Ringkasan Pengkajian Keamanan Pangan Jagung PRG Event GA21
I. Pendahuluan
Jagung PRG event GA21 adalah produk perusahaan Syngenta yang tidak ada bedanya dengan jagung non PRG kecuali dari sifat toleran herbisida glifosat.
Jagung PRG event GA21 telah digunakan sebagai pangan dan atau pakan di 14 negara yaitu Amerika Serikat (1996), Jepang (1999), Kanada (1999), Australia (2000), Afrika Selatan (2002), Korea Selatan (2002), Meksiko (2002), Filipina (2003), Taiwan (2003), Cina (2004), Argentina (2005), Uni Eropa (2006), Rusia (2007), dan Brasil (2008).
Berdasarkan Peraturan Kepala Badan POM Nomor HK.00.05.23.3541 Tahun 2008 tentang Pedoman Pengkajian Keamanan Pangan Produk Rekayasa Genetik, TTKHKP telah melakukan pengkajian keamanan pangan jagung PRG event GA21 berdasarkan informasi genetik dan informasi keamanan pangan yang terdiri atas kesepadanan substansial, alergenisitas, dan toksisitas sebagaimana diuraikan di bawah ini.
II. Informasi Genetik
II.1 Elemen Genetik
Jagung PRG event GA21 mengandung satu gen interes yaitu mEPSPS (mutated/modified maize EPSPS). EPSPS adalah 5 enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase yang bertanggung jawab dalam toleransi terhadap herbisida glifosat. Promoter yang digunakan adalah r-act (rice actin) dari tanaman padi, dengan terminator NOS (nopaline synthase) dari Agrobacterium tumefaciens.
II.2 Sumber Gen Interes
Gen EPSPS berasal dari jagung dan telah dimodifikasi menghasilkan dua perubahan spesifik dibanding dengan EPSPS asli jagung. Perubahan tersebut adalah pada asam amino posisi 102 (treonin menjadi isoleusin) dan 106 (prolin menjadi serin). Oleh karena itu gen EPSPS dalam jagung PRG event GA21 ini disebut gen mEPSPS (mutated/modified maize EPSPS). Gen mEPSPS, di dalam jagung PRG event GA21 mengekspresikan toleransi terhadap herbisida yang mengandung glifosat.
II.3 Sistem Transformasi
Jagung PRG event GA21 dirakit menggunakan plasmid pDPG434 melalui teknik transformasi dengan penembakan partikel (microprojectile bombardment) pada kultur sel suspensi (suspension culture cells) tanaman jagung. Plasmid berasal dari vektor pSK yang umumnya digunakan di dalam biologi molekuler dan diperoleh dari pUC19. Fragmen restriksi NotI mengandung kaset ekspresi (expression cassette) yang digunakan untuk transformasi. Fragmen restriksi mengandung mEPSPS, tetapi tidak mengandung awal replikasi (origin of replication), gen bla atau partial lacZ sequence.
II.4 Stabilitas Genetik
DNA yang disisipkan ke dalam genom jagung PRG event GA21 yang dikaji dengan Southern blot menunjukkan kestabilan sampai tiga generasi silang balik secara berurutan. Sifat yang diintroduksikan mengalami segregasi sebagai lokus tunggal mengikuti pewarisan sifat sesuai dengan hukum Mendel.
II.5 Kesimpulan
Berdasarkan hasil pengkajian informasi genetik dapat disimpulkan bahwa :
a. Gen interes (mEPSPS) yang diintroduksikan ke jagung PRG event GA21 berasal dari jagung dan tidak berasal dari sumber alergen;
b. Gen interes (mEPSPS) yang diintroduksikan ke jagung PRG event GA21 masih stabil pada tiga generasi silang balik [Back Cross (BC3)];
c. Jagung PRG event GA21 mengandung satu kopi gen mEPSPS;
d. Gen interes (mEPSPS) yang diintroduksikan ke jagung PRG event GA21 mengikuti pewarisan sifat sesuai dengan hukum Mendel; dan
e. Jagung PRG event GA21 tidak ada bedanya dengan jagung non PRG kecuali pada sifat toleran herbisida glifosat.
II.6 Pustaka
Scott Rabe, Derrick Pulliam, Brian Harper, and Tanya Chalk. 2006. Molecular Characterization of Transgenic Maize Event GA21. Syngenta Seeds Biotechnology Report No. SSB-131-05 A1. Syngenta Biotechnology, Inc. Regulatory Science & Product Support. Post Office Box 12257. 3054 East Cornwallis Road. Research Triangle Park, North Carolina, USA 27709-2257
III. Informasi Keamanan Pangan III.1 Kesepadanan Substansial
Hasil pengkajian kesepadanan substansial jagung PRG event GA21 secara lengkap dilaporkan dalam Syngenta Seeds Biotechnology Report No. SSB-126-05 berjudul: “Compositional Analysis of Grain and Forage from Maize Event GA21 Expressing a Double Mutated Maize 5-Enol Pyruvylshikimate-3- Phosphate Synthase (mEPSPS)” (Catherine Kramer and Justin De Fontes, 2005).
Dalam laporan tersebut disajikan hasil pengujian komposisi zat gizi utama biji jagung dan bagian tanaman jagung lainnya (forage) yang berasal dari jagung PRG event GA21 dan tanaman jagung non PRG, dari enam lokasi di Amerika Serikat pada tahun 2004. Keenam lokasi tersebut adalah: Bloomington, IL; Shirley, IL; Bondville, IL; Glidden, IA; Stanton, MN; dan Faribault, MN.
Pengujian laboratorium yang dilakukan pada biji jagung meliputi: proksimat (kadar air, protein, lemak, abu, dan karbohidrat), pati, acid detergent fiber (ADF), neutral detergent fiber (NDF), mineral (Ca, Cu, Fe, Mg, Mn, P, K, Na, Zn dan Se), vitamin (beta-karoten, asam folat, B1, B2, B3, B6, C, dan E), komposisi asam amino, komposisi asam lemak, asam ferulat dan para-kumarat, furfural, inositol, asam fitat, rafinosa, dan inhibitor tripsin. Sedangkan pada bagian tanaman jagung (forage), pengujian yang dilakukan adalah proksimat (kadar air, protein, lemak, abu, dan karbohidrat), ADF, NDF, dan mineral (Ca, P).
Hasil pengujian menunjukkan bahwa komposisi zat gizi utama tidak berbeda nyata antara jagung PRG event GA21 dengan jagung non PRG. Hanya beta-karoten yang secara nyata lebih tinggi kadarnya pada jagung PRG event GA21 dibandingkan
dengan jagung non PRG, namun masih dalam kisaran data yang dipublikasikan dalam pustaka (ILSI, 2004; USDA, 2004; OECD, 2002; Souci, 1994 dan Watson, 1987).
Dari hasil pengkajian kesepadanan substansial dapat disimpulkan bahwa jagung PRG event GA21 sepadan secara substansial dengan jagung non PRG.
III.2 Alergenisitas
Analisis alergenisitas dilakukan di laboratorium Syngenta yang telah menerapkan Good Laboratory Practice, dan di Central Toxicology Laboratory, Alderley Park Macclesfield, Cheshire, UK.
Gen mEPSPS yang ditransformasikan ke dalam jagung PRG event GA21 mengekspresikan protein dengan 576 asam amino termasuk transit peptida yang mengandung 131 asam amino yang kemudian menghasilkan protein mEPSPS matang dengan 445 asam amino (47,4 kDa). Hasil analisis homologi sekuen asam amino menunjukkan 99,3% identik dengan enzim wild-type yang berasal dari jagung non PRG.
Analisis Western blot dilakukan terhadap ekstrak jaringan jagung PRG event GA21 dan jagung non PRG. Analisis ini mengkonfirmasikan ekspresi protein 47,4 kDa yang merupakan ukuran protein utuh (full-length) mEPSPS. Jumlah protein pada jagung PRG 24 kali protein pada jagung non PRG.
Enzim mEPSPS yang diekspresikan pada E. coli digunakan sebagai reference material dalam banyak percobaan. Enzim ini dibandingkan dengan enzim yang diekspresikan pada jagung PRG. Kesetaraan diperlihatkan oleh data berat molekul yang sama yaitu 47,4 kDa. Selain itu ditunjukkan dengan reaksi silang imunologis dengan antibodi mEPSPS yang sama. Pada kedua protein juga tidak terjadi reaksi glikosilasi pasca translasi. Kedua protein menunjukkan sekuen asam amino N-terminal yang sama. Dengan demikian protein mEPSPS dari E. coli rekombinan setara dengan protein mEPSPS dari jagung PRG. Pengujian dengan protein E. coli dapat dijadikan acuan dalam menyimpulkan uji serupa bagi protein yang diproduksi pada tanaman jagung.
Homologi sekuen asam amino dianalisis dengan memasukkan putative ORF protein sebagai query. Program bio-informatik yang digunakan adalah BLASTP dan program Shuffle Protein. Entry dibandingkan dengan SWISS-PROT Allergen Database (SWISS-PROT, 2001), List of Allergens Database (International Union of Immunological Societies, 2001), FARRP Protein Allergen Database (Food Allergy Research and Resource Program, 2001) dan National Center for Biotechnology Information (NCBI) Entrez Protein Database (NCBI, 2005). Hasilnya menunjukkan tidak ada homologi dengan sekuen toksin atau alergen pada database.
Uji bioinformatik dan homologi sekuen asam amino protein mEPSPS dengan sekuen asam amino alergen yang diperoleh dari SBI Allergen Database menunjukkan tidak homolog. Pengujian juga dilakukan dengan menggunakan piranti FASTA search algorithm untuk mencari identitas > 35% pada peptida 80 asam amino dan mencari 8 asam amino berurutan yang biasa dijumpai pada sekuen alergen (lokasi yang dapat mengikat IgE). Pencarian tersebut juga menunjukkan hasil negatif.
Uji daya cerna protein in vitro telah dilakukan terhadap protein mEPSPS dari jagung PRG event GA21 dan hasilnya dilaporkan sebagai company report (Amended Report No 1, Replaces Original Report Issued June 10, 2005. Study No. GA21-04-04. Report No.SSB-007-05 A1, berjudul “In vitro Digestibility of Double-Mutated Maize 5-Enol Pyruvylshiki-mate-3-Phosphate Synthase (mEPSPS) Test Substances
GA21-0104 and IAPGA21-0105 under Simulated Mammalian Gastric Conditions” oleh Gerson Graser). Penelitian dilaksanakan dari tanggal 7 Januari 2005 sampai tanggal 29 November 2005 di Syngenta Biotechnology, Inc., Regulatory Science & Product Support, 3054 East Cornwallis Road, Post Office Box 12257, Research Triangle Park, North Carolina, USA 27709-2257.
Pengujian ini dilakukan untuk menguji kepekaan protein (enzim) mEPSPS terhadap degradasi proteolitik dalam simulated mammalian gastric fluid (SGF) yang mengandung enzim pepsin. Protein mEPSPS yang digunakan diperoleh dari dua sumber, yaitu jagung PRG event GA21 dan Escherichia coli rekombinan.
Hasil analisis menunjukkan tidak ada protein mEPSPS, baik yang berasal dari jagung maupun bakteri, yang utuh (intact) setelah dicerna oleh enzim pepsin selama 1 menit, yang dievaluasi dengan SDS-PAGE dan analisis Western blot. Setelah dicerna oleh enzim pepsin selama 5 menit, tidak terdapat lagi fragmen mEPSPS dari kedua sumber tersebut.
Pengujian ini menyimpulkan bahwa protein mEPSPS yang diekspresikan pada jagung PRG event GA21 dapat segera dicerna oleh enzim pepsin dalam lambung mamalia seperti halnya protein jagung non PRG.
Studi pengaruh suhu terhadap protein mEPSPS menggunakan ELISA menunjukkan protein ini terdenaturasi sempurna (kehilangan imunoreaktifitas) pada suhu 65°C dan 90°C, walaupun pada suhu 25°C dan 37°C protein ini stabil sampai 30 menit inkubasi.
Keberadaan fragmen mEPSPS berukuran 10 kDa atau yang lebih kecil, dianalisis dari data SDS-PAGE dan Western blot menggunakan 6 jenis antibodi mEPSPS poliklonal asal kelinci dan kambing. Data Western blot meyakinkan tidak adanya fragmen kecil mEPSPS yang berpotensi alergenik.
Dari hasil pengkajian alergenisitas dapat disimpulkan bahwa protein mEPSPS tidak menunjukkan adanya potensi dapat menimbulkan alergi.
III.3 Toksisitas
Pengujian toksisitas dilakukan melalui studi toksisitas akut pada mencit. Selain itu dilakukan juga studi pakan pada ayam broiler.
III.3.1 Studi Toksisitas Akut pada Mencit
Uji toksisitas akut terhadap protein mEPSPS dari jagung PRG event GA21 telah dilakukan pada mencit, dan hasilnya dilaporkan sebagai company report (CTL/AM7513/REGULATORY REPORT, Issued 02 June 2005) dengan judul “GA21-0104: Single Dose Oral Toxicity Study in the Mouse” oleh E. Barnes. Penelitian dilaksanakan dari tanggal 17 Januari 2005 sampai tanggal 2 Juni 2005 (study completion date) di Central Toxicology Laboratory, Alderley Park Macclesfield, Cheshire, UK.
Pengujian menggunakan mencit strain Alpk:APfCD-1 yang berumur 8-12 minggu.
Mencit dibagi dalam dua grup yaitu grup kontrol (tanpa diberi protein mEPSPS) dan grup perlakuan (diberi protein mEPSPS dengan dosis 2000 mg/kg berat badan, dilakukan secara oral dengan gavage pada dosis 2 ml per 100 g). Jumlah mencit per grup masing-masing 5 mencit jantan dan 5 mencit betina.
Pada hari kedua percobaan terdapat satu ekor mencit yang mati dari grup perlakuan. Pengamatan post mortem menunjukkan terdapatnya senyawa berwarna putih dalam paru-parunya. Disimpulkan bahwa kematian tersebut bukan disebabkan karena
toksisitas protein yang diuji melainkan karena kesalahan memasukkan bahan percobaan secara oral, yang ternyata masuk ke saluran tenggorokan dan akhirnya ke paru-paru.
Analisis pengujian menghasilkan bahwa tidak terdapat perbedaan yang nyata dalam hal berat badan, konsumsi ransum, parameter hematologi dan berat organ dalam di antara kedua grup maupun di antara jenis kelamin yang berbeda.
Pengamatan makroskopik terhadap organ dalam tidak menunjukkan adanya perbedaan yang nyata diantara kedua grup, demikian pula pengamatan mikroskopik. Pengujian ini menyimpulkan bahwa protein mEPSPS yang diekspresikan pada jagung PRG event GA21 termasuk dalam golongan zat yang dianggap tidak toksik.
III.3.2 Studi Pakan pada Ayam Broiler
Studi pakan telah dilakukan untuk menguji apakah bahan pakan dari jagung PRG event GA21 memberikan pengaruh negatif pada ayam broiler, dibandingkan dengan jagung non PRG sebagai kontrol. Hasilnya dilaporkan sebagai company report yaitu Evaluation of Event GA21 Transgenic Maize (Corn) in Broiler Chickens oleh John T. Brake. Penelitian dilaksanakan dari tanggal 23 November 2004 sampai dengan tanggal 10 Januari 2005 (49 hari) dan dilaporkan pada tanggal (study completion date) 24 Juni 2005 di Department of Poultry Science, North Carolina State University, Chicken Education Unit, Lake Wheeler Road Field Laboratory, 4108 Lake Wheeler Road, Raleigh, North Carolina, USA.
Pengujian menggunakan ayam Ross 344 jantan dan Ross 308 betina, berjumlah 1200 ekor ayam, yang dibagi ke dalam 48 kelompok (25 ekor per kelompok, dengan jenis kelamin yang sama). Pakan dan air diberikan secara ad libitum, pakan diformulasi mengandung jagung PRG event GA21 (pakan yang diuji) dan jagung non PRG (sebagai kontrol).
Percobaan dilakukan selama 49 hari dan pengamatan dilakukan pada hari 1, ke-21, ke-35 dan ke-49. Hasil percobaan menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata antara jagung PRG event GA21 dengan jagung non PRG dalam hal berat badan dan konsumsi ransum.
Pengujian ini menyimpulkan bahwa jagung PRG event GA21 tidak menunjukkan efek toksik terhadap ayam broiler.
Dari hasil pengkajian toksisitas dapat disimpulkan bahwa protein mEPSPS termasuk dalam golongan zat yang dianggap tidak toksik.
IV. Kesimpulan
Atas dasar beberapa uraian tentang informasi genetik dari gen mEPSPS yang disisipkan dalam Jagung PRG event GA21; analisis kesepadanan substansial antara komposisi Jagung PRG event GA21 dengan jagung non PRG; serta alergenisitas dan toksisitas dari protein mEPSPS, maka dapat disimpulkan bahwa jagung PRG event GA21 dapat dinyatakan aman untuk dikonsumsi sebagai bahan pangan.
