Lampiran 1. Proses Ekstraksi
Pengumpulan, pengeringan dan simplisia kulit batang R. mucronata
Proses penyaringan setelah maserasi
Pemisahan ekstrak dengan pelarut menggunakan
Lampiran 2. Proses Pengujian Toksisitas
Penimbangan garam, Pelarutan garam dalam akuades dan Pengambilan kista A. salina
Pemasukan A. salina dalam wadah penetasan, Penimbangan ekstrak, dan Pemberian DMSO
Lampiran 2. Lanjutan
ekstrak dengan pelarut n-heksana, ekstrak dengan pelarut metanol dan Pemasukan
A. Salina dalam botol uji
Lampiran 3. Proses Pengujian Antimikroba
Penimbangan Ekstrak, Penghomogenan ekstrak dengan DMSO dan Penyiapan suspensi bakteri
Pembandingan dengan larutan Mcfarland dan pengolesan suspensi bakteri pada media uji
Lampiran 4. Analisis Kriteria Bakteri Aeromonas hydrophila
Uji oksidase positif dan uji Rimmler-Shoots (RS) positif
Uji Motilitas motil dan Uji O/F positif
Lampiran 5. Analisis Kriteria Bakteri Streptococcus agalctiae
Uji motilitas non motil dan uji O/F positif fermentatif
Lampiran 6. Analisis Kriteria Bakteri Saprolegnia sp.
Proses penanaman jamur
Lampiran 7. Data Awal Zona Hambat Ekstrak Kulit Batang Rhizophora
mucronata terhadap Bakteri Aeromonas hydrophila,
Streptococcus agalactiae dan Jamur Saprolegnia sp..
a. Zona hambat pada bakteri A. hydrophila.
Ekstrak Ulangan Zona hambat 24 jam (mm)
60% 40% 20% Metanol U1 0 0 0 U2 0 0 0 U3 0 0 0 N-heksana U1 12,20 0 0 U2 10,25 10,10 0 U3 10,30 0 0 Eti asetat U1 9,20 7,25 7,05 U2 9,35 7,45 7,15 U3 13,20 8,25 7,45 Kloramfenikol U1 33,5 U2 37,5 U3 33,65 DMSO U1 0 U2 0 U3 0
b. Zona hambat pada bakteri S. agalactiae. Ekstrak
Ulangan
Zona hambat 24 jam (mm)
60% 40% 20% Metanol U1 14,95 14,45 12,95 U2 16,30 11,35 14,50 U3 15,25 16,80 15,90 N-heksana U1 0 0 0 U2 0 0 0 U3 0 0 0 Eti asetat U1 24,65 13,65 19,50 U2 20,20 18,5 19,75 U3 26,60 23,55 18,50 Kloramfenikol U1 41,30 U2 58,95 U3 42,45 DMSO U1 0 U2 0 U3 0
c. Data awal pengukuran rata-rata jari-jari hambatan jamur Saprolegnia sp. pada berbagai ekstrak dan konsentrasi
Hari
ke Ekstrak
Rata-rata pertumbuhan hifa pada berbagai konsentrasi ( mm )
Rata-rata pertumbuhan
hifa normal ( mm )
Rata-rata jari-jari zona hambat (mm) 60% 40% 20% K 60% 40% 20% K 1 Metanol 15,6 16,6 16,6 20 4,4 3,4 3,4 N-heksana 18,3 19,3 19,3 19,3 1 0 0 Etil asetat 14 14,3 15 18 4 3,7 3 Nistatin 18 20 2 DMSO 18 18 0 2 Metanol 17,6 18 19 38,6 21 20,6 19,6 N-heksana 38 38 39,3 40,6 2,6 2,6 1,3 Etil asetat 14,3 16 16,6 36 21,6 20 19,4 Nistatin 35,3 37,3 2 DMSO 41,6 41,6 0 3 Metanol 26 36,3 40,6 45 19 8,7 4,4 N-heksana 45 45 45 45 0 0 0 Etil asetat 14,3 15,6 25 45 30,7 29,4 20 Nistatin 45 45 0 DMSO 45 45 0
Lampiran 8. Tabel Probit Persentase Probit 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 - 2,67 2,95 3,12 3,25 3,36 3,45 3,52 3,59 3,66 10 3,72 3,77 3,82 3,87 3,92 3,96 4,01 4,05 4,08 4,12 20 4,16 4,19 4,23 4.26 4,29 4,33 4,36 4,39 4,442 4,45 30 4,48 4,5 4,53 4,56 4,59 4,61 4,64 4,67 4,69 4,72 40 4,75 4,77 4,8 4,82 4,85 4,87 4,9 4,92 4,95 4,97 50 5 5,03 5,05 5,08 5,1 5,13 5,15 5,18 5,2 5,23 60 5,25 5,28 5,31 5,33 5,36 5,39 5,41 5,44 5,47 5,5 70 5,52 5,55 5,58 5,61 5,64 5,67 5,71 5,74 5,77 5,81 80 5,84 5,88 5,92 5,95 5,99 6,04 6,08 6,13 6,18 6,23 90 6,28 6,34 6,41 6,48 6,55 6,64 6,75 6,88 7,05 7,33 99 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 7,33 7,37 7,41 7,46 7,51 7,58 7,65 7,75 7,88 8,09
Lampiran 9. Data awal kematian Artemia salina pada berbagai konsentrasi uji.
Perlakuan Ulangan Rata-rata U1 U2 U3 Etil asetat 1000 ppm 10 10 10 10 100 ppm 7 7 6 6,6 10 ppm 5 4 4 4,3 Metanol 1000 ppm 10 10 10 10 100 ppm 4 6 6 5,3 10 ppm 4 6 3 4,3 n-heksana 1000 ppm 10 10 10 10 100 ppm 6 6 7 6,3 10 ppm 3 5 2 3,3
Kontrol air laut 3 1 2 2
Lampiran 10. Perhitungan LC50 pada ekstrak kulit batang Rhizophora mucronata dengan pelarut etil asetat
Perlakuan Konsentrasi (ppm) Total Populasi Jumlah Kematian Persen Mortalitas (%) Log Konsentrasi Probit LC (ppm) 50 Etil asetat 1000 30 30 100 3 8,09 21,06 100 30 20 66,66 2 5,41 10 30 13 43,33 1 4,82
Contoh perhitungan persen mortalitas pada ekstrak etil asetat dengan konsentrasi 100 ppm
Persen mortalitas = Jumlah Artemia yang mati Jumlah populasi
x 100%
= 20/30 x 100 % = 66,66 %
Kurva hubungan log konsentrasi versus nilai probit ekstrak etil asetat:
Dari grafik hubungan antara log konsentrasi (sumbu x) dengan nilai probit sumbu y didapatkan persamaan y = 1,635x + 2,836 dan R² = 0,880
Penentuan LC50
50% nilai probit (y) = 5 (dilihat dari table probit), x = log konsentrasi. Perhitungan LC
(Konsentrasi yang dapat menyebabkan kematian sebesar 50 %)
Lampiran 10. Lanjutan
x = (5 – 2,836) / 1,635 x = 1,323547401
anti log dari x = 1,323547401 LC50
b. Perhitungan LC
= 21,06 ppm
50 pada ekstrak kulit batang Rhizophora mucronata
dengan pelarut metanol.
Perlakuan Konsentrasi (ppm) Total Populasi Jumlah Kematian Persen Mortalitas (100%) Log Konsentrasi Probit LC50 (ppm) Metanol 1000 30 30 100 3 8,09 24,59 100 30 16 53,33 2 5,08 10 30 13 43,33 1 4,82
Contoh perhitungan persen mortalitas pada ekstrak metanol dengan konsentrasi 100 ppm
Persen mortalitas = Jumlah Artemia yang mati Jumlah populasi
x 100%
= 16/30 x 100 % = 53,33 %
Kurva hubungan log konsentrasi versus nilai probit ekstrak metanol:
Dari grafik hubungan antara log konsentrasi (sumbu x) dengan nilai probit sumbu y didapatkan persamaan y = 1,635x + 2,726 dan R² = 0,809
Lampiran 10. Lanjutan
Penentuan LC50
50% nilai probit (y) = 5 (dilihat dari table probit), x = log konsentrasi (Konsentrasi yang dapat menyebabkan kematian sebesar 50 %)
Perhitungan LC50
5 = 1,635x + 2,726
dari persamaan regresi y = 1,635x + 2,726 dan R² = 0,809 adalah sebagai berikut:
x = (5 – 3,73) / 1,635 x = 1,390825688
anti log dari x = 1,390825688 LC50
c. Perhitungan LC
= 24,59 ppm
50 pada ekstrak kulit batang Rhizophora mucronata
dengan pelarut n-heksana.
Perlakuan Konsentrasi (ppm) Total Populasi Jumlah Kematian Persen Mortalitas (100%) Log Konsentrasi Probit LC50 (ppm) n-heksana 1000 30 30 100 3 8,09 27,38 100 30 19 63,33 2 5,33 10 30 10 33,33 1 4,56
Contoh perhitungan persen mortalitas pada ekstrak n-heksana dengan konsentrasi 100 ppm
Persen mortalitas = Jumlah Artemia yang mati Jumlah populasi
x 100%
= 19/30 x 100 % = 63,33 %
Lampiran 10. Lanjutan
Dari grafik hubungan antara log konsentrasi (sumbu x) dengan nilai probit sumbu y didapatkan persamaan y = 1,765x + 2,463 dan R² = 0,904
Penentuan LC50
50% nilai probit (y) = 5 (dilihat dari table probit), x = log konsentrasi (Konsentrasi yang dapat menyebabkan kematian sebesar 50 %)
Perhitungan LC50
5 = 1,765x + 2,463
dari persamaan regresi y = 1,765x + 2,463 dan R² = 0,904 adalah sebagai berikut:
x = (5 – 2,463) / 1,765 x = 1,437393768
anti log dari x = 1,437393768 LC50 = 27,38 ppm
Lampiran 11. Perhitungan konsentrasi untuk uji antimikroba
Ekstrak dengan konsentrasi 60% dibuat dengan melarutkan ekstrak sebanyak 0,6 gram dalam 1 ml DMSO. Kemudian diencerkan menjadi konsentrasi 40% dan 20% dalam 0,5 DMSO. Contoh perhitungan pengencerannya adalah sebagai berikut:
Pengenceran 40% V1 x N1 = V2 x N2 V1 x 60 = 0,5 x 40 V1 = 20/60
V1 = 0,333 ml atau 333,33 µl diambil dari konsentrasi 60% kemudian diencerkan dengan DMSO sebanyak 166,67 µl sehingga didapatkan konsentrasi 40% sebanyak 0,5 ml
Pengenceran 20% V1 x N1 = V2 x N2 V1 x 60 = 0,5 x 20 V1 = 10/60
V1 = 0,166 ml atau 166,66 µl diambil dari konsentrasi 60% kemudian diencerkan dengan DMSO sebanyak 333,34 µl sehingga didapatkan konsentrasi 20% sebanyak 0,5 ml.
