki kualitas yang baik (Tabel 1), sehingga dapat diolah lebih lanjut menjadi semen beku.

Tabel 1. Rata-rata kualitas semen segar sapi simmental

Parameter Rata-rata ± SD Volume (ml) 8,8 ± 1,64

Warna Krem Konsistensi Kental

Bau sperma Khas

pH lakmus 7 ± 0,00

Gerakan Massa ++ s/d +++

Motilitas (%) 85 ± 3,54 Konsentrasi (juta) 1321 ± 27,48 Sperma hidup (%) 91,19 ± 3,64

MPU (%) 75,95 ± 3,21

Sperma abnormal (%) 9,13 ± 0,84 ++ = baik, +++ = sangat baik

Kualitas semen segar dalam penelitian ini tidak jauh berbeda dengan penelitian sebelumnya yang menyatakan karakteristik sapi yang baik menghasilkan volume semen 5- 8 ml, motilitas 65%, konsentrasi 300 – 2500 juta/ml dan abnormalitas 15% pada semen segar (TOELIHERE, 1993). AFFANDHY (2003) melaporkan sapi persilangan simmental menghasilkan volume 5,8 ml dengan persentase motilitas 80,7%, persentase sperma hidup sebesar 79,8% serta persentase abnormalitas 6,8%. Sedangkan RASYID (2003) menyatakan semen sapi persilangan simmental menghasilkan volume 2,3 ml dengan persentase motilitas sperma sebesar 78%, persentase sperma hidup sebesar 91,5% serta persentase abnormalitas 4,5%. Secara umum tingkat perbedaan kualitas semen segar dapat dipengaruhi oleh bangsa sapi, umur, ukuran badan, tingkatan makanan, frekuensi penampungan, dan berbagai faktor lain.

Kualitas sperma setelah thawing

Hasil penelitian memperlihatkan bahwa penambahan raffinosa ke dalam pengencer Tris kuning telur memberikan pengaruh yang baik terhadap persentase sperma motil, persentase sperma hidup dan persentase MPU sperma sapi Simmental setelah thawing (Tabel 2).

Penambahan raffinosa di semua perlakuan pada saat pengenceran tidak berpengaruh secara nyata terhadap motilitas, jumlah sperma hidup dan persentase MPU dibandingkan dengan kontrol. Hal ini kemungkinan karena proses yang cepat pada saat pencampuran sperma dengan pengencer TKT, pada semua perlakuan, menyebabkan proses metabolisme sperma berjalan secara bersamaan. Pengamatan pada saat ekuilibrasi 4 jam dalam suhu 5⁰C menunjukkan perbedaan nyata pada motilitas sperma R0.4 yang lebih tinggi dari kontrol. Ini kemungkinan disebabkan pengencer tris dengan penambahan raffinosa dapat menyediakan energi yang cukup dan krioprotektan ekstraseluler terhadap sperma pada kondisi suhu dingin. Tidak adanya perbedaan kualitas sperma antara perlakuan

dengan kontrol, disebabkan pada suhu dingin selama ekuilibrasi metabolisme sperma menurun. Hal ini didukung hasil penelitian yang menyatakan bahwa penyimpanan pada suhu 5°C menyebabkan metabolisme sperma menurun sehingga viabilitasnya dapat dipertahankan (MCKINNON 1999).

Kualitas sperma setelah thawing memperlihatkan hasil persentase motilitas dan persentase MPU berbeda nyata pada perlakuan R0.4 lebih tinggi dari kontrol. Hal ini menunjukkan bahwa raffinosa berfungsi sebagai sumber energi dan sekaligus sebagai krioprotektan ekstraseluler, sehingga memberikan pengaruh yang baik terhadap kualitas sperma. Sebagai sumber energi, raffinosa akan dimetabolisir melalui jalur glikolisis atau dilanjutkan dengan reaksi asam trikarboksilat (siklus Krebs), sehingga menghasilkan energi berupa ATP yang akan dimanfaatkan oleh sperma dalam pergerakan (motilitas). Sementara sebagai krioprotektan ekstraseluler, raffinosa akan melindungi membran plasma sel sperma dari kerusakan secara mekanik yang mungkin terjadi pada saat kriopreservasi semen.

Tabel 2. Rata-rata persentase spermatozoa motil, spermatozoa hidup, dan MPU spermatozoa sapi simmental beku dengan pengencer Tris Kuning telur yang ditambah raffinosa

Tahap pengamatan Parameter Perlakuan Setelah

pengenceran

Ekuilibrasi

(4 jam) Setelah thawing

Setelah thawing (4

jam) Kontrol 79 ± 2,24^a 70 ± 0,00^a 45 ± 0,00^a 36 ± 5,48^a Spermatozoa

motil (%) R0.1 80 ± 0,00^a 71 ± 2,24^a 45 ± 0,00^a 38 ± 4,47^ab R0.2 80 ± 0,00^a 73 ± 2,74^ab 45 ± 0,00^a 40 ± 0,00^ab R0.3 82 ± 2,74^a 73 ± 2,74^ab 47 ± 2,74^a 41 ± 2,24^ab R0.4 82 ± 2,74^a 75 ± 0,00^b 50 ± 0,00^b 43 ± 2,74^b Kontrol 82,21 ± 6,58^a 71,29 ± 1,63^a 51,00 ± 2,24^a 44,60 ± 3,65^a Spermatozoa

hidup (%) R0.1 85,31 ± 4,90^a 70,53 ± 1,58^a 53,50 ± 2,77^a 46,60 ± 4,51^a R0.2 85,88 ± 4,66^a 71,95 ± 6,38^a 56,41 ± 6,56^a 50,60 ± 3,78^ab R0.3 86,79 ± 5,61^a 72,05 ± 4,73^a 58,25 ± 3,71^a 55,06 ± 4,06^b R0.4 86,03 ± 7,46^a 76,73 ± 3,86^a 59,40 ± 6,80^a 58,23 ± 2,98^b Kontrol 78,05 ± 3,37^a 64,18 ± 2,76^a 46,49 ± 3,33^a 41,20 ± 2,17^a MPU (%)

R0.1 81,84 ± 1,91^a 64,68 ± 7,26^a 48,00 ± 2,74^ab 42,80 ± 4,38^ab R0.2 82,24 ± 0,55^a 64,38 ± 8,96^a 50,26 ± 3,92^ab 45,60 ± 4,39^ab R0.3 80,07 ± 1,98^a 66,07 ± 3,99^a 52,00 ± 4,16^ab 49,40 ± 7,20^ab R0.4 80,93 ± 5,46^a 66,89 ± 5,79^a 54,71 ± 5,39^b 52,59 ± 6,78^b

a,b Superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (P < 0,05)

Perbaikan membran plasma sel akan memberikan dampak positif terhadap motilitas dan daya hidup sperma. Hal ini karena motilitas sperma sangat bergantung pada suplai energi berupa adenosine trifosfat (ATP) hasil metabolisme. Metabolisme dapat berlangsung dengan baik jika membran plasma sel berada dalam keadaan yang utuh, sehingga mampu mengatur lalulintas masuk dan keluar dari sel semua subtrat dan elektrolit yang dibutuhkan dalam proses metabolisme. Pada membran plasma sel terdapat banyak makromolekul seperti protein, lipoprotein, glikoprotein, dan lain-lain yang dapat berfungsi sebagai enzim, reseptor, saluran, atau pembawa (carrier) (SUBOWO, 1995). Makromolekul- makromolekul ini memfasilitasi lalu lintas seluruh substrat dan elektrolit tersebut dari atau dan ke dalam sel. Substrat dan elektrolit perlu difasilitasi karena tidak dapat menembus secara difusi bebas membran plasma sel sperma yang bersifat semipermiabel.

Gula diketahui dapat menjadikan membran plasma sel lebih stabil selama proses kriopreservasi (BAKAS dan DISALVO, 1991).

Gula juga memegang peranan penting dalam menurunkan kandungan garam larutan pengencer. Hal ini menyebabkan gula dapat mencegah kerusakan akibat meningkatnya kadar garam selama proses pembekuan (NICOLLAJSEN dan HVIDT, 1994).

Sedangkan menurut SUWARSO (1999), penambahan raffinosa dalam media pengencer tris kuning telur harus mempertimbangkan formulasi pengencer secara keseluruhan, ini berkaitan dengan tekanan osmose yang dibutuhkan spermatozoa. Penambahan raffinosa yang berlebihan dapat meningkatkan kepekatan dan tekanan osmose pengencer menjadi hipertonis dan menyebabkan dehidrasi sel spermatozoa pada saat proses pembekuan.

Pada penelitian ini dilakukan penambahan waktu selama 4 jam pada suhu 37°C setelah thawing. Perlakuan ini dilakukan untuk mengetahui kualitas sperma yang terpapar setelah thawing. Hal ini banyak terjadi di lapang terutama didaerah yang terpencil, dengan keterbatasan dan mahalnya nitrogen cair serta jauhnya jarak antara pos IB dengan peternak. Demikian pula menurut TOELIHERE

(1993), dengan berbagai kendala di lapangan petugas inseminator melakukan thawing di pos

IB, kemudian dibawa ke peternak sehingga terjadi perpanjangan waktu setelah thawing yang berakibat menurunnya kualitas spermatozoa. Dari hasil penelitian ini terlihat bahwa penambahan raffinosa mampu mempertahankan kualitas sperma setelah perpanjangan waktu 4 jam dengan motilitas 40% pada perlakuan R0,2, R0,3 dan R0,4.

Penurunan kualitas sperma kemungkinan karena pengaruh negatif gliserol yang mempunyai osmolaritas tinggi, sehingga bersifat toksik terhadap sperma. Setelah pembekuan, pada sperma terjadi peroksida lipid yang diawali dengan terbentuknya reactive oxygen species (ROS) yang tinggi pada temperatur ruang sehingga menyebabkan kualitas sperma menurun (GADELLA et al.

2002). Spermatozoa beku hasil thawing bersifat rapuh dan tidak dapat bertahan hidup lama. Oleh karena itu, untuk menjamin fertilitas yang tinggi maka harus dipastikan bahwa spermatozoa yang sudah dicairkan kembali sesegera mungkin digunakan untuk IB (TOELIHERE, 1993). Hal tersebut dapat dijadikan indikator bahwa raffinosa, sebagai salah satu jenis gula, efektif dalam melindungi sperma dari kerusakan selama proses pendinginan, pembekuan dan thawing sehingga dapat meningkatkan kualitas sperma sapi Simmental.

KESIMPULAN

Penambahan raffinosa dengan konsentrasi 0,4% pada pengencer tris kuning telur mampu mempertahankan kualitas sperma sapi Simmental selama pendinginan dan pembekuan. Peningkatan kualitas sperma beku setelah thawing dan penambahan waktu penyimpanan setelah thawing selama 4 jam, menunjukkan kualitas yang layak IB dengan nilai motilitas lebih dari 43%.

UCAPAN TERIMAKASIH

Ucapan terimakasih disampaikan kepada Dr. Baharuddin Tappa atas bimbingan dan dukungannya untuk menggunakan fasilitas yang ada di Laboratorium Biologi Sel dan Jaringan Hewan Puslit Bioteknologi LIPI selama pelaksanaan penelitian ini.

DAFTAR PUSTAKA

AFFANDHY,L.,U.UMIYASIH dan K.MA`SUM. 1999.

Evaluasi kualitas semen beku sapi Madura dengan berbagai diluter dan kandungan kuning telur yang berbeda. Pros. Seminar Nasional Peternakan dan Veteriner. Bogor, 1 – 2 Desember 1998. Puslitbang Peternakan, Bogor. hlm. 233 – 239.

AFFANDHY, L. 2003. Pengaruh penambahan cholesterol dan kuning telur di dalam bahan pengencer tris-sitrat dan air kelapa muda terhadap kualitas semen cair sapi potong. Pros.

Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner. Bogor, 29 – 30 September 2003.

Puslitbang Peternakan, Bogor. hlm.77 – 84.

ARIFIANTINI, I. 2006. Perservasi semen dengan modifikasi pengencer dan krioprotektan untuk inseminasi buatan pada kuda. Disertasi.

Program Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor.

BAKAS, L.S. and E.A. DISALVO.1991. Effects of Ca²⁺ on the cryoprotective action of trehalose.

Cryobiology 28: 347 – 353.

GADELLA,B.M.,R.RATHI,M.M.BEVERS,J.F.H.M.

BROUWERS,D.NEILD and B.COLENBRANDER. 2002. The Role of Lipid Dynamics in Equine Sperm Plasma Membrane Function. Dalam:

Perservasi semen dengan modifikasi pengencer dan krioprotektan untuk inseminasi buatan pada kuda. ARIFIANTINI, I. 2006. Disertasi.

Program Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor.

HAFEZ. 2000. Preservation and Cryopreservation of Gametes and Embryos. In: Reproduction in Farm Animals. Ed. Ke-7. HAFEZ, B. and E.S.E. HAFEZ (Eds.). Baltimore: Lippincott Williams & Wilkins.

HERDIS. 1998. Metode Pemberian Gliserol dan Lama Ekuilibrasi pada Proses Pembekuan Semen Kerbau Lumpur. Tesis. Program Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.

MCKINNON, A.O. 1999. Breeding and Its Technology – Now And The Future. Dalam:

ARIFIANTINI,I. 2006. Perservasi semen dengan modifikasi pengencer dan krioprotektan untuk inseminasi buatan pada kuda. Disertasi.

Program Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.

NICOLLAJSEN, H. AND A. HVIDT. 1994. Phase behaviour of the system trehalose-NaCl-water.

Cryobiology 31: 199 – 205.

PARTODIHARJO, 1992. Ilmu Reproduksi Hewan.

Cetakan Ketiga. Mutiara Widya, Jakarta.

RASYID,A.,L,AFFANDHY dan D.B.WIJONO. 2003.

Profil hormon testosteron dan kualitas semen sapi pejantan Peranakan Ongole dan silangan Simmental. Pros. Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner. Bogor, 29 – 30 September 2003. Puslitbang Peternakan, Bogor. hlm. 85 – 90.

RIZAL, M., HERDIS, A. BOEDIONO, A.S. AKU dan YULNAWATI. 2006. Peranan beberapa jenis gula dalam meningkatkan kualitas semen beku domba Garut. JITV 11: 123 – 130.

RODRIGUEZ-MARTINEZ, H. 2000. Evaluation of Frozen Semen: Traditional and New Approaches. www.Ivis.org. (14 juni 2004).

SALISBURY, G.W. dan H.L.VAN DENMARK. 1985.

Fisiologi Reproduksi dan Inseminasi Buatan pada Sapi. Penterjemah: DJANUAR,R. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta. 274 – 302; 314 – 343; 350 – 380; 568 – 586.

SANTOSO, S. 2008. Panduan Lengkap Menguasai SPSS 16. PT Elex Media Komputindo, Gramedia.

SUBOWO.1995. Biologi Sel. Angkasa, Bandung.

SUWARSO. 1999. Peranan Raffinosa dalam Pengencer Tris-Sitrat Kuning Telur terhadap Semen Beku Kambing Peranakan Etawa.

Tesis. Program Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor.

TOELIHERE. 1993. Inseminasi Buatan pada Ternak.

Angkasa, Bandung.

WOELDERS H., A. MATTHIJ and B. ENGEL. 1997.

Effects of trehalose and sucrose, osmolality of the freezing medium, and cooling rate on viability and intactness of bull sperm after freezing and thawing. Cryobiology 35: 93 – 105.

YILDIZ,C.,A.KAYA andT.TEKELI. 2000. Influence of sugar supplementation of the extender on motility, viability and acrosomal integrity of dog spermatozoa during freezing.

Theriogenology 54: 579 – 585.