AKTIVITAS PENGHAMBATAN Bacillus sp. TERHADAP Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Pseudomonas syringae pv. glycines, DAN Pseudomonas fluorescens

(1)

AKTIVITAS PENGHAMBATAN Bacillus sp. TERHADAP

Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Pseudomonas syringae pv. glycines,

DAN Pseudomonas fluorescens

KARTIKA FINDY

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2009

(2)

ABSTRAK

KARTIKA FINDY. Aktivitas Penghambatan Bacillus sp. terhadap

Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Pseudomonas syringae pv. glycines, dan

Pseudomonas fluorescens. Dibimbing oleh IMAN RUSMANA dan ALINA

AKHDIYA.

Penyakit leaf blight yang disebabkan oleh bakteri patogen tanaman X.

oryzae pv. oryzae dan P. syringae pv. glycines dapat mengakibatkan kematian

terhadap tanaman. Pengendalian bakteri patogen tanaman dapat dilakukan dengan

menggunakan agen pengendali hayati seperti P. fluorescens ataupun senyawa

antimikrob. Tujuan dari penelitian ini adalah mempelajari kemampuan

penghambatan dan waktu optimum produksi senyawa antimikrob isolat-isolat

Bacillus sp. terhadap bakteri patogen tanaman X. oryzae pv. oryzae, P. syringae

pv. glycines, dan bakteri biokontrol P. fluorescens. Sebanyak 31 isolat yang

berhasil diisolasi dari tanah hutan diuji aktivitas antimikrobnya terhadap bakteri

uji dengan metode double layer. Sebanyak 13 isolat menunjukkan aktivitas

penghambatan terhadap Staphylococcus aureus, Eschericia coli, dan X. oryzae pv.

oryzae, 8 isolat mampu menghambat P. fluorescens A, 9 isolat mampu

menghambat P. fluorescens B, dan 8 isolat mampu menghambat P. syringae pv.

glycines. Isolat Bacillus sp. F13 memiliki kecepatan penghambatan yang efektif

dan efisiensi terhadap semua bakteri uji dan dibuktikan dengan uji kompetisi

dalam kultur campuran. Spektrum aktivitas penghambatan isolat tersebut luas

karena dapat menghambat bakteri Gram positif dan Gram negatif. Hasil uji

kompetisi dalam kultur campuran menunjukkan isolat tersebut memiliki

penghambatan terutama terhadap P. syringae pv. glycines dan X. oryzae pv.

oryzae dengan persen penghambatan mencapai 100%. Aktivitas senyawa

antimikrob yang dihasilkan oleh isolat Bacillus sp. terhadap bakteri uji dihasilkan

pada fase akhir logaritmik pertumbuha

n.

(3)

ABSTRACT

KARTIKA FINDY. Antimicrobial Activity of

Bacillus

sp. to

Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Pseudomonas syringae pv. glycines, and

Pseudomonas fluorescens. Supervised by IMAN RUSMANA and ALINA

AKHDIYA.

Leaf blight disease caused by bacterial plant pathogen such as X. oryzae pv.

oryzae and P. syringae pv. glycines had deathly effect to plants. The pathogens

can be controlled by biological control using P. fluorescens or antimicrobial

substances. The research studied the inhibition ability and production of

antimicrobial substances produced by Bacillus sp. againts bacterial plant pathogen

such as X. oryzae pv. oryzae, P. syringae pv. glycines, and biological control P.

fluorescens. As many as 31 Bacillus sp. isolates isolated from forest soil was

determined their antimicrobial activity against indicator bacteria using double

layer method. The result showed that 13 isolates was able to inhibit

Staphylococcus aureus, Eschericia coli, and X. oryzae pv. oryzae growth, 8

isolates could inhibit P. fluorescens A growth, 9 isolates could inhibit P.

fluorescens B growth, and 8 isolates could inhibit P. syringae pv. glycines

growth. Bacillus sp. F13 had the fastest inhibition and good efficiency against all

indicator bacteria. Mixed culture competition test showed that this isolate had a

broad spectrum inhibition activity, it was able to inhibit Gram positive and Gram

negative bacteria. The isolate could inhibit growth of P. syringae pv. glycines and

X. oryzae pv. oryzae up to 100%. The antimicrobial substance the isolate was

produced in the late logarithmic growth phase.

(4)

AKTIVITAS PENGHAMBATAN Bacillus sp. TERHADAP

Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Pseudomonas syringae pv. glycines,

DAN Pseudomonas fluorescens

KARTIKA FINDY

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains pada

Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2009

(5)

Judul

:

Aktivitas

Penghambatan Bacillus sp. terhadap Xanthomonas oryzae

pv. oryzae, Pseudomonas syringae pv. glycines, dan Pseudomonas

fluorescens

Nama

:

Kartika

Findy

NRP

:

G34051437

Disetujui

Pembimbing I

Pembimbing II

Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si

Alina Akhdiya, M.Si

NIP. 19650720 199103 1 002

NIP. 080 130 418

Diketahui

Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Institut Pertanian Bogor

Dr. Drh. Hasim, DEA

NIP. 19610328 198601 1 002

(6)

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala nikmat dan

anugerah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah yang berjudul

Aktivitas Penghambatan Bacillus sp. terhadap Xanthomonas oryzae pv. oryzae,

Pseudomonas syringae pv. glycines, dan Pseudomonas fluorescens. Penelitian ini

telah dilaksanakan dari bulan Februari sampai Mei 2009 di Laboratorium

Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan

Alam, Institut Pertanian Bogor.

Terima kasih penulis ucapkan kepada bapak Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si

selaku pembimbing utama dan ibu Alina Akhdiya, M.Si selaku pembimbing

kedua. Ucapan terima kasih penulis juga disampaikan kepada Anggota IR Crew

yaitu Ade Satria, Puji Purwanti, Dina D, Bonardo, dan Nurlia Valestine serta

kepada teman-teman seperjuangan di lababoratorium Mikrobiologi (Amarylis,

Bram, Una, Meli, Yurin, Adi sasono, Hirmas). Terima kasih untuk Ibu Maya, Ibu

Nana, Pak Umar, Mba Emma, Bang Jo yang telah banyak membantu dalam

kegiatan penelitian serta laboran mikrobiologi (Pak Jaka, Mba Heni, dkk). Ucapan

khusus untuk Bambang Padmadi yang selalu memberikan semangat. Dan pihak

lain yang tidak dapat disebutkan satu-persatu terima kasih atas kebersamaannya

selama penelitian dan tidak lupa kepada teman-teman biologi 42 atas kehangatan

dan kekompakannya.

Penghargaan setinggi-tingginya penulis sampaikan kepada kedua orang

tua dan kakak tercinta atas perhatian, kasih sayang dan doanya. Semoga karya

ilmiah ini bermanfaat bagi para pembaca dan bagi ilmu pengetahuan khususnya

bidang Biologi.

Bogor, Agustus 2009

(7)

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Jakarta, DKI Jakarta pada tanggal 20 Desember 1987

dari ayahanda Faisal Anwar dan ibunda Nenden Yulia O. Penulis merupakan anak

ketiga dari tiga bersaudara. Tahun 2005 penulis lulus dari SMU Negeri 12 Jakarta

dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk Institut Pertanian Bogor (IPB)

melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB) pada Program Studi

Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA).

Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah mengikuti kegiatan Praktik

Lapangan di Laboratorium Mikrobiologi Rumah Sakit Islam Jakarta Pondok Kopi

(RSIJPK) selama periode Juli sampai dengan Agustus 2008 dengan judul Deteksi

Penyakit Tuberkulosis Di Laboratorium Klinik Rumah Sakit Islam Jakarta

Pondok Kopi. Disamping itu penulis aktif menjadi pengurus Himpunan

Mahasiswa Biologi (HIMABIO), staf BioWorld periode 2006/2007 dan staf

Wahana Muslim HIMABIO (WMH) periode 2007/2008, asisten praktikum mata

kuliah Biologi Dasar untuk mahasiswa TPB tahun ajaran 2006/2009. Penulis juga

pernah menjadi pengajar “Be Expert” Biologi untuk mahasiswa TPB tahun ajaran

2008.

(8)

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR GAMBAR ... ix

DAFTAR TABEL ... ix

DAFTAR LAMPIRAN ... ix

PENDAHULUAN ... 1

Latar Belakang ... 1

Tujuan...

1 Waktu dan Tempat Penelitian ... 1

BAHAN DAN METODE ... 1

Bahan ... 1

Metode ... 1

Penumbuhan dan Penyimpanan Bakteri ... 1

Seleksi Isolat Bacillus sp. yang Berpotensi Menghambat Pertumbuhan

Bakteri Uji ... 2

Uji Kompetisi ... 2

Waktu Optimum Produksi Senyawa Antimikrob Isolat Bacillus sp. ... 2

HASIL ... 3

Seleksi Isolat Bacillus sp. yang Berpotensi Menghambat Pertumbuhan Bakteri

Uji...

3 Uji Kompetisi... 5

Waktu Optimum Produksi Senyawa antimikrob Isolat Bacillus sp. ... 9

PEMBAHASAN ... 9

SIMPULAN ... 12

SARAN ... 12

DAFTAR PUSTAKA ... 12

(9)

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Zona hambat disekitar 3 koloni isolat Bacillus terpilih terhadap bakteri uji .... 4

2 Persentase penghambatan pertumbuhan bakteri uji oleh isolat Bacillus sp.

A21 pada uji kompetisi ... 6

3 Dinamika populasi bakteri uji pada uji kompetisi dengan isolat Bacillus sp.

A21 ... 6

4 Persentase penghambatan pertumbuhan bakteri uji oleh isolat Bacillus sp.

F13 ... 7

5 Dinamika populasi bakteri uji pada uji kompetisi dengan isolat Bacillus sp.

F13 ... 7

6 Persentase penghambatan pertumbuhan bakteri uji oleh isolat Bacillus sp.

G3 pada uji kompetisi ... 8

7 Dinamika populasi bakteri uji pada uji kompetisi dengan isolat Bacillus sp.

G3 ... 8

8 Aktivitas antimikrob supernatan kultur Bacillus sp. F13 selama inkubasi

terhadap bakteri uji... 9

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Penghambatan pertumbuhan S. aureus dan E. coli oleh isolat Bacillus sp. pada

media NA... 3

2 Penghambatan pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae dan P. syringae pv. glycines

oleh isolat Bacillus sp. pada media TSA ... 4

3 Penghambatan pertumbuhan P. fluorescens A dan B oleh isolat Bacillus sp.

pada media TSA ... 4

4 Indeks Penghambatan pertumbuhan bakteri uji oleh 3 isolat Bacillus sp.

terpilih ... 5

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Aktivitas penghambatan isolat Bacillus sp. terhadap populasi sel bakteri uji

dalam uji kompetisi ... 15

2 Persentase penghambatan isolat Bacillus sp. terhadap bakteri uji ... 16

3 Populasi sel isolat Bacillus sp. dan bakteri uji dalam kontrol positif dan

(10)

x

(11)

PENDAHULUAN Latar Belakang

Xanthomonas oryzae pv. oryzae

dan Pseudomonas syringae pv. glycines merupakan bakteri patogen terhadap tanaman. Kedua bakteri ini menyebabkan

leaf blight, yaitu penyakit busuk daun,

dimana daun mengalami bercak-bercak coklat, menjadi layu dan mati. Penyakit ini menyerang daun padi yang disebabkan oleh

X. oryzae pv. oryzae (Suparyono et al 2003)

dan daun kedelai yang disebabkan oleh P.

syringae pv. glycines (Dirmawati 2005).

Berbagai usaha penanggulangan penyakit ini telah banyak dilakukan, diantaranya dengan menggunakan bahan kimia sintetik (paraben, asam benzoat, nitrit, dan lain-lain) ataupun aplikasi pestisida berbahan dasar senyawa antibiotik (Agrep) (Asman 1996). Pengggunaan antibiotik dan bahan kimia dalam penanganan penyakit tanaman dapat menyebabkan resistensi pada bakteri, menimbulkan residu dan pencemaran lingkungan. Oleh karena itu, perlu adanya alternatif biokontrol seperti aplikasi campuran mikroba pengendali hayati. Agen pengendali hayati yang sudah sering digunakan diantaranya adalah P.

fluorescens dan Bacillus subtilis (Supriadi

2006). Formulasi campuran kedua bakteri tersebut telah diaplikasikan untuk mengendalikan penyakit pustul bakteri kedelai yang disebabkan oleh X. campestris pv. glycines (Dirmawati 2005).

Kemampuan Bacillus dalam

mengendalikan bakteri patogen tanaman disebabkan oleh senyawa antimikrob yang diproduksinya. Menurut Irina et al. (2001), genus Bacillus sp. dapat memproduksi substansi antimikrob berupa bakteriosin dan antibiotik berupa basitrasin. Bakteriosin merupakan senyawa antimikrob polipeptida yang disintesis di ribosom dan biasanya hanya menghambat galur-galur bakteri yang berkerabat dekat dengan bakteri penghasil bakteriosin tersebut (Jack et al. 1995). Sedangkan antibiotik disintesis melalui serangkaian reaksi multi enzim yang dihasilkan selama fase pertumbuhan stasioner (Williams et al 1996).

Beberapa isolat Bacillus sp. koleksi laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA IPB diketahui mampu menghambat pertumbuhan Eschericia coli dan Staphylococcus aureus (Sopyan &

Findy 2007). Kedua bakteri tersebut merupakan bakteri standar uji untuk

menentukan spektrum penghambatan antimikrob terhadap bakteri Gram positif dan Gram negatif. Namun, aktivitas antimikrobnya terhadap patogen tanaman seperti X. oryzae pv. oryzae dan P. syringae pv. glycines, serta uji kompetisi dengan agen biokontrol P. fluorescens belum diketahui.

Tujuan

Penelitian ini bertujuan mempelajari kemampuan penghambatan dan penentuan waktu optimum produksi senyawa antimikrob isolat-isolat Bacillus sp. terhadap bakteri patogen tanaman X. oryzae pv. oryzae, P. syringae pv. glycines, dan agen biokontrol P. fluorescens.

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Februari sampai dengan Mei 2009 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi FMIPA IPB.

BAHAN DAN METODE Bahan

Bakteri yang digunakan pada penelitian ini terdiri dari 13 isolat Bacillus sp., 2 bakteri standar uji aktivitas antimikrob (E. coli dan S. aureus), 2 bakteri patogen tanaman (X. oryzae pv. oryzae dan P.

syringae pv. glycines) dan 2 isolat P. fluorescens (isolat A dan B). Isolat-isolat Bacillus tersebut diisolasi dari dari tanah

Wanawisata Cangkuang Sukabumi pada kegiatan Studi Lapangan jurusan Biologi pada tahun 2007. Semua isolat Bacillus sp.,

E. coli dan S. aureus merupakan bakteri

koleksi dari Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA IPB. Sedangkan 4 bakteri lainnya diperoleh dari Laboratorium Fitopatologi, Balai Besar-Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian (BB-BIOGEN).

Media nutrisi yang digunakan untuk pertumbuhan bakteri ialah Trypticase

Soy Broth (TSB 30 g/l), Nutrient Agar (NA:

8 g/l NB, agar-agar 20 g/l), Trypticase Soy

Agar (TSA: 30 g/l TSB, 20 g/l agar-agar),

serta NA dan TSA semipadat yang dibuat dengan kandungan agar-agar 10 g/l.

Metode

Penumbuhan dan Penyimpanan Bakteri

Isolat Bacillus sp. ditumbuhkan dan diremajakan pada media NA dan diinkubasi pada suhu ruang (29-31 ºC) selama dua hari.

(12)

2

Sedangkan bakteri uji ditumbuhkan pada media TSA atau TSB lalu diinkubasi pada suhu ruang (29-31 ºC) selama tiga hari. Stok kultur bakteri disimpan dalam refigerator pada suhu (6-8 ºC) pada media yang sama.

Seleksi Isolat Bacillus sp. yang Berpotensi Menghambat Pertumbuhan Bakteri Uji

Seleksi isolat Bacillus sp. dilakukan dengan uji antagonis terhadap 2 bakteri yang menjadi standar uji senyawa antimikroba (E.

coli, S. aureus), 2 bakteri patogen tanaman

(X. oryzae pv. oryzae, dan P. syringae pv.

glycines), dan 2 isolat biokontrol (P. Flourescens A dan B). Uji dilakukan menggunakan metode double layer (Lisboa

et al. 2006). Metode ini memungkinkan

senyawa antimikrob yang dihasilkan dapat berfusi dengan baik pada media semipadat sehingga didapat zona bening yang terlihat jelas. Zona bening tersebut merupakan bagian media yang tidak dapat ditumbuhi oleh bakteri uji karena adanya difusi senyawa antimikrob yang dihasilkan oleh

Bacillus sp.

Sebanyak 500 µl (107cfu/ml) kultur cair bakteri uji diinokulasikan ke dalam 50 ml TSA semipadat lalu dituang pada permukaan cawan TSA padat masing-masing sebanyak 10 ml. Setelah permukaan media TSA double layer memadat, isolat

Bacillus sp. yang berumur dua hari ditotolkan dengan menggunakan tusuk gigi steril lalu diinkubasi pada suhu 30 ºC. Pengamatan dan pengukuran zona bening dilakukan setelah 48 jam untuk uji terhadap

E. coli dan S. aureus. Sedangkan

pengamatan untuk uji terhadap 4 bakteri uji lainnya dilakukan setelah 72 jam inkubasi. Indeks penghambatan dihitung dengan cara sebagai berikut:

Ø zona bening – Ø koloni

Keterangan:

Ø zona bening = diameter zona bening (cm)

Ø koloni = diameter koloni (cm) Isolat-isolat yang memiliki nilai IP besar terhadap X. oryzae pv. oryzae dipilih untuk uji selanjutnya.

Uji Kompetisi

Uji kompetisi dilakukan dengan cara menumbuhkan masing-masing bakteri uji (X. oryzae pv. oryzae, P. syringae pv.

glycines, dan P. fluorescens) dan isolat Bacillus terpilih dalam satu kultur cair TSB.

Setiap pasang bakteri uji dan isolat Bacillus sp. dibuat satu seri uji kompetisi terdiri dari 4 Erlenmeyer yang diberi nomor II-V. Sebagai kontrol negatif digunakan Erlenmeyer yang diberi nomor I, sedangkan kontrol positif dibuat pada Erlenmeyer bernomor VI. Untuk setiap bakteri uji dibuat satu kontrol negatif. Demikian pula untuk setiap isolat Bacillus sp. dibuat satu kontrol positif.

Sebanyak 100 µl (107 cfu/ml) kultur bakteri uji diinokulasikan ke dalam Erlenmeyer berisi 50 ml media TSB. Pada Erlenmeyer II, III, IV, V masing-masing ditambahkan 100, 200, 400, dan 1000 µl kultur Bacillus sp. umur 48 jam sehingga diperoleh kultur campuran dengan rasio antara masing-masing bakteri uji dan

Bacillus sp. 1:1, 1:2, 1:4, dan 1:10 (v/v).

Kontrol negatif (I) dibuat dengan menginokulasi media yang sama dengan 100 µl bakteri uji, sedangkan untuk kontrol positif (VI) media diinokulasi dengan 100 µl

Bacillus sp.. Semua kultur tersebut diinkubasi sampai 72 jam pada suhu ruang. Pada umur 24, 48, dan 72 jam dilakukan pengambilan sampel sebanyak 0.1 ml untuk dihitung populasi sel Bacillus sp. dan bakteri uji. Penghitungan populasi sel masing-masing bakteri dilakukan dengan metode cawan sebar pada media TSA. Persentase penghambatan dihitung dengan cara sebagai berikut:

% Penghambatan = A–B x 100% A

Keterangan:

A = Populasi sel bakteri uji pada kontrol B = Populasi sel bakteri uji pada perlakuan

Waktu Optimum Produksi Senyawa Antimikrob Isolat Bacillus sp.

Sebanyak satu ose biakan Bacillus sp. diinokulasikan ke dalam 50 ml media TSB lalu diinkubasikan pada suhu ruang sambil dikocok pada kecepatan 94 rpm. Setelah 6 jam, diambil 2 ml kultur untuk diinokulasikan ke dalam 200 ml media TSB yang baru, lalu diinkubasi selama 72 jam. Setiap 12 jam dilakukan pengambilan kultur hingga inkubasi ke 72 jam. Kultur tersebut diambil 6.5 ml untuk pengukuran OD600 sebanyak 5 ml dan sisanya digunakan untuk uji aktivitas antimikrob yang terkandung dalam supernatan. Pemisahan supernatan dan massa sel dilakukan dengan cara

Ø zona koloni

(13)

3

sentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 10 menit. Sebanyak 30 µl supernatan diteteskan pada kertas cakram (d=6 mm) steril lalu dibiarkan kering udara. Kertas cakram yang telah kering diletakkan pada permukaan cawan TSA double layer yang telah diinokulasi dengan bakteri uji. Kemudian cawan-cawan tersebut diinkubasi pada suhu 30 °C. Setelah 72 jam dilakukan pengukuran diameter zona bening yang terbentuk di sekitar kertas cakram.

HASIL

Seleksi Isolat Bacillus sp. yang Berpotensi Menghambat Pertumbuhan Bakteri Uji

Seleksi untuk mengetahui potensi daya hambat isolat-isolat Bacillus sp. dilakukan dengan cara uji antagonis terhadap bakteri uji yaitu, S. aureus, E. coli,

X. oryzae pv. oryzae, P. syringae pv. glycines, dan P. fluorescens (A dan B).

Hasil seleksi menunjukkan 13 isolat mampu menghambat S. aureus, E.

coli, dan X. oryzae pv. oryzae. E. coli dan S. aureus merupakan bakteri standar untuk

pengujian aktivitas antimikrob. Penggunaan kedua bakteri tersebut bertujuan mengetahui spektrum aktivitas antimikrob Bacillus sp. yang diseleksi. Hasil uji terhadap kedua bakteri tersebut menunjukkan bahwa spektrum aktivitas antimikrob Bacillus

tersebut meliputi bakteri Gram positif (S.

aureus) dan Gram negatif (E. coli). Isolat Bacillus sp. F14 memiliki daya hambat

paling kuat terhadap S. aureus dengan IP 2.50. Sedangkan E. coli dihambat dengan kuat oleh isolat Bacillus sp. G2 dengan IP 5.00 (Tabel 1). Isolat Bacillus sp. F13 menghambat paling kuat terhadap X. oryzae pv. oryzae dengan IP 2.33 (Tabel 2). Dari 13 isolat Bacillus tersebut, 8 isolat mampu menghambat P. syringae pv. glycines (Tabel 2), 8 isolat mampu menghambat P. fluorescens A dan 9 isolat mampu menghambat P. fluorescens B (Tabel 3).

Untuk uji selanjutnya dipilih 3 isolat yang memiliki Indeks Penghambatan (IP) paling tinggi terhadap X. oryzae pv.

oryzae. Ketiga isolat tersebut adalah isolat

A21, F13, dan G3 (Gambar 1). Isolat

Bacillus sp. A21 mampu menghambat X. oryzae pv. oryzae, P. syringae pv. glycines,

dan P. fluorescens A dan B dengan IP berturut-turut 2.00, 2.33, 4.00 dan 1.00. Isolat Bacillus sp. F13 mampu menghambat

X. oryzae pv. oryzae, P. syringae pv. glycines, dan P. fluorescens A dan B dengan

IP berturut-turut 2.33, 0.50, 1.00 dan 1.00. Isolat Bacillus sp. G3 mampu menghambat

X. oryzae pv. oryzae, P. syringae pv. glycines, dan P. fluorescens B dengan IP

berturut-turut 2.00, 0.30, dan 1.00 (Tabel 4).

Tabel 1 Penghambatan pertumbuhan S. aureus dan E. coli oleh isolat Bacillus sp. pada media NA Isolat S. aureus

1 _{E. coli}1

Ø koloni (cm) Ø zona bening (cm) IP ± SE Ø koloni (cm) Ø zona bening (cm) IP ± SE A11 0.50 0.80 0.60 ± 0.26 0.20 0.60 2.00 ± 0.47 A12 0.30 0.60 1.00 ± 0.24 0.30 1.00 2.33 ± 0.59 A13 0.30 0.80 1.67 ± 0.53 0.40 0.80 1.00 ± 0.09 A14 0.40 0.60 0.50 ± 0.18 0.40 0.60 0.50 ± 0.18 A21 0.30 0.80 1.67 ± 0.59 0.40 1.30 2.25 ± 0.71 A22 0.30 0.80 1.67 ± 0.59 0.30 1.00 2.33 ± 0.74 A23 0.40 0.80 1.00 ± 0.35 0.40 0.50 0.25 ± 0.44 F12 0.20 0.40 1.00 ± 0 0.20 0.40 1.00 ± 0.35 F13 0.10 0.20 1.00 ± 0 0.20 0.60 2.00 ± 0.71 F14 0.40 1.40 2.50 ± 0 0.50 0.60 0.20 ± 0.05 G2 0.50 0.80 0.60 ± 0.12 0.20 1.20 5.00 ± 0 G3 0.80 1.00 0.25 ± 0.27 0.20 0.30 0.50 ± 0 G4 0.70 1.00 0.43 ± 0.15 0.30 0.60 1.00 ± 0.35

keterangan: IP = Indeks Penghambatan; SE = standar eror (nilai rataan ± SE, n = 2); 1 = Inkubasi selama 2 hari

(14)

4

(a) (b) (c)

Gambar 1 Zona hambat disekitar 3 koloni isolat Bacillus terpilih terhadap bakteri uji (a) X. oryzae pv. oryzae, (b) P. syringae pv. glycines dan (c) P. fluorescens B.

Tabel 2 Penghambatan pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae dan P. syringae pv. glycines oleh isolat

Bacillus sp. pada media TSA

Isolat X. oryzae pv. oryzae

2 _{P. syringae pv. glycines}2

Ø koloni (cm) Ø zona bening (cm) IP ± SE Ø koloni (cm) Ø zona bening (cm) IP ± SE A11 0.30 0.70 1.33 ± 0.17 0.25 0.70 1.80 ± 0 A12 0.30 0.50 0.67 ± 0.06 0.20 0.30 0.33 ± 0.01 A13 0.40 0.60 0.50 ± 0.18 0.20 0.60 2.00 ± 0.12 A14 0.40 0.50 0.25 ± 0.44 - - -A21 0.30 0.90 2.00 ± 0.35 0.30 1.00 2.33 ± 0.29 A22 0.20 0.50 1.50 ± 0.49 - - -A23 0.30 0.30 1.00 ± 0.23 - - -F12 0.30 0.60 1.00 ± 0.12 0.30 0.50 0.67 ± 0.24 F13 0.30 1.00 2.33 ± 0.27 0.20 0.30 0.50 ± 0.18 F14 0.20 0.35 0.75 ± 0 0.20 0.50 1.50 ± 0.53 G2 0.30 0.40 0.33 ± 0.94 - - -G3 0.30 0.90 2.00 ± 0.47 0.30 0.40 0.30 ± 0.01 G4 0.20 0.50 1.50 ± 1.41 - -

-keterangan: IP = Indeks Penghambatan; (-) = tidak ada penghambatan; SE = standar eror (nilai rataan ± SE, n = 2);2 = Inkubasi selama 3 hari

Tabel 3 Penghambatan pertumbuhan P. fluorescens A dan B oleh isolat Bacillus sp. pada media TSA

Isolat P. fluorescens A

2 _{P. fluorescens B}2

Ø koloni (cm) Ø zona bening (cm) IP ± SE Ø koloni (cm) Ø zona bening (cm) IP ± SE

A11 - - - 0.40 0.60 0.50 ± 0.18 A12 - - - 0.40 0.70 0.75 ± 0.09 A13 - - - 0.30 0.70 1.33 ± 0.12 A14 0.20 0.40 1.00 ± 0.01 0.30 0.60 1.00 ± 0.18 A21 0.20 1.00 4.00 ± 0 0.30 1.00 1.00 ± 0 A22 - - - -A23 0.70 1.00 0.43 ± 0 - - -F12 0.20 0.40 1.00 ± 0.02 - - -F13 0.20 0.40 1.00 ± 0 0.30 0.60 1.00 ± 0 F14 0.30 0.40 0.33 ± 0.01 0.20 0.30 0.50 ± 0.18 G2 0.80 0.90 0.13 ± 0 0.30 0.80 1.67 ± 0.12 G3 - - - 0.30 0.60 1.00 ± 0.09 G4 0.40 0.60 0.50 ± 0.01 - -

-keterangan: IP = Indeks Penghambatan; (-) = tidak ada penghambatan; SE = standar eror (nilai rataan ± SE, n = 2); 2 = Inkubasi selama 3 hari

G3 G3 G3 A21 A21 A21 F13 F13 F13

(15)

5

Tabel 4 Indeks Penghambatan pertumbuhan bakteri uji oleh 3 isolat Bacillus sp. terpilih Isolat S. aureus1 _E._coli1 _X._{oryzae pv. oryzae}2_P._{syringae pv. glycines}2 _P._{fluorescens B}2

A21 1.67 2.25 2 2.33 4.00

F13 1.00 1.00 2.33 0.50 1.00

G3 0.25 0.50 2.00 0.30 1.00

keterangan:1= Inkubasi selama 2 hari;2 = Inkubasi selama 3 hari

Uji Kompetisi

Uji kompetisi isolat Bacillus sp. terpilih A21, F13, dan G3 terhadap tiga bakteri uji (X. oryzae pv. oryzae, P. syringae pv. glycines, dan P. fluorescens B) dalam kultur campuran menunjukkan bahwa ketiga isolat Bacillus sp. tersebut mampu menghambat bakteri uji dengan daya hambat yang berbeda-beda. Hal ini terlihat dari populasi sel bakteri uji pada Erlenmeyer II, III, IV, dan V lebih rendah dibandingkan kontrol negatifnya (bakteri uji tanpa isolat

Bacillus sp.) (Lampiran 1).

Isolat Bacillus sp. A21 mampu menghambat bakteri uji pada setiap rasio inokulum dengan persen penghambatan di atas 85%. Daya hambat isolat Bacillus sp. A21 terhadap X. oryzae pv. oryzae paling kuat saat rasio inokulum 1:2. Dalam waktu 24 jam populasi sel X. oryzae pv. oryzae berkurang 97.17% (Gambar 2b) dan pada akhir pengamatan (72 jam) populasi sel X.

oryzae pv. oryzae sudah tidak terdeteksi

(Gambar 3a). Hasil uji kompetisi Bacillus sp. A21 terhadap P. syringae pv. glycines menunjukkan perbedaan rasio inokulum tidak berbeda nyata terhadap aktivitas penghambatan. Persen penghambatannya mencapai 100% untuk setiap rasio inokulum sampai akhir pengamatan (Gambar 3b). Daya hambat isolat Bacillus sp. A21 terhadap P. fluorescens B paling kuat saat rasio inokulum 1:1. Dalam waktu 24 jam populasi sel P. fluorescens B berkurang 96.39% (Gambar 2a) dan pada akhir pengamatan (72 jam) populasi sel P. fluorescens B berkurang sebesar 97.73%

(Gambar 3c). Diantara ketiga bakteri uji tersebut, isolat Bacillus sp. A21 mampu menghambat P. syringae pv. glycines paling kuat dibandingkan dengan bakteri uji lainnya pada setiap rasio inokulum.

Isolat Bacillus sp. F13 mampu menghambat bakteri uji pada setiap rasio inokulum dengan persen penghambatan di atas 85%. Daya hambat isolat Bacillus sp. F13 terhadap X. oryzae pv. oryzae paling

kuat saat rasio inokulum 1:4. Dalam waktu 24 jam populasi sel X. oryzae pv. oryzae berkurang 99.62% (Gambar 4c). Namun, saat inkubasi 48 dan 72 jam populasi sel X.

oryzae pv. oryzae mengalami peningkatan

untuk setiap rasio inokulum (Gambar 5a). Hasil uji kompetisi Bacillus sp. F13 terhadap

P. syringae pv. glycines menunjukkan perbedaan rasio inokulum tidak berbeda nyata terhadap aktivitas penghambatan (Gambar 5b). Daya hambat isolat Bacillus sp. F13 terhadap P. fluorescens B paling kuat saat rasio inokulum 1:10 dengan persen penghambatan mencapai 100% (Gambar 4d). Dalam waktu 24 jam populasi sel P.

flourescens B sudah tidak terdeteksi. Namun,

ketika inkubasi ke 48 dan 72 jam, populasi sel P. fluorescens B meningkat untuk setiap rasio inokulum (Gambar 5c). Diantara ketiga bakteri uji tersebut, isolat Bacillus sp. F13 mampu menghambat P. syringae pv.

glycines paling kuat dibandingkan dengan

bakteri uji lainnya pada setiap rasio inokulum.

Isolat Bacillus sp. G3 dapat menghambat bakteri uji pada setiap rasio inokulum dengan persen penghambatan di atas 85%. Daya hambat isolat Bacillus sp. G3 terhadap X. oryzae pv. oryzae paling kuat saat rasio inokulum 1:1 (Gambar 6a). Pada setiap inkubasi populasi sel X. oryzae pv. oryzae berkurang 98.30% (Gambar 7a). Hasil uji kompetisi isolat Bacillus sp. G3 terhadap P. syringae pv. glycines

menunjukkan perbedaan rasio inokulum tidak berbeda nyata terhadap aktivitas penghambatan (Gambar 7b). Daya hambat isolat Bacillus sp. G3 terhadap P. fluorescens B paling kuat saat rasio inokulum 1:2. Persen penghambatannya sebesar 96.99% pada setiap waktu inkubasi (Gambar 6b). Diantara ketiga bakteri uji tersebut, isolat Bacillus sp. G3 mampu menghambat P. syringae pv. glycines paling kuat dibandingkan dengan bakteri uji lainnya pada setiap rasio inokulum.

(16)

6

80 85 90 95 100 24 48 72

Waktu Inkubasi (jam)

P e ng ha m ba ta n (% )

A21+Xanthomonas oryzae pv oryzae A21+Pseudomonas syringae pv glycines A21+Pseudomonas fluorescens B (a) 80 85 90 95 100 24 48 72

Penghamba

tan

(%

)

A21+Xanthomonas oryzae pv oryzae A21+Pseudomonas syringae pv glycines A21+Pseudomonas flourescens B (b) 80 85 90 95 100 24 48 72

Pe ng ha mb a ta n (% )

A21+Xanthomonas oryzae pv oryzae A21+Pseudomonas syringae pv glycines A21+Pseudomonas fluorescens B (c) 80 85 90 95 100 24 48 72

Pe ng ha mba ta n (% )

A21+Xanthomonas oryzae pv oryzae A21+Pseudomonas syringae pv glycines A21+Pseudomonas fluorescens B

(d)

Gambar 2 Persentase penghambatan pertumbuhan bakteri uji oleh isolat Bacillus sp. A21 pada uji kompetisi dengan rasio inokulum (a) 1:1, (b) 1:2, (c) 1:4, dan (d) 1:10. (data menunjukkan nilai rataan ± SE, n = 2). 0 2 4 6 8 0 12 24 36 48 60 72

P o pul a si se l (x10 9 cf u /ml) 1:1 1:2 1:4 1:10 (a) 0 2 4 6 8 0 12 24 36 48 60 72

Pop ul a si sel (x10 9 cf u /m l) 1:1 1:2 1:4 1:10 (b) 0 2 4 6 8 0 12 24 36 48 60 72

P op u las i sel (x10 9 cf u /ml) 1:1 1:2 1:4 1:10 (c)

Gambar 3 Dinamika populasi (a) X. oryzae pv. oryzae, (b) P. syringae pv.

glycines, dan (c) P. fluorescens B

pada uji kompetisi dengan isolat

Bacillus sp. A21. (data menunjukkan nilai rataan ± SE, n = 2).

(17)

7

80 85 90 95 100 24 48 72

Pe ng a ha mb a ta n (%)

F13+Xanthomonas oryzae pv oryzae F13+Pseudomonas syringae pv glycines F13+Pseudomonas fluorescens B (a) 80 85 90 95 100 24 48 72

Penghambatan

(%

)

F13+Xanthomonas oryzae pv oryzae F13+Pseudomonas syringae pv glycines F13+Pseudomonas fluorescens B (b) 80 85 90 95 100 24 48 72

Waktu Inkubas i (jam)

Pe ng ha mba ta n (% )

F13+Xanthomonas oryzae pv oryzae F13+Pseudomonas syringae pv glycines F13 +Pseudomonas fluorescens B (c) 80 85 90 95 100 24 48 72

Pe ng h a m ba ta n ( % )

F13+Xanthomonas oryzae pv oryzae F13+Pseudomonas syringae pv glycines F13+Pseudomonas fluorescens B

(d)

Gambar 4 Persentase penghambatan pertumbuhan bakteri uji oleh isolat Bacillus sp. F13 pada uji kompetisi dengan rasio inokulum (a) 1:1, (b) 1:2, (c) 1:4, dan (d) 1:10. (data menunjukkan nilai rataan ± SE, n = 2). 0 2 4 6 8 0 12 24 36 48 60 72

Pop ulasi se l (x10 9 cf u /ml) 1:1 1:2 1:4 1:10 (a) 0 2 4 6 8 0 12 24 36 48 60 72

Po p u la si sel (x10 9 cf u /ml) 1:1 1:2 1:4 1:10 (b) 0 2 4 6 8 0 12 24 36 48 60 72

Pop u lasi sel (x10 9 cf u /m l) 1:1 1:2 1:4 1:10 (c)

Bacillus sp. F13. (data menunjukkan nilai rataan ± SE, n = 2).

(18)

8

80 85 90 95 100 24 48 72

P en g ha m ba ta n (%)

G3+Xanthomonas oryzae pv oryzae G3+Pseudomonas syringae pv glycines G3+Pseudomonas fluorescens B (a) 80 85 90 95 100 24 48 72

P enghambat a n (% )

G3+Xanthomonas oryzae pv oryzae G3+Pseudomonas syringae pv glycines G3+Pseudomonas fluorescens B (b) 80 85 90 95 100 24 48 72

Pe ng ha mba ta n (% )

G3+Xanthomonas oryzae pv oryzae G3+Pseudomonas syringae pv glycines G3+Pseudomonas fluorescens B (c) 80 85 90 95 100 24 48 72

Peng

h

a

mba

tan (% )

G3+Xanthomonas oryzae pv oryzae G3+Pseudomonas syringae pv glycines G3+Pseudomonas fluorescens B

(d)

Gambar 6 Persentase penghambatan pertumbuhan bakteri uji oleh isolat Bacillus sp. G3 pada uji kompetisi dengan rasio inokulum (a) 1:1, (b) 1:2, (c) 1:4, dan (d) 1:10. (data menunjukkan nilai rataan ± SE, n = 2). 0 2 4 6 8 0 12 24 36 48 60 72

Po p u lasi sel (x10 9 cf u/m l) 1:1 1:2 1:4 1:10 (a) 0 2 4 6 8 0 12 24 36 48 60 72

Popu la si sel (x10 9 c fu/ m l) 1:1 1:2 1:4 1:10 (b) 0 2 4 6 8 0 12 24 36 48 60 72

Po pu la si sel (x 10 9 cf u /ml) 1:1 1:2 1:4 1:10 (c)

Bacillus sp. G3. (data menunjukkan nilai rataan ± SE, n = 2).

(19)

9

Waktu Optimum Produksi Senyawa antimikrob Isolat Bacillus sp.

Optimasi waktu produksi antimikrob dilakukan terhadap 3 isolat

Bacillus sp. terpilih yaitu, A21, F13, dan G3.

Hasil uji aktivitas antimikob supernatan kultur menunjukkan hanya supernatan

Bacillus sp. F13 yang membentuk zona

bening pada uji tersebut.

Plot nilai OD600 dan diameter zona bening terhadap waktu inkubasi, menghasilkan kurva produksi senyawa antimikrob selama pertumbuhan Bacillus sp. F13 (Gambar 8).

Pengujian aktivitas antimikrob supernatan Bacillus sp. F13 terhadap X.

oryzae pv. oryzae menunjukkan bahwa

diameter zona bening terbesar (d=0.38 cm) dihasilkan dari kultur yang diambil pada umur 12 jam yaitu, ketika kultur berada pada akhir fase logaritmik. Zona bening yang paling luas menunjukkan waktu produksi senyawa antimikrob yang optimum. Diameter zona bening semakin mengecil ketika kultur berada pada awal fase stasioner (12-48 jam inkubasi). Aktivitas penghambatan sama sekali tidak terdeteksi (d=0 cm) pada pengamatan berikutnya (Gambar 8a).

Pengujian aktivitas antimikrob supernatan Bacillus sp. F13 terhadap P.

syringae pv. glycines menunjukkan bahwa

diameter zona bening terbesar (d= 0.38 cm) dihasilkan dari kultur yang diambil pada umur 12 jam yaitu, ketika kultur berada pada akhir fase logaritmik. Aktivitas penghambatan sama sekali tidak terdeteksi (d=0 cm) pada pengamatan berikutnya (Gambar 8b).

Pengujian aktivitas antimikrob supernatan Bacillus sp. F13 terhadap P.

fluorescens B menunjukkan bahwa diameter

zona bening terbesar (d=0.06 cm) dihasilkan dari kultur yang diambil pada umur 12 jam yaitu, ketika kultur berada pada akhir fase logaritmik. Diameter zona bening tidak mengalami perubahan ketika kultur berada pada awal fase stasioner (12-48 jam inkubasi) d=0.6 cm. Aktivitas penghambatan sama sekali tidak terdeteksi (d=0 cm) pada pengamatan berikutnya (Gambar 8c).

0 0.5 1 1.5 2 0 12 24 36 48 60 72 Waktu Inkubas i (jam)

Lo g p o p u la si se l (c fu /ml ) 0 0.25 0.5 0.75 1 d iam et e r zon a ha mba t (cm )

Log populasi sel diameter zona hambat

(a) 0 0.5 1 1.5 2 0 12 24 36 48 60 72

Waktu Ink ubasi (jam)

L og po p ula si sel (cf u /ml) 0 0.25 0.5 0.75 1 dia meter zo na ha mba t (cm )

(b) 0 0.5 1 1.5 2 0 12 24 36 48 60 72

Lo g pop ulasi se l (cf u /ml) 0 0.25 0.5 0.75 1 dia me te r zo na ha m ba t (c m )

(c)

Gambar 8 Aktivitas antimikrob supernatan kultur Bacillus sp. F13 selama inkubasi terhadap (a) X. oryzae pv. oryzae, (b) P. syringae pv.

glycines, (c) P. fluorescens B.

(data menunjukkan nilai rataan ± SE, n = 2).

PEMBAHASAN

Seleksi untuk mengetahui aktivitas antimikrob isolat-isolat Bacillus sp. dilakukan dengan uji antagonis terhadap 6 bakteri uji yaitu, E. coli, S. aureus, X. oryzae

(20)

10

pv. oryzae, P. syringae pv. glycines, P.

fluorescens A dan P. fluorescens B. Aktivitas penghambatan antimikrob ketiga

Bacillus sp. tersebut memiliki spektrum

yang luas, karena mampu menghambat bakteri Gram positif dan Gram negatif. Aktivitas antimikrob dalam uji antagonis ditunjukkan oleh adanya pembentukan zona bening disekitar koloni Bacillus sp. Pembentukan zona bening untuk E. coli dan

S. aureus membutuhkan waktu inkubasi

selama 2 hari, sedangkan untuk X. oryzae pv.

oryzae, P. syringae pv. glycines, dan P. fluorescens B membutuhkan waktu inkubasi

3-4 hari.

Perbedaan waktu pembentukan zona bening dipengaruhi oleh kecepatan pertumbuhan bakteri uji. Koloni E. coli dan

S. aureus dapat teramati dalam waktu 24

jam sedangkan koloni X. oryzae pv. oryzae,

P. syringae pv. glycines, P. fluorescens A

dan P. fluorescens B teramati setelah

inkubasi 3-4 hari. Hal ini dikarenakan, waktu generasi E. coli dan S. aureus lebih pendek daripada X. oryzae pv. oryzae, P.

syringae pv. glycines, P. fluorescens A dan

B. Waktu generasi adalah selang waktu yang dibutuhkan bagi sel untuk membelah diri atau untuk meningkatkan populasinya menjadi dua kali lipat (Pelczar & Chan 2006). Waktu generasi untuk E. coli dan S.

aureus adalah 15-20 menit, sedangkan waktu generasi X. oryzae pv. oryzae, P.

syringae pv. glycines, dan P. fluorescens

berturut-turut adalah 4-5 jam, 2.6 jam, dan 2.8 jam (Pelczar & Chan 2006; Yamasaki et

al 2006; West 2005; Klaus & Peter 1997).

Metode double layer merupakan metode semi kuantitatif, karena data yang dihasilkan belum dapat dijadikan sebagai ukuran yang tepat. Oleh karena itu, aktivitas antimikrob dari ketiga isolat Bacillus sp. terpilih diamati lebih lanjut dengan uji kompetisi dalam kultur cair. Pada uji kompetisi, aktivitas antimikrob dari isolat terpilih diukur berdasarkan daya hambatnya terhadap pertumbuhan populasi sel bakteri uji.

Daya hambat terhadap pertumbuhan populasi bakteri uji dinyatakan dalam persen penghambatan. Penghambatan pertumbuhan bakteri uji diantaranya disebabkan oleh adanya senyawa antimikrob yang diekskresikan oleh Bacillus ke dalam kultur. Salah satu contoh antimikrob yang dihasilkan oleh genus Bacillus adalah bakteriosin megacin yang diproduksi oleh B.

megaterium dan antibiotik basitrasin yang

diproduksi oleh B. subtilis (Tagg et al 1976; Williams et al 1996). Menurut Verschuere et

al. (2000) penghambatan pertumbuhan tidak

selalu berkaitan dengan produksi senyawa antimikrob seperti antibiotik, tetapi juga karena adanya senyawa metabolit primer atau adanya perubahan pH.

Uji kompetisi dilakukan pada beberapa rasio inokulum Bacillus sp. dan bakteri uji. Dari hasil pengamatan terhadap populasi sel bakteri uji, ternyata persen penghambatan ketiga isolat Bacillus tersebut terhadap pertumbuhan bakteri uji mencapai lebih dari 85% untuk semua rasio inokulum yang dicobakan.

Hasil uji kompetisi menunjukkan bahwa isolat Bacillus sp. F13, G3, dan A21 mampu menghambat X. oryzae pv. oryzae, dengan kuat berturut-turut pada saat inkubasi 24 jam (99.62%), 24 jam (98.3%), dan 72 jam (100%). Isolat Bacillus sp. F13, G3, dan A21 mampu menghambat P.

syringae pv. glycines dengan kuat saat

inkubasi ke 24 jam (100%). Isolat Bacillus sp. F13, G3, dan A21 mampu menghambat

P. fluorescens B dengan kuat berturut-turut

saat inkubasi 24 jam (100%), 24 jam (96.99%), dan 48 jam (97.73%). Hal ini menunjukkan bahwa isolat Bacillus sp. F13 memiliki efisiensi dan efektifitas dalam pengendalian patogen tanaman. Ini terkait dengan mekanisme penyebaran penyakit pada tanaman yang cepat sehingga membutuhkan pengendalian yang efektif dan efisien dalam waktu dan hasil produksi.

Ketiga isolat Bacillus sp. terpilih memiliki kemampuan penghambatan yang berbeda-beda terhadap ketiga bakteri uji. Perbedaan penghambatan terlihat dari lamanya waktu inkubasi yang dibutuhkan untuk menghambat bakteri uji.

Semakin lama waktu inkubasi, daya hambat isolat Bacillus sp. A21 terhadap bakteri uji semakin meningkat. Hal ini terlihat setelah akhir pengamatan selama 72 jam, populasi sel dari bakteri uji mengalami penurunan. Populasi sel P. syringae pv.

glycines yang dikompetisikan dengan Bacillus sp. A21 sangat rendah selama masa

inkubasi pada berbagai rasio inokulum. Sementara, X. oryzae pv. oryzae dan P.

fluorescens B populasi selnya mengalami

penurunan sejalan dengan lamanya waktu inkubasi.

Semakin lama waktu inkubasi daya hambat isolat Bacillus sp. F13 dan G3 terhadap bakteri uji semakin menurun. Hal ini terlihat setelah akhir pengamatan selama

(21)

11

72 jam, populasi sel dari bakteri uji mengalami peningkatan. Populasi sel P.

syringae pv. glycines yang dikompetisikan

dengan Bacillus sp. F13 dan G3 sangat rendah selama masa inkubasi pada berbagai rasio inokulum. Sementara pada X. oryzae pv. oryzae dan P. fluoresens B populasi sel mengalami peningkatan sejalan dengan lamanya waktu inkubasi.

Ketiga isolat ini tidak dapat diaplikasikan untuk formulasi campuran agen hayati dengan P. fluorescens B. Hal ini dikarenakan, ketiga isolat Bacillus sp. ini dapat menekan pertumbuhan dari P. fluorescens B. Menurut Arwiyanto et al.

(2007), pencampuran mikroba agen pengendali hayati harus memiliki kompatibilitas antar isolat, ini dimaksudkan untuk mendapatkan kombinasi antar isolat yang tidak saling menghambat satu dengan yang lain.

Penghambatan ketiga isolat

Bacillus sp. terhadap bakteri uji menunjukkan bahwa ketiga isolat tersebut dapat diaplikasikan di lingkungan sebagai agen pengendali hayati. Agen pengendali hayati Bacillus sp. diketahui mampu mengendalikan beberapa bakteri patogen tular tanah dan mampu memacu pertumbuhan tanaman serta menghasilkan antimikrob yang dapat menekan pertumbuhan berbagai patogen tanaman (Modjo 1991).

Uji aktivitas antimikrob supernatan yang dilakukan menunjukkan hanya supernatan isolat Bacillus sp. F13 yang menghasilkan zona bening. Sedangkan supernatan 2 isolat lainnya (A21 dan G3) tidak membentuk zona bening. Hal ini bukan berarti kedua isolat tersebut tidak mengekskresikan senyawa antimikrob, karena pada uji antagonis kedua isolat tersebut mampu membentuk zona bening.

Bakteriosin dapat dibedakan dari antibiotik, diantaranya dari proses produksinya. Bakteriosin dihasilkan pada saat pertumbuhan bakteri mencapai fase logaritmik, sedangkan antibiotik diproduksi pada saat akhir fase stasioner (Jack et al. 1995). Plot kurva pertumbuhan terhadap aktivitas antimikrob supernatan isolat

Bacillus sp. F13 menunjukkan senyawa

antikmikrob diproduksi optimum pada akhir fase logaritmik. Pada B. thuringiensis

produksi bakteriosin juga terjadi pada fase pertumbuhan logaritmik (Torkar & Matijasic 2003). Produksi bakteriosin butyricin oleh

Clostridium acetobutyricum terjadi pada

akhir fase logaritmik (Tagg et al. 1976), sedangkan pada C. perfringen produksi bakteriosin perfringocin terjadi pada awal fase stasioner (Clarke et al. 1975).

Berdasarkan informasi tersebut diduga senyawa antimikrob yang dihasilkan olah isolat Bacillus sp. F13 adalah bakteriosin.

Mekanisme kerja bakteriosin dalam menghambat pertumbuhan bakteri diantaranya adalah menghambat pembentukan dinding sel target, menghambat pembentukan asam nukleat atau protein, serta membentuk pori-pori pada membran sel target sehingga permeabilitas membran sel terganggu (Williams et al. 1996).

Efektivitas bakteriosin tergantung pada konsentrasi bakteriosin, kemampuan ionisasi, suhu, pH, dan fase pertumbuhan sel indikator (Hurst 1981). Uji antagonis menunjukkan luas zona bening disekitar koloni Bacillus sp. A21, F13, dan G3 bertambah diameternya sampai pada pengamatan 48 jam. Namun, setelah inkubasi 72 jam diameter zona bening menjadi lebih kecil. Hal ini diduga karena inkubasi yang dilakukan lebih dari waktu optimum produksi senyawa antimikrob dalam media. Dajani dan Wannamaker (1969) melaporkan inkubasi terlalu lama menyebabkan aktivitas bakteriosin menurun, hal ini kemungkinan disebabkan diproduksinya inaktivator dan adanya reabsorbsi terhadap senyawa antimikrob yang diproduksi sel. Selain itu, menurut Jo

et al. (1996) jika waktu inkubasi

diperpanjang maka aktivitas bakteriosin akan menurun karena terbebasnya protease dari sel autolisis. Bakteriosin merupakan molekul protein sehingga mudah terdegradasi oleh protease.

Bakteriosin diproduksi oleh bakteri Gram positif maupun bakteri Gram negatif (Jack et al. 1995). Sebagian besar

bakteriosin dihasilkan oleh bakteri Gram positif terutama paling banyak diteliti ialah dari genus Bacillus. Beberapa jenis bakteriosin yang dihasilkan oleh Bacillus diantaranya ialah coagulin yang dihasilkan oleh B. coagulans I4 (Hyronimus et al. 1998). Bakteriosin Bacillus yang telah

diaplikasikan dalam bidang industri ialah bacillocin 490 yang dihasilkan oleh B.

liceniformis (Martirani et al. 2002). Pada

mulanya aktivitas bakteriosin dinyatakan hanya menghambat spesies spesifik tetapi beberapa bakteriosin telah dibuktikan memiliki spektrum aktivitas penghambatan

(22)

12

yang luas sehingga dapat diaplikasikan secara luas di industri (Jack et al. 1995).

SIMPULAN

Sebanyak 31 isolat Bacillus sp. diseleksi daya hambatnya terhadap S. aureus, E. coli, X. oryzae pv. oryzae, P. syringae pv. glycines, dan 2 isolat

P. fluorescens dengan metode double layer.

Tigabelas isolat diantaranya menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap S. aureus,

E. coli, dan X. oryzae pv. oryzae, 8 isolat

mampu menghambat P. fluorescens A, 9 isolat mampu menghambat P. fluorescens B, dan 8 isolat mampu menghambat P. syringae pv. glycines. Terpilih 3 isolat Bacillus sp. yang memiliki Indeks Penghambatan (IP) paling tinggi terhadap X.

oryzae pv. oryzae. Ketiga isolat tersebut

adalah A21, F13, dan G3.

Isolat Bacillus sp. F13 dan G3 lebih cepat dan efektif menekan pertumbuhan X.

oryzae pv. oryzae dan P. syringae pv. glycines dibandingkan Bacillus sp. A21.

Isolat Bacillus sp. F13, G3, dan A21 mampu menekan pertumbuhan P. fluorescens.

Sehingga, ketiga isolat Bacillus tersebut tidak dapat dibuat dalam bentuk formulasi campuran dengan P. flourescens.

Aktivitas antimikrob Bacillus sp. F13 menunjukkan bahwa zat antimikrob diproduksi pada akhir fase logaritmik pertumbuhan.

SARAN

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk melakukan pemurnian dan karakterisasi senyawa antimikrob isolat

Bacillus sp. A21, F13, dan G3, sehingga

dapat ditentukan identitas senyawanya. Selain itu, perlu dilakukan uji antagonis antar ketiga Bacillus terpilih, serta pengkajian aplikasinya sebagai agen biokontrol dalam skala rumah kaca dan lapangan.

DAFTAR PUSTAKA

Asman A. 1996. Penyakit layu pada tanaman nilam dan cara pengendaliannya. Di dalam:

Integrated Control on Main Disease of Industrial Crops. Prosiding Pertemuan Ilmiah Tahunan; Bogor, 13 14 Mar 1996.

Bogor: Research Institute for Spice

and Medicinal Crops, Bogor. hlm. 284 290.

Arwiyanto T, Maryudani YMS, Azizah NN. 2007. Sifat-sifat fenotik

Pseudomonas fluorescens, agensia

pengendali hayati penyakit lincat pada Tembakau Temanggung. J.

Biodiversitas 8(2):147-151.

Clarke DJ, Robson RM, and Morris JG. 1975. Purification of two

Clostridium bacteriocins by

procedures appropriate to hydrophobic proteins. J. Antimicrob Agent Chemother

7(2):256-264.

Dajani AS, Wannamaker LW. 1969. Demonstration of bactericidal substance against beta-hemolytic streptococci in supernatant fluids of staphylococcal cultures. J Bacterial 97(5):985-991.

Dirmawati SR. 2005. Penurunan intensitas penyakit pustul bakteri kedelai melalui strategi cara tanam tumpangsari dan penggunaan agensia hayati. J. AGRIJATI 1(1):7-10.

Hurst A. 1981. Nissin advances. J. Appl

Microbiol 27(3):85-123.

Hyronimus B, Marrec CL, Urdaci MC. 1998. Coagulin, a bacteriocin-like inhibitory substance produce by

Bacillus coagullan I4.. J. Appl Microbiol 85(4):42-50.

Irina VP, Philippe B, Bernard V, Bernard F. 2001. In vitro anti-Heliobacter

pylori activity of the probiotic

strain Bacillus subtilis is due to secreation of antibiotics. J. Antimicrobe Agent Chemother

45(11):3156-3161.

Jack RW, Tagg JR, Ray B. 1995. Bacteriosin of Gram-positive bacteria. Microb Rev. 59(2):171-200.

Jo YB, Kyung MB, Sung-Koo, Hong-ki J. 1996. Evaluation at optimum conditions for bacteriocin production from Lactobacillus sp. JB-42 isolated from kimichi. J

Microbiol Biotechnol 6(7): 63-67.

Klaus, Peter R. 1997. Pseudomonas syringae pathovars and related pathogens. Philadelphia: Lipponicott Williams & Wilkins. Lisboa MP, Bonatto D, Bizani D, Henriques

JAP, Brandelli A. 2006. Characterization of a

(23)

bacteriocin-13

like substance produced by Bacillus

amyloliquefaciens isolated from the

Brazillian atlantic forest. Int Micobiol 9(2):111-118.

Martirani L, Varcamonti M, Naclero G, Felice M de. 2002. Purification and partial characterization of bacillocin 490, a novel bacteriocin produced by a thermophilic strain of Bacillus licheniformis. Microbiol

Cell Factories 1(1):1-5.

Modjo HS. 1991. Usaha menjadikan pengendalian hayati terhadap patogen tumbuhan sebagai pengendalian hama terpadu. J Litbang Pertanian 26(1):9-14.

Pelczar MJ, Chan ECS. Dasar-dasar Mikrobiologi. Hadioetomo RS, Imas T, Tjitrosomo SS, Angka SL, penerjemah. Jakarta: UI Pr. Terjemahan dari: Elements of Microbiology.

Sopyan AS, Findy K. 2007. Bacillus sp sebagai penghasil senyawa antimikrob dari tanah hutan Wana Wisata Cangkuang [studi lapangan]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahun Alam, Institut Pertanian Bogor.

Suparyono, Sudir, Suprihanto. 2003. Komposisi patotipe patogen hawar daun bakteri pada tanaman Padi stadium tumbuh berbeda. Ilmu Pertanian 22(1):45-50.

Supriadi. 2006. Analisis resiko agen hayati untuk pengendalian patogen pada tanaman. J. Litbang Pertanian

25(3):75-79.

Tagg JR, Dajani AS, Wannamaker LW. 1976. Bacteriocins of Gram-positive bacteria. Microbe Rev.

40(3):722-756.

Torkar KG, Matijasic BB. 2003. Partial characterization of bacteriocins produced by Bacillus cereus isolate from milk and milk products. J.

Food Technol 41(2):121-129.

Verschuere L, Geert R, Patrick S, Willy V. 2000. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture [ulas balik]. J Microbiol and Mol Biol

64(4):665-671.

West TP. 2005. Effect of carbon source on pyrimidine formation in

Pseudomonas fluorescens ATCC

13525. J. Microbiol 160(4):337-342.

Williams RAD, Lambert PA, Singleton P. 1996. Antimicrobial Drug Action. UK: Scientific Publisher Ltd. Yamasaki Y, Murata N, Suwa T. 2006.

Studies on the culture of

Xanthomonas oryzae. J. Bacteriol

(24)

(25)

15

Lampiran 1 Aktivitas penghambatan isolat Bacillus sp. terhadap populasi sel bakteri uji dalam uji kompetisi

Keterangan: * data diperoleh dari 2 pengulangan; (-) = populasi sel tidak terdeteksi Waktu inkubasi (jam) Isolat Bacillus sp. Rasio inokulum

Rataan populasi sel bakteri uji (x109 cfu/ml)*

P. fluorescens B P.syringae pv.

glycines X.oryzae pv. oryzae

24 F13 1:1 1 - 3.1 G3 1:1 2 - 0.9 A21 1:1 1 0.2 6.9 24 F13 1:2 4 - 2 G3 1:2 1 0.1 1.1 A21 1:2 3 0.1 1.5 24 F13 1:4 1.8 - 0.2 G3 1:4 3.5 - 1.2 A21 1:4 3.4 - 5.4 24 F13 1:10 1.7 0.1 1 G3 1:10 2.9 0.1 2 A21 1:10 2.8 0.3 5.5 48 F13 1:1 1 - 3.5 G3 1:1 2.5 - 0.9 A21 1:1 0.9 0.2 6.9 48 F13 1:2 4 0 4 G3 1:2 1 0.1 1.2 A21 1:2 2.5 0.1 1.5 48 F13 1:4 2.7 - 0.2 G3 1:4 3.5 - 1.2 A21 1:4 3 - 4.4 48 F13 1:10 0.5 0.1 1 G3 1:10 3.3 0.1 2 A21 1:10 2.8 0.3 4.1 72 F13 1:1 1.1 - 4.5 G3 1:1 3.9 - 0.9 A21 1:1 0.9 0.2 -72 F13 1:2 4.7 - 6.9 G3 1:2 1 0.1 1.4 A21 1:2 2.5 0.1 -72 F13 1:4 4.7 - 6.6 G3 1:4 3.5 - 1.4 A21 1:4 3 - -72 F13 1:10 0.8 0.1 1 G3 1:10 5.1 0.1 4.1 A21 1:10 3.1 0.3

(26)

-16

Lampiran 2 Persentase penghambatan isolat Bacillus sp. terhadap bakteri uji Waktu inkubasi (jam) Isolat Bacillus sp. Rasio inokulum Rataan Penghambatan (%)*

P. fluorescens B P. syringae pv. glycines X. oryzae pv. oryzae

24 F13 1:1 96.99 100 94.15 G3 1:1 93.98 100 98.3 A21 1:1 96.39 98.39 86.98 24 F13 1:2 87.95 100 96.23 G3 1:2 96.99 99.19 97.92 A21 1:2 90.96 99.19 97.17 24 F13 1:4 94.58 100 99.62 G3 1:4 89.46 100 97.73 A21 1:4 89.76 100 89.81 24 F13 1:10 100 99.7 98.11 G3 1:10 91.27 99.19 96.23 A21 1:10 91.57 97.58 89.62 48 F13 1:1 96.99 100 93.4 G3 1:1 92.25 100 98.3 A21 1:1 97.73 98.39 86.98 48 F13 1:2 87.95 100 92.45 G3 1:2 96.99 99.19 97.73 A21 1:2 92.47 99.19 97.17 48 F13 1:4 91.87 100 99.62 G3 1:4 89.46 100 97.73 A21 1:4 90.96 100 91.69 48 F13 1:10 98.49 99.7 98.11 G3 1:10 90.06 99.19 97.73 A21 1:10 91.57 97.58 92.26 72 F13 1:1 96.69 100 91.51 G3 1:1 88.25 100 98.3 A21 1:1 97.73 98.39 100 72 F13 1:2 85.84 100 88.68 G3 1:2 96.99 99.19 97.36 A21 1:2 92.47 99.19 100 72 F13 1:4 85.84 100 98.75 G3 1:4 86.46 100 97.36 A21 1:4 90.96 100 100 72 F13 1:10 97.59 99.7 98.11 G3 1:10 84.64 99.19 92.26 A21 1:10 90.66 97.58 100

(27)

17

Lampiran 3 Populasi sel isolat Bacillus sp. dan bakteri uji dalam kontrol positif dan negatif untuk uji kompetisi

Waktu inkubasi

(jam)

Rataan populasi sel (x1010cfu/ml)*

Bacillus sp. A21 Bacillus sp. F13 Bacillus sp. G3 P.fluorescens B P.syringae pv. glycines X.oryzae pv. oryzae 24 1.44 2.36 0.8 3.32 1.24 5.3 48 1.44 2.36 1.02 3.32 1.24 5.3 72 1.72 2.36 1.02 3.32 1.24 5.3

(28)

18

Lampiran 4 Aktivitas antimikrob supernatan kultur isolat Bacillus sp. F13 Waktu

inkubasi (jam)

Log jumlah populasi

X. oryzae pv. oryzae P. fluorescens B P. syringae pv. glycines

Rataan diameter zona bening (cm)* SE Rataan diameter zona bening (cm)* SE Rataan diameter zona bening (cm)* SE 0 0 - - - -12 1.09 0.38 0.13 0.06 0.04 0.38 0 24 1.09 0.25 0.08 0.06 0.02 - -36 1.17 0.13 0.04 0.06 0.02 - -48 1.18 - - - -60 1.20 - - - -72 1.19 - - -