24 II. TINJAUAN PUSTAKA
S. RENDANG
Rendang adalah masakan yang berasal dari suku Minangkabau tetapi saat ini umum disajikan di seluruh Indonesia. Rendang merupakan salah satu makanan khas dari kebudayaan Minangkabau yang disajikan pada saat-saat penting seperti upacara atau untuk menghormati tamu. Rendang dibuat dari daging sapi (atau dapat juga dari daging ayam, kerbau dan bebek, atau nangka dan ubi kayu) yang dimasak dengan santan dan rempah-rempah selama beberapa jam sampai airnya habis dan daging menyerap bumbu rempah-rempah. Proses memasak berubah dari merebus menjadi menggoreng saat airnya menguap. Rempah-rempah yang digunakan yaitu jahe, kunyit, lengkuas, daun jeruk, dan cabai. Rendang ayam atau bebek juga biasa ditambahkan dengan asam jawa dan waktu pemasakannya tidak selama rendang daging sapi (Anonim, 2009b).
Ada dua jenis rendang yaitu rendang kering dan basah. Rendang kering dapat disimpan selama 3-4 bulan dan biasanya dimasak dalam acara-acara penting untuk menjamu tamu. Rendang basah, atau biasa disebut kalio, dapat ditemui di rumah makan Minangkabau tanpa dibekukan, dan masih dapat dikonsumsi dalam jangka waktu sebulan (Lipoeto et al., 2001). Rendang sering disajikan dengan nasi di Indonesia, tapi di Malaysia, pangan ini juga disajikan dengan ketupat dan lemang.
Rendang, empal dan semur yang dimasak secara tradisional diolah dengan cara mencampurkan daging potong dengan bumbu atau campuran rempah-rempah, kemudian dimasak sampai matang dengan santan untuk rendang atau dengan minyak kelapa sawit untuk empal. Bumbu yang biasanya dipakai dalam memasak rendang adalah cabai, bawang putih, bawang merah, dan rempah-rempah lainnya. Karena masing-masing produk memiliki kadar air yang tinggi, yaitu 60-70%, produk-produk tersebut cenderung untuk cepat rusak pada suhu ruang (Irawati et al., 2000).
25 T. TEKNIK IRADIASI PANGAN
Menemukan cara untuk menghambat perusakan pangan dan mengendalikan serangan mikroorganisme telah menjadi fokus manusia selama berabad-abad. Cara-cara pengendalian seperti pembekuan atau pasteurisasi telah menjadi teknik yang biasa digunakan, dan diharapkan suatu saat teknik iradiasi pangan dapat dikembangkan dan diimplementasikan di masyarakat.
Beberapa bakteri patogen merupakan penyebab penyakit yang ditimbulkan oleh bahan pangan (foodborne illness) dan menyebabkan 1800 kematian dan 60.000 orang sakit setiap tahunnya di Amerika Serikat (Mead et al., 1999). Sumber kontaminasi bakteri patogen asal pangan berasal dari produk yang tidak diolah dan disimpan dengan baik. Iradiasi pangan mendapatkan perhatian karena meningkatnya insiden penyakit asal pangan dalam beberapa dekade terakhir, sebab proses iradiasi secara efisien dapat mengurangi populasi patogen seperti Salmonella, Listeria, Campylobacter, E. coli O157:H7, dan lainnya, seperti virus, parasit dan serangga. Proses ini telah disetujui oleh World Health Organization (WHO), Food and Agriculture Organization (FAO), Codex Alimentarius Commission, US Food and Drug Administration (FDA), US Department of Agriculture (USDA), American Medical Association, American Dietetic Association, American Institute of Food Technologists, dan otoritas kesehatan di 50 negara (Diehl, 1995). Daftar produk yang diijinkan untuk diiradiasi berbeda-beda di tiap negara, tetapi seringnya terbatas hanya pada rempah-rempah, herba, bumbu, beberapa buah segar dan kering, sayuran, makanan laut, daging sapi giling, dan daging unggas (Marchioni, 2008).
Jenis sumber radiasi yang digunakan terbatas pada radiasi yang berasal dari sumber radionuklida yang menghasilkan sinar gamma berenergi tinggi, sinar X dan elektron yang diakselerasi. Sumber-sumber radiasi ini juga dikenal dengan radiasi pengion karena energi yang dikeluarkan cukup tinggi untuk mendislokasi elektron dari atom dan molekul dan mengubahnya
26 menjadi partikel bermuatan listrik yang disebut ion. Sinar gamma dan sinar X, seperti gelombang radio, gelombang mikro, ultraviolet dan spektrum sinar tampak, merupakan bagian dari spektrum elektromagnetik dan ada dalam daerah gelombang pendek, berenergi tinggi yang memiliki kekuatan berpenetrasi yang paling besar. Letak sinar gamma dan sinar X pada spektrum elektromagnetik diperlihatkan di gambar 1.
Gambar 1. Spektrum elektromagnetik
Sinar gamma dan sinar X memiliki sifat yang sama dan efek yang sama pada bahan, perbedaan utamanya hanya pada sumber. Sinar X dengan energi yang bervariasi dihasilkan dari mesin. Sinar gamma dengan energi yang spesifik dihasilkan dari disintegrasi spontan dari radionuklida. Radionuklida yang ada secara alami dan buatan manusia, yang dikenal dengan nama isotop radiaoktif atau radioisotop, menghasilkan radiasi saat bahan-bahan ini secara spontan kembali ke keadaan stabil. Waktu yang dibutuhkan oleh sebuah radionuklida untuk mencapai setengah level radioaktivitas yang ada di awal disebut waktu paruh, dan spesifik untuk tiap radionuklida dari elemen tertentu. Becquerel (Bq) merupakan unit radioaktivitas dan setara dengan satu disintegrasi per detik (ICGFI, 1999).
Radiasi pengion merupakan energi yang ditransmisikan melalui udara dalam bentuk gelombang elektromagnetik atau sinar berkas elektron. Iradiasi
27 pangan melibatkan penggunaan sinar gamma yang dihasilkan oleh radionuklida, baik itu kobalt-60 [1.17 dan 1.33 MeV (1 MeV = 1.6 × 10−13 J)] atau sesium-137 (0.66 MeV), sinar berkas elektron yang dihasilkan dari sumber mesin listrik yang dioperasikan pada atau di bawah tingkat energi 10 MeV atau sinar X yang dihasilkan dari tumbukan berkas elektron (tingkat energi 5 MeV atau di bawahnya) pada sebuah target logam yang memiliki densitas elektronik yang tinggi (WHO, 1999) Dosis iradiasi diukur dengan unit gray (Gy) atau kilogray (kGy). Satu gray setara dengan penyerapan 1 J energi dalam 1 kg bahan pangan.
Sementara itu, menurut ICGFI (1999), hanya sumber radiasi tertentu yang dapat digunakan dalam iradiasi pangan. Sumber-sumber tersebut diantaranya adalah radionuklida kobalt-60 (Co-60) atau sesium-137 (Cs-137); mesin sinar X yang memiliki energi maksimum 5 juta elektron volt (MeV) (satu elektron volt adalah jumlah energi yang diperoleh oleh sebuah elektron ketika diakselerasi dengan daya sebesar satu volt dalam keadaan vakum); atau akselerator elektron yang memiliki energi maksimum 10 MeV. Energi dari sumber-sumber radiasi ini terlalu rendah untuk dapat menginduksi radioaktivitas pada bahan apapun, termasuk pangan.
Radioisotop yang dipakai dalam penyinaran rendang iradiasi adalah kobalt-60. Radioisotop ini memiliki aktivitas spesifik 1,1 x 103 Ci/g dan waktu paruh 5,23 tahun. Seperti radioisotop sesium-137, radioisotop ini memancarkan sinar beta dan gamma.
Ada tiga aplikasi dan kategori dosis yang biasa digunakan: 1) iradiasi dosis rendah (sampai 1 kGy), dengan tujuan untuk menunda kematangan, menghambat pertunasan, disinfetasi serangga, dan inaktivasi parasit; 2) iradiasi dosis sedang (1-10 kGy) dengan tujuan untuk mengurangi jumlah mikroba pencemar, mengurangi atau mengeliminasi patogen yang tidak membentuk spora, misalnya mikroorganisme penyebab penyakit; 3) iradiasi dosis tinggi (di atas 10 kGy) yang bertujuan untuk mengurangi jumlah mikroorganisme sampai mencapai keadaan steril (ICGFI, 1999). Dosis di atas 10 kGy dibutuhkan untuk sterilisasi pangan yang siap makan (ready-to-eat food) yang mensyaratkan tidak adanya mikroba dan/atau harus
28 mempertahankan penyimpanan jangka lama tanpa refrigerasi (WHO, 1999), misalnya pangan untuk rumah sakit, pangan untuk pasien dengan kekebalan tubuh rendah, astronot, tentara, pendaki gunung, atau orang-orang yang memiliki hobi berkemah (Marchioni, 2008).
Proses pendinginan merupakan proses yang dianggap mahal khususnya di bagian tropis dan subtropis dunia. Perlakuan kimia relatif lebih murah dan efektif, tetapi perlakuan ini meninggalkan residu, dan banyak negara telah melarang penggunaannya karena alasan-alasan kesehatan. Oleh karena itu, iradiasi dapat menjadi alternatif teknologi yang lebih baik (Miller, 2005).
Banyak pangan, khususnya buah-buahan dan sayuran segar, cukup mendapatkan perlakuan dosis rendah tanpa mengalami penurunan kualitas. Bagaimanapun, beberapa pangan, seperti daging ternak, unggas, dan beberapa jenis hasil laut perlu mendapatkan dosis sedang (radurisasi) sampai tinggi (radapertisasi), jika ada persyaratan tertentu dalam kualitas. Sterilitas komersial, yang didefinisikan sebagai tidak terdapatnya bakteri, khamir, dan kapang hidup, dapat dicapai dengan dosis antara 25-45 kGy. Enzim autolisis yang ada pada semua pangan mentah memiliki sifat resisten terhadap dosis radiasi ini dan harus diinaktivasi dengan perlakuan panas sedang (misalnya blansir pada suhu 70°C) jika ingin dicapai stabilitas masa simpan dalam jangka panjang tanpa refrigerasi. Untuk mencegah off-flavor, oksigen harus dikeluarkan dengan cara pengemasan vakum dalam kaleng logam atau kantong fleksibel yang dilaminasi (laminated flexible pouch). Kemudian, proses iradiasi akan dilakukan pada suhu -20° - (-40°) C (Diehl, 1990).
Beberapa negara telah sukses menghasilkan pangan iradiasi dosis tinggi. Salah satunya adalah Ceko. Pangan iradiasi dengan dosis tinggi yang telah diproduksi adalah kari ayam, daging babi beku, ayam goreng dan ayam panggang dikemas vakum dengan dosis 35-65 kGy. Pangan tersebut diiradiasi dengan menggunakan elektron yang diakselerasi (Placek et al., 2004) Sebelumnya, pada awal penggunaannya, iradiasi pengion telah digunakan untuk menghasilkan pangan bagi astronot NASA dengan dosis iradiasi tinggi mulai tahun 1995.
29 U. RENDANG IRADIASI
Beberapa produsen pada skala rumah tangga maupun industri telah menunjukkan minat mengenai kemungkinan penggunaan iradiasi untuk memperpanjang umur simpan produk pangan seperti rendang. Sebuah studi yang dilakukan di sebuah pusat penelitian mengindikasikan bahwa rendang ikan mas yang diiradiasi pada 7,5 kGy dapat disimpan lebih dari 15 hari pada suhu ruang (Suswati, 1987). Iradiasi pada dosis yang lebih tinggi memiliki efek nyata pada sifat sensori produk rendang tersebut, karena rendang tersebut tidak dikemas vakum dan diiradiasi pada suhu ruang. Kombinasi perlakuan antara iradiasi dosis sterilisasi dengan kemasan vakum pada suhu rendah untuk menghasilkan pangan yang memiliki umur simpan stabil telah sukses dikembangkan oleh beberapa peneliti (IAEA, 1995).
Prosedur dasar untuk mempersiapkan pangan radapertisasi (iradiasi sterilisasi) adalah sebagai berikut (IAEA, 1995):
1. Proses termal: Untuk masa penyimpanan yang diperpanjang, enzim proteolitik harus diinaktivasi, yang dilakukan dengan cara memanaskan makanan sampai suhu internalnya di atas 75°C selama sedikitnya 10 menit.
2. Pengemasan vakum: Keadaan vakum dibutuhkan karena oksigen dapat menyebabkan kerusakan karena radiasi.
3. Pembekuan: Produk harus dibekukan sedikitnya mencapai suhu -30°C.
4. Iradiasi: Pangan yang dikemas diiradiasi pada keadaan beku sampai mencapai dosis minimum 25-45 kGy (tergantung pada produknya).
Rendang iradiasi yang menjadi sampel dalam penelitian ini diproduksi oleh Pusat Aplikasi Teknologi Isotop dan Radiasi Badan Tenaga Nuklir Nasional (PATIR BATAN). Daging yang dibuat menjadi rendang dibeli dari pasar lokal. Jumlah daging yang digunakan untuk membuat rendang adalah 20 bagian/kg. Bahan pengemas yang digunakan untuk mengemas rendang adalah aluminium foil berlaminasi PET 12µ/LDPE, dengan adhesive
2µ/Al-30 foil, 7µ/LDPE, dan 50µ /LLDPE sebagai pengemas bagian luar. Ukuran masing-masing kantong pengemas adalah 21 × 17 cm2.
Bumbu yang dipakai dalam pembuatan rendang yang diiradiasi dapat dilihat pada tabel 1.
Tabel 1. Bumbu yang dipakai dalam pembuatan rendang yang diiradiasi
Bumbu Jumlah
(g/kg daging)
Cabe merah 100
Bawang merah 100
Bawang putih 16
Daun sereh 3 helai
Daun kunyit 1 helai
Daun jeruk 6 helai
Asam kandis 1 buah
Garam 10
Lengkuas 35
Jahe 75
Santan kelapa 1,5 liter
Rendang dibuat dengan cara memotong-motong daging sapi menjadi berbentuk kubus-kubus kecil (20 kubus/kg), dicuci menggunakan air keran, kemudian dicampur dengan bumbu-bumbu seperti yang dicantumkan pada tabel 1 dan direndam selama 2 jam. Setelah direndam dengan bumbu, daging tersebut ditempatkan dalam wajan dan dimasak selama 20 menit sampai airnya habis. Santan dan asam kandis ditambahkan ke dalam campuran tersebut kemudian direbus kembali selama 20 menit. Setelah dimasak, daging diambil dan campuran bumbu tanpa rendang direbus kembali selama 30 menit dalam wajan sampai campuran bumbu mengental dan berwarna coklat. Daging yang telah masak kemudian ditaruh kembali dalam wajan dan ditumis selama 2 jam. Rendang kemudian dibiarkan turun suhunya menjadi suhu ruang sebelum dikemas vakum dalam kantong berlaminasi. Dua bagian
31 daging dimasukkan dalam tiap kantong dan disimpan dalam freezer semalam pada suhu -18°C (Irawati et al., 2000).
Pangan olahan siap saji berbasis daging sapi diiradiasi dengan dosis tinggi yaitu 45 kGy yang dilakukan di irradiator IRKA dengan kapasitas sumber 195 kCi pada laju dosis 5,2 kGy/jam. Dosimeter untuk kalibrasi menggunakan FW-60 film Radiochromic dan red Perspex. Kotak styrofoam dengan ukuran yang sama dipakai sebagai wadah seperti yang digunakan untuk iradiasi sup dan snack, berisi CO2 padat 10-15 kg untuk sekali proses
iradiasi.
Pada tahap pra-iradiasi, masing-masing bahan diolah ke dalam bentuk produk siap santap, termasuk tahap pemanasan guna mengaktivasi enzim autolitik, dilanjutkan dengan pengemasan, yaitu menggunakan kantung laminasi tersebut dengan teknik vakum untuk mengurangi oksidasi lemak. Iradiasi pangan siap saji dilakukan dengan suhu proses sekitar -50°C dengan cara menggunakan CO2 padat (-79°C) yang diletakkan di dalam kotak
styrofoam berisi pangan siap saji. Teknik radiasi tersebut ditujukan untuk mengeliminasi spora bakteri Clostridium botulinum dan bakteri pembentuk spora lain seperti Bacillus spp. yang bersifat patogen, tanpa menurunkan kualitas produk akhir. Diagram alir aplikasi radiasi pengion dari sumber radionuklida kobalt-60 pada dosis 45 kGy pada pangan olahan siap saji (produk berbasis ikan, daging sapi dan unggas) disajikan pada gambar 1.
32
Gambar 2. Diagram alir aplikasi radiasi pengion dari sumber radionuklida kobalt- 60 pada dosis 45 kGy terhadap pangan olahan siap saji (produk
berbasis daging) (Irawati, 2009).
Berdasarkan studi Irawati et al. (2000), hasil pengukuran kadar air, protein, lemak dan pH rendang iradiasi yang disimpan sampai dengan 18 bulan pada suhu ruang dapat dilihat pada tabel 2.
- Bahan baku yang digunakan: daging sapi
- Bumbu - Air
Tahap pembuatan pangan olahan sesuai resep masing-masing
Masing-masing dimasukkan dalam kondisi panas ke dalam kantong laminasi PET/Al-foil/LLDPE (@ kemasan 300g) kemudian divakum 80%
Dibekukan pada suhu -18°C selama 48 jam
Kotak styrofam + CO2 padat
Diiradiasi dengan dosis 45 kGy
Dikondisikan sampai sisa CO2 padat habis
kemudian produk dipindahkan dan disimpan pada suhu 28-30°C
33 Tabel 2. Hasil pengukuran kadar air, protein, lemak dan pH rendang iradiasi yang disimpan sampai dengan 18 bulan pada suhu ruang
Waktu penyimpanan (bulan) Kadar air (%) Kadar protein (%) Kadar lemak (%) pH 0 59,23 16,35 27,15 6,50 6 57,20 16,20 27,00 5,70 12 56,70 16,13 26,85 5,35 18 55,55 15,93 26,50 5,30 V. RADIKAL BEBAS
Radikal bebas adalah spesies kimia yang mengandung satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan. Definisi tersebut dapat secara luas diartikan dan tidak menunjukkan secara spesifik mengenai letak elektron yang tidak berpasangan. Definisi demikian lebih disukai sebab kebanyakan ion logam transisi dapat juga diklasifikasikan sebagai radikal bebas sehingga hubungan erat antara oksigen dan ion logam reaktif lebih mudah dimengerti (Gutteridge, 1995).
Baik anion superoksida dan radikal hidroksi merupakan radikal bebas yang memiliki potensi bereaksi dengan makromolekul biologis dan kemudian memicu kerusakan jaringan. Hidrogen peroksida (H2O2) itu sendiri merupakan
agen pengoksidasi yang lemah, tetapi dengan adanya ion logam transisi seperti besi, anion superoksida mengubah ferri menjadi ferro, yang kemudian dapat bereaksi dengan H2O2 untuk menghasilkan hidroksi radikal yang lebih reaktif.
Reaksi berantai radikal bebas pada sistem hidup adalah peroksidasi lipida yang diperantarai oleh radikal bebas oksigen dan dipercaya merupakan penyebab penting perusakan membran sel dan kerusakan sel (Yoshikawa et al., 1997).
Menurut Morello et al. (2002), pembentukan dan reaksi radikal sangat berkaitan. Skema umum dari autoksidasi lipida – inisiasi, propagasi dan terminasi – menyediakan sebuah kerangka reaksi radikal pada umumnya.
34 Inisiasi : pembentukan sumber primer radikal biasanya terjadi akibat pembelahan homolitik (homolytic fission), foto-eksitasi dan reaksi redoks yang dibantu ion logam transisi.
Propagasi: reaksi radikal-molekul menghasilkan produk reaksi terkarakterisasi. Reaksi ini meliputi abstraksi, substitusi, adisi dan fragmentasi.
Terminasi: Reaksi radikal-radikal akan saling menetralkan. Reaksi meliputi penggabungan dan disproporsionasi.
Saat ini, telah banyak diketahui berbagai peran radikal bebas in vivo. Beberapa merupakan peran negatif dan lainnya adalah peran positif. Telah diketahui bahwa radikal superoksida anion memiliki peranan penting dalam fagositosis. Radikal bebas juga memiliki peranan penting dalam transduksi sinyal dan menginduksi apoptosis yang memicu kematian sel terprogram. Keterlibatan radikal bebas sering ditunjukkan dalam oksidasi enzimatis asam-asam lemak misalnya oleh lipoksigenase. Salah satu karakteristik reaksi radikal bebas adalah situs serangan radikal seringnya tidak bersifat selektif tetapi acak. Semakin reaktif suatu radikal, maka ia menjadi semakin tidak selektif. Sebagai contoh, radikal hidroksi menyerang hampir semua molekul secara acak. Di sisi lain, radikal peroksi lebih tidak reaktif dan menyerang molekul secara lebih selektif. Radikal bebas menyerang lipida, gula, protein dan DNA untuk menginduksi oksidasi dengan mekanisme berantai yang menyebabkan kerusakan membran, modifikasi protein, deaktivasi enzim, dan kerusakan DNA. Kerusakan-kerusakan tersebut pada akhirnya akan menyebabkan berbagai penyakit, kanker, dan penuaan (Niki, 1997).
Lipida, asam nukleat, enzim dan protein merupakan molekul target penting dari kerusakan biologis yang disebabkan oleh radikal bebas oksigen. Khususnya, asam lemak tidak jenuh yang berlokasi di bagian lipofilik pada membran sel cenderung diserang oleh radikal oksigen yang menghasilkan peroksida lemak melalui sebuah reaksi berantai dari peroksidasi lipida (Yoshikawa et al., 1997). Tahap-tahap dalam peroksidasi lipida dapat dilihat pada gambar 3.
35 Gambar 3. Tahapan peroksidasi lipida (Hatherill et al., 1911)
Protein dan penyusunnya rentan terhadap serangan OH• yang dihasilkan dari H2O2 atau alkoksi lipida dan radikal peroksi sebagai konsekuensi
pembentukan radikal intermediet peroksidasi lipida. Salah satunya adalah lisin, yang dapat dimodifikasi oleh produk stabil dari hasil peroksidasi lipida seperti malonaldehida atau 4-hidroksinonenal (Evans, 1990).
Menurut Supari (1996), membran plasma merupakan tempat utama reaksi radikal bebas, karena memiliki struktur yang terdiri dari asam lemak tidak jenuh yang sangat mudah teroksidasi (lipid peroksidasi). Rusaknya asam lemak tidak jenuh pada membran plasma akan mengganggu permeabilitas membran dan radikal bebas semakin mudah masuk ke dalam sel dan mempengaruhi atau bereaksi dengan organel yang terdapat di dalam sel. Misalnya merusak lisosom, merusak inti sel, mengakibatkan kerusakan DNA sehingga menimbulkan mutagenesis. Hal inilah yang mendasari patogenesis kanker. Radikal bebas juga merusak karbohidrat di dalam sel, sehingga merusak reseptor. Perusakan asam lemak tidak jenuh akan membentuk
36 aldehida (malonaldehida) dan hidroksinonenal, yang mengakibatkan terjadinya ikatan silang (cross linkage) pada lipida, protein, fosfolipida dan asam nukleat.
W. EFEK IRADIASI PADA KOMPONEN PANGAN
Iradiasi pada bahan apapun dapat menghasilkan deposisi energi pada bahan yang diiradiasi. Energi yang terdeposisi ini dapat menyebabkan reaksi kimia yang ditunjukkan oleh pembacaan pada dosimeter. Jika bahan yang diiradiasi merupakan pangan, perubahan kimia dalam pangan tersebut dapat diperkirakan kejadiannya akan terus meningkat berbanding lurus dengan naiknya dosis iradiasi (Diehl, 1995). Perubahan kimia yang diinduksi proses radiasi merupakan bagian yang penting dalam mengevaluasi keamanan konsumsi pangan iradiasi, karena perubahan-perubahan ini mampu menyebabkan radiolisis komponen penyusun bahan pangan.
Radiolisis air menghasilkan •OH, e
-aq dan •H yang merupakan spesies
reaktif serta hidrogen dan hidrogen peroksida yang merupakan produk akhir yang stabil. Hidrogen dan hidrogen peroksida dihasilkan dalam jumlah kecil, meskipun pangan diiradiasi dengan dosis tinggi. Pembentukan hidrogen peroksida, yang diketahui merupakan agen pengoksidasi, dianggap signifikan dalam keamanan pangan iradiasi, meskipun sebenarnya tidak begitu signifikan dibandingkan dengan pembentukan produk intermediet yang sangat reaktif. Radikal hidroksil merupakan agen pengoksidasi yang kuat, elektron terhidrasi merupakan agen pereduksi yang kuat, sementara atom hidrogen adalah agen pereduksi yang kurang efektif. Karena semua bahan pangan mengandung senyawa yang dapat dioksidasi maupun direduksi, reaksi-reaksi reduksi maupun oksidasi terhadap bahan pangan mungkin saja terjadi (Diehl, 1995).
Dengan keberadaan air, karbohidrat biasanya diserang oleh radikal •OH, sementara elektron terlarut dan atom H hanya berperan kecil. Radikal •OH memutus ikatan hydrogen C-H dan membentuk air. Bergantung pada posisi molekuler C=O yang dibentuk melalui disproporsionasi atau dehidrasi,
37 produk akhirnya dapat berupa asam, keton, atau aldehida. Sebagai contoh, produk radiolitik utama yang dihasilkan dari pati jagung yang diiradiasi adalah asam format, asetaldehida, formaldehida, maltosa, aseton, metanol, juga malonaldehida (Diehl, 1995).
Protein juga menjadi molekul target serangan radikal bebas. Sebagai contoh, semua residu asam amino protein merupakan target serangan radikal hidroksi yang diproduksi oleh radiasi pengion, meski beberapa residu dihasilkan karena sebab lain. Radikal protein dibentuk oleh sebuah serangan radikal yang menyebabkan pemotongan rantai polipeptida, ikatan silang (crosslinking), oksidasi dan modifikasi asam amino. Perubahan konformasional memicu meningkatnya kerentanan terhadap proteolisis dan denaturasi panas juga kehilangan fungsi biologis (Niki, 1997).
Bagian lemak dari pangan didominasi oleh trigliserida. Dengan adanya oksigen pada saat iradiasi, autooksidasi dipercepat dengan mekanisme yang sama seperti autooksidasi akibat cahaya atau keberadaan logam. Jika udara tidak dikeluarkan dari kemasan, maka peroksida dapat mencapai nilai tinggi. Akan tetapi hal ini tidak berlaku pada pangan yang terdiri dari hanya sedikit bagian lipida. Beberapa penelitian pada iradiasi daging menunjukkan bahwa protein atau kemungkinan produk hasil interaksi antara karbohidrat dan protein memberikan efek antioksidan yang meningkat dengan semakin tingginya dosis iradiasi, sehingga dapat melindungi lipida dari perubahan oksidatif (Diehl, 1995).
Beberapa penelitian lain pada iradiasi daging mentah menunjukkan bahwa setelah proses iradiasi, nilai peroksida dan kadar malonaldehida produk daging iradiasi lebih tinggi dibandingkan produk sejenis yang tidak diiradiasi. Menurut Ahn dan Jo (1999a), radiasi pengion menghasilkan radikal hidroksi dan dapat meningkatkan laju oksidasi lipida. Ketika molekul-molekul menyerap energi ionisasi, maka akan menjadi sangat reaktif dan membentuk ion atau radikal bebas. Ion dan radikal bebas ini kemudian akan bereaksi dan membentuk produk radiolitik stabil. Senyawa volatil yang menyebabkan off-odor pada daging iradiasi dihasilkan akibat iradiasi pada
38 molekul protein dan karbohidrat dan bukan merupakan hasil dari oksidasi lipida.
X. KEAMANAN PANGAN
Dalam situasi praktis, yang menjadi faktor kritis bukanlah toksisitas intrinsik dari suatu senyawa kimia, tetapi lebih kepada resiko bahaya yang berhubungan dengan penggunaan senyawa tersebut. Dalam ilmu pangan dan gizi, sangat penting untuk memahami konsep resiko dan keamanan relatif, bahaya, dan toksisitas yang dihubungkan dengan konsumsi pangan. Resiko merupakan adanya kemungkinan (probabilitas) bahwa suatu senyawa akan menghasilkan bahaya dalam kondisi tertentu yang spesifik. Keamanan absolut, di sisi lain, merupakan jaminan bahwa kerusakan atau cedera akibat penggunaan suatu senyawa adalah tidak mungkin terjadi. Bagaimanapun, keamanan mutlak tidak mungkin dapat dicapai, sehingga, konsep keamanan relatif pun diperkenalkan (Hall, 1991). Keamanan pangan relatif kemudian dapat didefinisikan sebagai kepastian praktis bahwa cedera atau kerusakan tidak akan dihasilkan akibat konsumsi pangan atau ingredien yang digunakan dalam pengolahan pangan dengan cara dan dalam jumlah yang dapat dipertanggungjawabkan (Deshpande, 2002).
Keamanan pangan tidak hanya merujuk kepada pangan itu sendiri, tetapi juga kepada orang yang mengonsumsi. Sebagai contoh, pangan yang dianggap aman bagi sebagian besar orang ketika digunakan dengan cara dan dalam jumlah yang dapat dipertanggungjawabkan dapat menjadi sangat toksik, bahkan letal, bagi individu tertentu yang sensitif atau mempunyai alergi (Deshpande, 2002).
Y. TOKSIKOLOGI IRADIASI
Pengertian keamanan pangan ditingkatkan dengan mendefinisikan dua konsep dasar, toksisitas dan bahaya. Toksisitas dapat diartikan sebagai kapasitas sebuah senyawa untuk menyebabkan bahaya atau cedera, baik kronis
39 maupun akut dalam kondisi apapun. Hal ini temasuk kapasitas untuk merusak fetus yang sedang berkembang (teratogenisitas), mengubah kode genetik (mutagenisitas), atau untuk menginduksi kanker (karsinogenisitas). Lebih jauh, adanya penyimpangan apapun dari normal dilihat sebagai kemungkinan efek negatif, meskipun perubahannya mungkin terlihat positif, misalnya kenaikan laju pertumbuhan atau peningkatan penyerapan nutrien. Perubahan diasumsikan negatif sampai dibuktikan menguntungkan (Deshpande, 2002).
Di sisi lain, bahaya merupakan probabilitas relatif bahwa kerusakan atau cedera akan terjadi ketika senyawa yang digunakan dalam jumlah dan cara yang disarankan. Pengujian keamanan suatu pangan atau ingredien harus tidak didasarkan pada apakah pangan atau ingredien tersebut memiliki toksisitas alami tapi berdasar pada apakah menghasilkan suatu bahaya atau tidak (Deshpande, 2002).
Toksisitas suatu bahan dapat diartikan sebagai kapasitas bahan untuk memicu terjadinya reaksi berkebalikan pada makhluk hidup. Dalam hal ini berhubungan dengan timbulnya efek yang tidak diharapkan oleh tubuh (Vries, 1997).
Teknik pengujian toksisitas dapat diklasifikasikan menjadi 3 kategori umum: teknik biologis atau bioassay, teknik yang didasarkan pada metode kimia dan/atau fisik, dan teknik yang berdasar pada pengikatan nonkovalen antara satu reaktan dengan reaktan yang lain. Teknik yang ketiga juga disebut dengan binding assay. Teknik biologis atau bioassay mengukur respon yang mengikuti pengaplikasian stimulus pada suatu sistem biologis. Stimulus yang diaplikasikan direpresentasikan oleh standar atau sampel uji yang mengandung senyawa yang aktif secara biologis atau analit. Sistem biologis yang menerima stimulus mungkin merupakan organisme multiseluler, utuh, seperti binatang atau tumbuhan; organ yang diisolasi atau jaringan dari organisme multiseluler; atau sel utuh atau mikroorganisme. Keuntungan teknik biologis adalah spesifitas umumnya untuk bentuk-bentuk analit yang aktif secara biologis. Bioassay adalah metode analisis yang lebih disukai ketika bahan uji mengandung campuran bentuk analit yang aktif maupun inaktif yang tidak dapat dipisahkan secara efektif. Di sisi lain, analit mungkin
40 berada dalam berbagai bentuk aktif yang memengaruhi situs target yang sama tetapi dengan aktivitas biologis yang berbeda dan ada dalam jumlah yang tidak diketahui. Selain spesifisitas yang tinggi, uji biologis (bioassay) juga sangat sensitif. Maka, uji biologis digunakan jika tidak ada metode alternatif lain yang cocok dan tersedia (Deshpande, 2002).
Menurut Vries (1997), Pengujian toksisitas suatu senyawa dapat dilakukan secara in vitro yaitu dengan menggunakan sel limfosit manusia. Keuntungan pengujian secara in vitro adalah uji yang digunakan sangat sensitif dan dampak yang ditimbulkan dapat dilihat langsung. Efek dari ketoksikan suatu bahan dapat diamati dari seberapa banyak jumlah sel limfosit yang mati bila dibandingkan dengan keadaan awal dan dengan mengamati tingkat proliferasi sel limfosit.
Pada tahun 1980, Food and Agriculture Organization, International Atomic Energy Agency dan World Health Organization (FAO/IAEA/WHO) menyatakan bahwa iradiasi terhadap pangan dengan dosis rata-rata sampai dengan 1 Mrad (10 kGy) tidak menunjukkan bahaya toksikologi dan tidak menghasilkan perubahan nutrisi dan mikrobiologi khusus; sehingga pengujian toksikologi bagi pangan yang demikian tidak diperlukan (WHO, 1981). Selanjutnya, FDA mengusulkan bahwa pangan yang secara khusus diiradiasi pada dosis tidak melebihi 100 krad dapat dianggap aman. Berdasarkan Amandemen Bahan Tambahan Pangan (Food Additives Amendment) tahun 1958 terhadap Undang-Undang Federal Pangan, Obat-obatan dan Kosmetika (Federal Food, Drug, and Cosmetic Act) tahun 1938, iradiasi diatur sebagai bahan tambahan pangan. Industri yang menggunakan proses iradiasi harus menggunakan sumber-sumber iradiasi yang disetujui oleh FDA, dijelaskan dalam Code of Federal Regulations CFR (21 CFR 179.26): sinar gamma dari unit kobalt-60 atau sesium-137 yang disegel, elektron yang diakselerasi dari sumber mesin (<10 MeV), atau sinar X yang dihasilkan dari sumber mesin (<5 MeV). Karena pengurangan patogen yang diinduksi iradiasi paling efektif jika diterapkan setelah proses pengemasan, bahan pengemas juga harus disetujui oleh FDA sebagai bahan pengemas yang aman selama kondisi proses (Brewer, 2009).
41 Dosis maksimum yang diijinkan untuk daging tergantung pada jenis dagingnya, daging unggas ataukah daging merah, dan apakah daging tersebut hanya didinginkan atau dibekukan. Penggunaan iradiasi pada daging unggas segar maupun beku disetujui pada tahun 1992 sementara untuk daging merah disetujui pada tahun 1997 (FSIS, 1999). Untuk pengurangan patogen, penggunaan dosis maksimum 4,5 kGy diperbolehkan untuk daging mentah yang dibekukan; 3,0 kGy diperbolehkan untuk daging unggas segar atau beku (Brewer, 2009).
Sementara itu, iradiasi dengan dosis di atas 10 kGy (iradiasi dosis tinggi) pada bahan pangan dinyatakan aman sebagaimana halnya proses sterilisasi termal yang berlangsung sampai saat ini (WHO, 1999). Meskipun demikian, data pendukung keamanan pangan khususnya hasil uji toksisitas makanan siap saji iradiasi berbasis resep tradisional masih sangat terbatas khususnya di negara-negara berkembang.
Z. OKSIDASI LEMAK
Komposisi asam lemak yang menyusun membran dan lipoprotein awalnya ditentukan oleh jenis pangan yang dikonsumsi. Diketahui bahwa rata-rata vegetarian memiliki asam-asam lemak tidak jenuh, orang yang banyak memakan daging-dagingan memiliki asam arakidonat tinggi, dan orang yang banyak mengonsumsi ikan memiliki asam lemak tidak jenuh lebih tinggi seperti asam eikosapentaenoat (EPA) dan asam dokosahenoat (DHA) (Niki, 1997).
Asam lemak tidak jenuh yang memiliki dua atau lebih ikatan lebih rentan terhadap serangan radikal bebas dan autooksidasi. Kemudahan relatif dioksidasi dari asam lemak tidak jenuh meningkat seiring dengan jumlah ikatan rangkap. Telah diamati bahwa asam arakidonat dioksidasi lebih cepat daripada asam linoleat pada oksidasi yang diamati pada membran eritrosit dan lipoprotein densitas rendah (Niki, 1997).
42 AA. MALONALDEHIDA
Menurut Bird dan Draper (1984), malonaldehida (MDA) merupakan produk hasil peroksidasi lipid dalam tubuh dan sebagai indeks ketengikan oksidatif dalam makanan. Di dalam bahan biologi, malonaldehida terdapat dalam bentuk bebas dan sebagai kompleks dengan unsur pokok lainnya di dalam jaringan. Malonaldehida juga merupakan produk yang dihasilkan oleh radikal bebas melalui reaksi ionisasi di dalam tubuh dan sebagai produk samping biosintesis prostaglandin.
Asam lemak tak jenuh (ALTJ) sangat mudah mengalami proses oksidasi. Karbon metilen antara dua ikatan rangkap ALTJ sangat sensitif terhadap pengurangan hidrogen dan pembentukan senyawa radikal. Oksigen dapat menyerang asam lemak yang telah kehilangan hidrogen, membentuk senyawa radikal yang selanjutnya akan bereaksi dengan molekul lemak lainnya dan menghasilkan antara lain senyawa aldehid dan keton. Senyawa aldehida seperti hidroksialkenal, malonaldehida dan senyawa karbonil rantai pendek lainnya telah diketahui bersifat toksik terhadap sel. Konsentrasi malonaldehida dalam bahan biologi telah digunakan secara luas sebagai indikator dan kerusakan oksidatif pada lemak tak jenuh sekaligus merupakan indikator keberadaan radikal bebas (Zakaria, 1996)
Analisa malonaldehida merupakan analisa radikal bebas secara tidak langsung dan merupakan analisa yang cukup mudah untuk menentukan jumlah radikal bebas yang terbentuk. Analisa radikal bebas secara langsung sangat sulit dilakukan, karena radikal ini merupakan senyawa yang tidak stabil dan cenderung untuk merebut elektron senyawa lain agar menjadi lebih stabil. Reaksi ini berlangsung sangat cepat sehingga pengukurannya sangat sulit bila dalam bentuk senyawa radikal bebas (Gutteridge, 1995).
Menurut Conti et al. (1991), analisa jumlah MDA dapat menggunakan metode TBA. MDA dapat bereaksi dengan TBA membentuk senyawa kompleks MDA-TBA melalui reaksi nucleophilic addition reaction. Kompleks senyawa MDA-TBA yang terbentuk memiliki warna merah jambu yang dapat diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 532 nm.
43 Reaksi pembentukan kompleks MDA-TBA pada metode pengukuran kadar malonaldehida dapat dilihat pada gambar 4.
Gambar 4. Reaksi pembentukan kompleks MDA-TBA (Anonim, 2009a)
BB. KULTUR SEL
Kultur sel merupakan teknik yang biasa digunakan untuk mengembangbiakkan sel di luar tubuh atau in vitro. Pada kultur sel, kondisi kultur sel dibuat semirip mungkin dengan keadaan lingkungan awal di dalam tubuh. Hal ini dimaksudkan untuk mempertahankan spesifitas sel. Keuntungan penggunaan kultur sel adalah lingkungan tempat hidup sel dapat dikontrol, seperti pH, tekanan osmosis, CO2 dan O2 sehingga kondisi fisiologis dari
kultur relatif konstan. Salah satu kelemahan dari teknik ini, yaitu kultur sel harus dilakukan dalam kondisi steril (Freshney, 1994).
Menurut Malole (1990), faktor yang mendukung pertumbuhan sel dalam kultur adalah media pertumbuhan. Pemilihan medium merupakan langkah yang penting di dalam teknik kultur sel. Fungsi utama kultur sel adalah untuk bertahan hidup dan juga menyediakan substansi-substansi yang tidak dapat disintesa oleh sel itu sendiri. Selain itu, media kultur sel berfungsi mempertahankan pH dan osmolalitas esensial untuk viabilitas sel dan juga menyediakan nutrisi dan energi yang dibutuhkan untuk multiplikasi dan pertumbuhan sel.
Media dipilih berdasarkan kandungan zat gizi yang disesuaikan dengan jenis sel yang akan ditumbuhkan (Davis, 1994). Namun, sampai saat ini media yang paling banyak dipakai adalah RPMI-1640 yang merupakan media sintetis yang kaya nutrisi dan merupakan media terbaik untuk menumbuhkan limfosit tikus dan limfosit manusia untuk jangka pendek (Freshney, 1994). Kandungan
44 lengkap RPMI-1640 dapat dilihat pada lampiran 1 dan kandungan medium PBS dapat dilihat di lampiran 2.
Pertumbuhan sel memerlukan kondisi lingkungan yang mendukung, seperti pH lingkungan 7,4, pH di bawah 6,8 biasanya menghambat pertumbuhan sel, temperatur 37°C, konsentrasi oksigen 95%, serta konsentrasi karbon dioksida 5%. Pengaturan pH lingkungan yang stabil dilakukan dengan penambahan sodium bikarbonat. Media yang mengandung buffer bikarbonat akan membutuhkan fase gas yang mengandung CO2 untuk mempertahankan
kondisi pH tersebut, sedangkan oksigen tetap menjadi faktor utama yang dibutuhkan sel agar dapat berkembang biak secara normal pada kondisi aerob. Pengaturan suhu, konsentrasi gas oksigen dan karbon dioksida tersebut untuk menyamakan kondisi media kultur seperti kondisi di dalam tubuh (Freshney, 1992).
Harrison dan Rae (1997) menyatakan fungsi penambahan sodium bikarbonat yaitu mempertahankan pH, mempertahankan tekanan osmotik dan menyediakan sumber energi melalui reaksi:
NaHCO3 + H2O Na+ +HCO3- + H2O Na+ + H2CO3 + OH- Na+ + OH- + H2O + CO2 kebasaan meningkat
Salah satu kelemahan penggunaan sodium bikarbonat adalah membutuhkan campuran gas 5% atau 10% CO2 dalam 95% atau 90% udara
untuk ekuilibrasi.
Sistem buffer normal dalam media kultur merupakan sistem karbon dioksida-bikarbonat yang analog dengan yang terjadi dalam darah. Sistem ini merupakan sistem buffer yang lemah di mana pKanya di bawah kondisi optimum fisiologis, sehingga membutuhkan penambahan karbon dioksida pada headspace di atas medium untuk mencegah kehilangan karbon dioksida dan kenaikan ion hidroksil. Kapasitas buffer medium ditingkatkan dengan fosfat yang ada dalam balanced salt solution (BSS) (Freshney, 1992)
Penyebab kontaminasi yang paling sering terjadi adalah kegagalan dalam menerapkan teknik aseptis yang digabung dengan kepercayaan yang
45 berlebihan pada efektifitas antibiotik. Antibiotik yang paling sering digunakan adalah campuran penisilin dan streptomisin, meskipun ada masalah dalam menggunakan campuran ini secara kontinu dengan alur sel yang dipertahankan dalam jangka waktu lama. Antibiotik lain yang juga sering digunakan adalah gentamisin (50-100 µg/ml), kanamisin (100 µg/ml) dan kloramfenikol (5 µg/ml) (Harrison dan Rae, 1997).
CC. DARAH
Darah adalah suspensi yang terdiri dari elemen-elemen atau sel-sel, dan plasma yaitu larutan yang mengandung berbagai molekul organik dan anorganik (Williams, 1987). Menurut Carpenter (1975), jumlah total darah dalam tubuh hewan yang normal adalah 1/12 berat tubuhnya, sedangkan pada manusia dewasa rata-rata memiliki volume 12-14 pints (6,816-7,952 liter).
Menurut Eurell (2004), di dalam tubuh manusia terdapat tiga jenis sel darah, yaitu sel darah merah (eritrosit), sel darah putih (leukosit), dan keping darah (trombosit). Sel darah merah menyusun sedikitnya 45% dari total volume darah, sedangkan sel darah putih yang tersusun atas neutrofil, basofil, eosinofil, limfosit dan monosit menyusun kurang dari 1% dari seluruh total volume darah. Komposisi elemen seluler darah manusia dapat dilihat pada tabel 3.
46 Tabel 3. Komposisi elemen seluler darah manusia (Ganong, 1990 ; Shier et
al., 2002*)
Elemen seluler Rata-rata sel/ml Kisaran normal (/mm3darah) % dari leukosit normal 1. Leukosit Granulosit Neutrofil Eosinofil Basofil Agranulosit Limfosit Monosit 9,00 x 103 5,40 x 103 2,75 x 102 35 2,750 x 103 5,40 x 102 4,00-11,00 x 103 3,00-6,00 x 103 1,50-3,00 x 102 0-100 1,50-4,0 x 103 3,00-6,00 x 102 - 50-70 1-4 0,4 20-40 2-8 2. Eritrosit Laki-laki Wanita 5,4 x 106 4,8 x 106 4,6-6,2 x 106* 4,2-5,4 x 106* - - 3. Platelet 300.000 1,5-3,5 x 105 - DD. LIMFOSIT
Limfosit dibawa ke hampir semua jaringan dan organ vertebrata tingkat tinggi lewat dua jaringan sirkulasi, darah dan sistem limfa. Limfosit terdapat sebanyak 20-80% dari sel bernukleasi dalam darah dan lebih dari 99% dalam cairan limfatik (limfa) (Weissman et al., 1978).
Limfosit merupakan bagian dari sel darah putih yang bersifat agranulosit, berukuran kecil, berbentuk bulat dengan diameter 7-12 µm dan banyak terdapat pada organ limfoid seperti limpa, kelenjar limfe dan timus. Sel ini merupakan inti dalam proses respon imun spesifik karena sel-sel limfosit dapat mengenal setiap jenis antigen, baik antigen yang terdapat pada intraseluler maupun ekstraseluler (Kresno, 1996).
Guyton dan Hall (2006) mengatakan bahwa limfosit manusia berjumlah sekitar 30% dari jumlah normal sel darah putih. Limfosit dapat membentuk ratusan jenis antibodi dan limfosit sensitif yang berbeda-beda. Masing-masing
47 jenis sifatnya spesifik untuk suatu antigen yang khusus dan tiap jenisnya dapat menggandakan diri mencapai jumlah yang sangat besar apabila distimulasi oleh antigen spesifik yang jumlahnya cukup.
Limfosit dibentuk di dalam sumsum tulang dan berdiferensiasi menjadi sel limfosit T dan limfosit B. Secara umum, limfosit dapat dibagi menjadi 3 kelompok utama, yaitu sel B, sel T dan sel natural killer (NK). Sel B dan sel T memiliki reseptor pada permukaan yang mampu mengenal antigen tertentu, sedangkan sel NK tidak memiliki reseptor untuk mengenal antigen. Pada manusia normal, sel limfosit B berjumlah 5-15% dan sel limfosit T berjumlah sekitar 65-80% dari jumlah limfosit dalam tubuh. Kedua sel tersebut berperan sebagai respon spesifik di mana sel B berperan di dalam respon imun humoral dan sel T berfungsi dalam sistem imun seluler, sedangkan sel natural killer berperan dalam respon imun nonspesifik (Harris, 1991).
a. Limfosit T (sel T)
Limfosit T berasal dari sel hematopoetik di sumsum tulang belakang, sel ini kemudian pindah ke timus dan menjadi dewasa. Di organ timus sel T sangat cepat membelah diri. Pada proses pendewasaannya, sel ini mengalami diferensiasi menjadi Thelper (Th) Tsuppresor (Ts) dan Tcytotoxic (Tc) (Bellanti, 1993). Thelper dapat dibedakan dari Tcytotoxic pada adanya glikoprotein yang berbeda pada permukaan membran mereka. Sel T yang memiliki CD4 berfungsi sebagai TH sedangkan sel T dengan
CD8 pada permukaannya berfungsi sebagai TC. Sel berproliferasi menjadi
sel T memori dan berbagai sel efektor yang mensekresi berbagai limfokin. Limfokin ini berpengaruh pada aktivasi sel B, sel Tc, sel NK dan sel lain yang terlibat dalam respon imun (Roitt, 1991)
b. Limfosit B (sel B)
Limfosit B dewasa di sumsum tulang dan meninggalkan sumsum tulang dengan mengekspresikan sebuah reseptor pengikatan antigen yang unik pada membrannya. Reseptor sel B merupakan molekul antibodi terikat membran. Ketika sebuah sel B naif, yang belum bertemu antigen, bertemu dengan antigen yang memiliki antibodi terikat membran spesifik untuk pertama kalinya, sel akan mulai membelah dengan cepat.
48 Progeninya akan berdiferensiasi menjadi sel B memori dan sel B efektor yang disebut dengan sel plasma.
Sel B memori memiliki waktu hidup lebih lama dan terus mengekspresikan antibodi terikat membrannya dengan spesifisitas yang sama seperti B sel naif awalnya. Sel plasma tidak mengekspresikan antibodi terikat membran dalam bentuk yang dapat disekresi. Meskipun sel plasma hanya hidup beberapa hari, namun sel-sel ini dapat mensekresikan antibodi dalam jumlah besar selama hidup. Diperkirakan bahwa satu sel plasma dapat mensekresikan lebih dari 2000 molekul antibodi per detik. Antibodi yang disekresi merupakan molekul efektor yang penting dalam imunitas humoral (Kuby, 1997).
EE. PROLIFERASI SEL LIMFOSIT
Respon proliferasi limfosit pada sistem in vitro digunakan untuk menggambarkan fungsi limfosit dan status imun individu. Proliferasi merupakan fungsi biologis, yaitu proses diferensiasi dan pembelahan sel secara mitosis (Fletcher et al., 1994). Sel limfosit juga dapat berproliferasi secara nonspesifik jika dikultur dengan senyawa mitogen (Zakaria et al.,1992) sehingga banyak dipakai untuk menguji aktivitas sel limfosit.
Menurut Kuby (1997), mitogen merupakan agen yang dapat menginduksi pembelahan sel B atau T dengan persentase tinggi. Tidak seperti imunogen, yang hanya mengaktivasi reseptor limfosit yang spesifik untuk imunogen tersebut, sebuah mitogen dapat mengaktivasi banyak klon sel B atau T tanpa melihat spesifitas antigennya. Karena kemampuannya ini, mitogen dikenal sebagai aktivator poliklonal.
Beberapa jenis mitogen yang umum merupakan protein yang mengikat gula yang disebut lektin, yang mengikat secara spesifik glikoprotein pada permukaan berbagai sel, termasuk limfosit. Pengikatan molekul lektin ke glikoprotein membran sering memicu aglutinasi, atau pengklusteran sel, yang kemudian mungkin memicu aktivasi seluler dan proliferasi. Beberapa jenis mitogen yang digunakan untuk menstimulasi aktivitas proliferasi sel limfosit
49 adalah pokeweed (PWM), fitohemaglutinin (PHA), concanavalin A (Con A), dan lipopolisakarida (LPS) bakteri gram negatif. PHA, Con A dan PWM adalah lektin. Terdapat sejumlah mitogen yang hanya dapat mengaktivasi sel limfosit B atau sel limfosit T saja dan ada pula yang dapat mengaktivasi populasi keduanya. Pokeweed merupakan jenis mitogen yang mampu mengaktivasi kedua jenis sel limfosit B dan T. Mitogen PHA dan Con A dapat merangsang transformasi blast subpopulasi sel T. Sementara LPS akan bereaksi dengan membran plasma sel B dan menghasilkan aktivitas seluler (Ganong, 1979).
PWM bersumber dari tanaman pokeweed (Phytolacca americana) dengan struktur molekul polimerik dengan ligan di N-asetilkitobiose, sementara Con A bersumber dari jack bean dan PHA bersumber dari kacang merah (kidney bean). Baik Con A maupun PHA memiliki struktur molekul tetramer (Kuby, 1997).
FF. MTT ASSAY
Teknik yang sangat luas digunakan melibatkan penggunaan garam tetrazolium (MTT atau [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] yang dimetabolisme menjadi garam formazan berwarna oleh aktivitas enzim mitokondria pada sel hidup. Metode ini pertama kali digunakan pada tahun 1983 sebagai metode kolorimetri yang cepat untuk penelitian bidang imunologi dan modifikasi penggunaan metode ini telah banyak diaplikasikan. Teknik ini sangat berguna khususnya untuk menguji suspensi sel karena spesifisitasnya terhadap sel hidup. Pertimbangan ini tidak begitu penting pada kultur monolayer karena sel mati kehilangan sifat menyerapnya. Salah satu kelemahan teknik ini adalah keharusan untuk menggunakan sel tidak tetap (unfixed cells) yang mungkin menyebabkan keterbatasan waktu. Teknik ini memiliki potensi untuk digunakan dalam pengujian sensitivitas obat pada tumor manusia, dan laporan-laporan awal mengenai penelitian tersebut menunjukkan hasil yang memuaskan. Beberapa publikasi terbaru menyebutkan beberapa masalah teknis yang memengaruhi
50 interpretasi hasil pengujian yang harus dipertimbangkan ketika merencanakan protokol pengujian. Hal ini termasuk kemungkinan aktivitas enzim mitokondria pada sel yang diberi perlakuan obat dan efek pengkondisian medium oleh sel pada saat produksi formazan. Spektrum absorpsi MTT-formazan juga diketahui tergantung pada pH dan kerapatan sel, namun sebuah metode telah diperjelas dan mampu menjawab permasalahan dan meningkatkan linearitas hubungan antara MTT-formazan dan kerapatan sel khususnya pada jumlah sel yang besar (Freshney, 1992).
Uji MTT tetrazolium merupakan salah satu metode analisis kolorimetrik untuk mengukur viabilitas sel yang paling banyak digunakan, karena MTT dapat diubah menjadi kristal biru formazan yang tidak larut air oleh aktivitas enzim dehidrogenase di dalam sel hidup, kemudian OD formazan secara tidak langsung akan menunjukkan jumlah sel yang hidup. Bagaimanapun, telah diketahui juga bahwa reliabilitas dan sensitivitas metode ini dipengaruhi oleh berbagai faktor diantaranya volume sel, antioksidan dan senyawa berwarna lainnya (Wang et al., 2006) .
Enzim suksinat dehidrogenase adalah salah satu enzim yang berperan aktif selama proses respirasi seluler secara aerobik. Enzim suksinat dehidrogenase merupakan flavoprotein yang mengandung protein dengan ikatan Fe (besi) dan S (belerang). Enzim ini terikat pada bagian membran mitokondria yang berfungsi sebagai reduktor selama tahapan siklus Krebs dan transport elektron. Pada siklus Krebs, enzim ini menerima hidrogen dari suksinat dan bertugas menghidrogenasi suksinat menjadi fumarat serta menghasilkan FADH2. FADH2 yang dibentuk akan mengalami reoksidasi
pada rantai transport elektron yang berkaitan erat dengan pembentukan energi (ATP) dalam proses fosforilasi oksidatif (Lehninger, 1982).
Suksinat dehidrogenase merupakan satu-satunya enzim terikat membran dalam siklus asam sitrat, lainnya adalah komponen matriks mitokondria, sehingga enzim ini ditempatkan untuk menyalurkan elektron secara langsung ke mekanisme transpor elektron pada membrane mitokondria (Voet et al., 2006).
51 Menurut Freimoser et al. (1999), MTT assay merupakan metode uji viabilitas sel kuantitatif yang lebih praktis, cepat dan efisien dengan hasil yang cukup akurat dibandingkan dengan menggunakan metode pewarnaan tripan biru yang dilakukan secara manual pada pengujian sel fungi. Reduksi garam tetrazolium merupakan cara yang dapat dipercaya untuk mendeterminasi proliferasi sel limfosit. Garam tetrazolium MTT yang berwarna kuning berkurang sebagai akibat proses metabolisme sel, terutama karena aktivitas kerja enzim suksinat dehidrogenase. Kristal formazan tidak larut air berwarna biru tua yang terbentuk dapat dilarutkan dengan pelarut organik seperti isopropanol, etil asetat, dietil eter atau n-butanol dan kemudian diukur dengan spectrophotometer microplate reader.
Sel yang berproliferasi aktif secara metabolik daripada sel yang tidak berproliferasi (ada pada tahap istirahat), maka uji ini sesuai tidak hanya untuk penentuan aktivasi sel dan proliferasi. Uji kolorimetrik merupakan uji yang cepat dan mudah. Karena teknik ini tidak membutuhkan pencucian maupun pemanenan sel, uji lengkap dari awal mikrokultur sampai analisis data dalam sebuah ELISA plate reader dapat dilakukan pada lempeng mikrokultur yang sama (Rode et al., 2009).
Reaksi reduksi pewarna MTT oleh enzim suksinat dehidrogenase yang dihasilkan sel hidup dapat dilihat pada gambar 5.
Gambar 5. Reaksi reduksi pewarna MTT oleh enzim suksinat dehidrogenase (The University of Queensland, 2009)
Kandungan enzim suksinat dehidrogenase relatif konstan di antara berbagai sel dengan tipe spesifik sehingga jumlah formazan yang dihasilkan
52 dapat dipercaya berbanding lurus terhadap jumlah sel. Pengujian jumlah proliferasi sel limfosit manusia menggunakan uji MTT dengan mengukur nilai absorbansi yang akan digunakan untuk mendapatkan nilai indeks stimulasi (I.S.). Metode ini sering digunakan untuk mengukur proliferasi sel dan toksisitas sel. Semakin tinggi absorbansi maka semakin tinggi pula nilai indeks stimulasi yang menandakan semakin banyak jumlah sel limfosit yang hidup. Sebaliknya, semakin rendah absorbansi maka semakin rendah indeks stimulasi yang berarti semakin banyak sel limfosit yang mati.
GG. ERITROSIT
Eritrosit adalah sel yang berukuran kecil dan berdiameter kira-kira 7,5 µm. Sel ini berbentuk lempeng bikonkaf yang artinya tipis di bagian tengah dan tebal di bagian pinggir. Bentuknya yang khusus ini merupakan adaptasi fungsi sel darah merah yaitu dalam mentranspor gas. Bentuknya menyebabkan luas permukaan menjadi lebih besar di mana gas-gas dapat berdifusi. Selain itu, membran selnya menjadi lebih dekat dengan molekul pembawa oksigen – hemoglobin – dalam sel. Akibatnya, sel darah merah dapat dengan mudah berubah bentuk ketika melewati kapiler. Pada pria normal, jumlah rata-rata sel darah merah per milliliter kubik adalah 4.600.000-6.200.000 dan pada wanita normal 4.200.000-5.400.000. Jumlah sel darah merah biasanya naik setelah beberapa hari melakukan latihan berat atau jika sedang berada di tempat yang lebih tinggi karena kenaikan jumlah oksigen yang dibutuhkan (Shier et al., 2002). Pembentukan eritrosit merupakan subyek dari kontrol umpan balik. Pembentukannya dihambat oleh kenaikan level sirkulasi sel darah merah terhadap nilai supernormal dan distimulasi oleh anemia, juga distimulasi oleh hipoksia dan kenaikan pada jumlah sel darah merah yang bersirkulasi merupakan ciri umum karena aklimatisasi ketinggian (Ganong, 1990).
Karena fungsinya yang sangat penting di dalam tubuh dan kerentanannya terhadap oksidasi, banyak sekali penelitian yang menggunakan eritrosit sebagai model untuk mempelajari kerusakan oksidatif biomembran dan pengaruh berbagai senyawa yang terdapat pada makanan, dalam
53 menghambat terjadinya kerusakan pada membran. Pada umumnya parameter yang digunakan untuk mengetahui terjadinya kerusakan pada membran adalah persentase hemolisis yang terjadi pada eritrosit. Semakin tinggi persentase hemolisis yang terjadi menandakan semakin parahnya kerusakan yang terjadi pada membran eritrosit, begitu pula sebaliknya, semakin rendah persentase hemolisis yang terjadi menandakan semakin tahan membran sel terhadap kerusakan (Amri, 2007).
Eritrosit dipilih sebagai model in vitro untuk mempelajari interaksi oksidan/antioksidan karena membrannya kaya akan asam lemak tidak jenuh yang sangat rentan terhadap peroksidasi yang diperantarai oleh radikal bebas, dan dianggap dapat mewakili membran plasma secara umum (Shiva Shankar Reddy et al., 2007).
HH. HEMOLISIS ERITROSIT
Hemolisis adalah pecahnya sel darah merah dan keluarnya hemoglobin ke dalam plasma. Hemolisis eritrosit kemungkinan merupakan hasil akhir dari kerusakan minor pada membran eritrosit. Integritas struktur membran merupakan ciri penting resistansi eritrosit terhadap serangan peroksidatif (Gratzer, 1981). Eritrosit juga rentan terhadap stres oksidatif karena adanya fosfolipida membran yang tidak jenuh (Gain dan Shohet, 1981), paparan yang terus menerus terhadap tensi oksigen tinggi dan adanya logam transisi dalam jumlah berlebih yang dapat bertindak sebagai agen redoks (Pryor, 1976). Adanya hemoglobin dan senyawa hematin lainnya mungkin juga meningkatkan proses peroksidasi lipida (Tappel, 1953). Kerusakan sel darah merah diperkirakan terjadi baik karena oksidasi membran atau denaturasi hemoglobin (Hatherill et al., 1991).
Pada dasarnya ketika sel darah merah telah mencapai batas akhir masa hidupnya, sekitar 120 hari, akan terjadi hemolisis secara alami. Proses ini diawali dengan menurunnya volume sel hingga 13%, meningkatnya sensitivitas membran sel karena faktor stress, menurunnya deformabilitas, dan
54 beberapa perubahan pada daya adhesi dan transpor membran (Bartosz, 1990). Keadaan tersebut nantinya akan menuju kepada hemolisis sel darah merah.
Pengujian aktivitas antihemolisis pada sel darah merah dapat dilakukan dengan penambahan larutan pengoksidasi seperti H2O2, senyawa-senyawa
aldehida seperti formaldehida, asetaldehida, atau glutaraldehida dan juga aloksan (Rose dan Gyorgy, 1950)
II. ANTIOKSIDAN
Antioksidan adalah senyawa yang ketika berada dalam jumlah kecil, dibandingkan dengan substrat yang dioksidasi, dapat menunda atau menghambat oksidasi substrat. Antioksidan dapat beraksi pada beberapa tahap berbeda dalam sebuah sekuensi oksidatif, sebagaimana diilustrasikan dengan melihat oksidasi lipida yang terjadi di membran sel atau produk kaya lipida. Antioksidan dapat bekerja dengan cara: a) membuang oksigen atau menurunkan konsentrasi oksigen lokal; b) membuang ion logam katalitik; c) membuang spesien kunci oksigen reaktif; d) mengikat radikal bebas yang menginisiasi seperti spesies hidroksil, alkoksil dan peroksil; e) memutus rantai sekuens yang telah diinisiasi; f) memecah atau mengikat oksigen singlet (Gutteridge, 1995).
JJ. KOMPONEN BIOAKTIF DALAM BUMBU RENDANG
Dalam pembuatan rendang digunakan berbagai bumbu dan rempah, seperti cabai merah, bawang merah, bawang putih, daun sereh, daun kencur, daun jeruk, asam kandis, lengkuas dan jahe. Bumbu dan rempah ini juga memiliki kandungan komponen bioaktif yang memiliki antioksidan dan manfaat bagi kesehatan. Komponen bioaktif ini mungkin memiliki peran membantu melawan radikal bebas yang mungkin ada pada pangan iradiasi.
55 1. Cabai merah (Capsicum anuum)
Cabai merah memiliki kandungan komponen capsaicin dan dihidrocapsaicin yang memiliki peran dalam memberikan rasa pedas pada cabai. Oleoresin dari cabe merah mengandung 6,38% capsaicin yang kepedasannya setara dengan satu juta unit Scoville (Farrell, 1990).
2. Bawang Merah (Allium cepa L.)
Bawang merah (Allium cepa L.) diketahui memiliki banyak komponen flavonoid seperti quercetin, kaempferol, yang ditemukan dalam berbagai bentuk mono dan diglikosida, misalnya rutin (quercetin-3-rutinoside). Selain itu, bawang merah memiliki banyak senyawa yang mengandung sulfur yang volatil (Wetli, 2004), seperti alliin, and g-glutamilsistein (Corzo-Martinez et al.., 2007). Senyawa bersulfur inilah yang berperan sebagai antimikroba (Rose et al., 2005).
3. Bawang Putih (Allium sativum L.)
Bawang putih memiliki komponen bioaktif bersulfur yang tidak jauh berbeda dengan bawang merah seperti ajoene, dan juga komponen lain seperti b-chlorogenin dan quercetin (Rahman dan Lowe, 2006). DAS, diallil sulfoksida (DASO), diallyl sulfone (DASO2), DADS, DATS, dan SAC yang terdapat pada bawang putih memiliki aktivitas antikanker (Sigounas et al., 1997).
4. Sereh (Cymbopogon citratus)
Pada penelitian yang dilakukan Yoo et al. (2008) didapatkan bahwa sereh memiliki komponen fenolik dan flavonoid. Jumlah komponen fenolik pada sereh sebesar 662,0 mg GAE/100 g, sementara jumlah komponen flavonoid sebesar 300,5 mg CE/100 g. Berdasarkan penelitian Figueirinha et al. (2008), komponen bioaktif yang terdapat pada sereh adalah tannin, kafeat, turunan asam p-kumarat, dan glikosida flavon (apigenin dan turunan luteolin).
56 5. Daun kunyit (Curcuma longa)
Kunyit mengandung senyawa kurkumin yang merupakan antioksidan larut lemak yang kuat. Banyak studi telah membuktikan aktivitas antioksidan kurkumin baik dalam sistem in vitro maupun in vivo. Kurkumin memiliki karakteristik anti-inflamasi dan menunjukkan bahwa komponen ini dapat menghambat peroksidasi lipida dalam berbagai model uji hewan (Reddy dan Lokesh, 1994). Kurkumin dibiosintesis pada daun, kemudian ditranspor ke rimpang kunyit untuk disimpan (Dixit dan Srivastava, 2000).
6. Daun jeruk (Citrus aurantifolia)
Menurut studi Rasooli dan Razzaghi-Abyaneh (2004), minyak esensial yang diekstrak dari daun jeruk memiliki aktivitas antifungi dan antiaflatogenik. Senyawa-senyawa yang terkandung dalam minyak esensial yang diekstrak dari daun jeruk adalah pinene, sabinene, myrcene, telinene dan limonene. Senyawa dengan jumlah terbanyak pada minyak esensial tersebut adalah limonene (85,5%).
7. Asam kandis (Garcinia xanthocymus)
Asam kandis merupakan tanaman yang termasuk keluarga Guttiferae yang kaya akan xanthone, biflavonoid dan benzophenon (Sordat-Diserens et al., 1989). Komponen bioaktif yang terdapat pada asam kandis adalah xanthochymol, isoxanthochymol, volkensiflavone, morelloflavone, 1,5-dihydroxyxanthone dan 1,7-1,5-dihydroxyxanthone (Karanjgoakar et al., 1973).
8. Lengkuas (Alpinia galanga)
Seperti rempah lain, lengkuas kaya akan senyawa fenolik, seperti flavonoid dan asam fenolat. Lengkuas memiliki komponen aktif kamfer, galangi, galangol, eugenol, dan kurkumin (Muchtadi dan Sugiyono, 1992). Menurut penelitian Mayachiew dan Devahastin (2008), ekstrak lengkuas
57 memiliki komponen aktif 1,8-cineole (20.95%), bisabolene (13.16%), b-caryophyllene (17.95%) dan b-selinene (10.56%).
9. Jahe (Zingiber officinale)
Jahe memiliki komponen aktif, baik dalam bentuk volatil maupun non-volatil. Komponen minyak yang volatil pada jahe utamanya terdiri dari hidrokarbon sesquiterpen, yang didominasi zingeberene (35%), curcumene (18%) dan farnesene (10%), dan l-bisabolene dan b-sesquiphellandrene dengan jumlah lebih kecil. Persentase lebih kecil terdiri dari dari 40 hidrokarbon monoterpenoid yaitu 1,8-cineole, linalool, borneol, neral, dan geraniol yang memiliki jumlah paling banyak (Govindarajan, 1982). Konstituen ini berkontribusi kepada aroma dan rasa khas dari jahe.
Komponen non-volatil jahe seperti gingerol, shogaol, paradol, dan zingerone menghasilkan sensasi pedas di mulut. Gingerol, yang terdiri dari beberapa senyawa homolog kimia yang dibedakan oleh panjangnya rantai alkil tak bercabang diidentifikasi sebagai komponen aktif dengan jumlah terbesar pada rimpang segarnya (Govindarajan, 1982). Shogaol, bentuk terdehidrasi dari gingerol, merupakan konstituen dominan jahe kering (Connell and Sutherland, 1969). Paradol mirip gingerol dan merupakan hasil hidrogenasi shogaol. Selain komponen tersebut, rimpang jahe juga mengandung enzim proteolitik potensial yang disebut zingibain. Jahe memiliki aktivitas antikanker, antioksidatif dan antimutagenik (Shukla dan Singh, 2007).
