KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
II..
T
Tu
ujju
ua
an
n
1.1. Melakukan Melakukan dan dan menjelaskan menjelaskan teknik-teknik teknik-teknik dasar dasar kromatografi kromatografi lapis lapis tipis.tipis. 2.
2. Menjelaskan Menjelaskan prinsip prinsip dasar dasar kromatografi.kromatografi. 3.
3. Melakukan Melakukan isolasi isolasi campuan campuan senyawa senyawa sampai sampai pemurniannya pemurniannya secara secara kromatografikromatografi tipis.
tipis.
IIII..
P
Prriin
nssiip
p
11.. bbererddasasararkakan pn pememisisahahan an dudua aa atatau lu lebebih ih sesenynyawawaa 2.
2. berdaberdasarkan sarkan perbeperbedaan daan migramigrasi si dan dan distridistribusi busi senyasenyawa wa dalam dalam dua dua fase fase yangyang berbeda yaitu fase diam dan fase gerak.
berbeda yaitu fase diam dan fase gerak.
IIIIII..
R
Reea
ak
kssii
--IIV
V..
T
Teeo
orrii
KroKromatmatogrografi afi digdigunaunakan kan sebsebagai agai untuntuk uk memmemisahisahkan kan subsubstanstansi si camcampurpuranan menjadi komponen-komponennya, misalnya senyawa la!onoida dan isofla!onoida menjadi komponen-komponennya, misalnya senyawa la!onoida dan isofla!onoida yan
yang g terterdapdapat at padpada a tahutahu, , temtempe, pe, bubbubuk uk kedkedelai elai dan dan tautauco co sertserta a "co"coparparia ia duldulcis,cis, #indernia anagalis, dan $orenia !iolacea. %ang pada senyawa isofla!on memiliki #indernia anagalis, dan $orenia !iolacea. %ang pada senyawa isofla!on memiliki banyak
banyak manfaat. manfaat. &eberapa &eberapa kelebihan kelebihan senyawa senyawa isofla!on isofla!on yang yang potensial potensial bagibagi kesehatan manusia, di antaranya adalah sebagai antioksidan, antitumor ' antikanker, kesehatan manusia, di antaranya adalah sebagai antioksidan, antitumor ' antikanker, antiko
antikolesterollesterol, , anti!ianti!irus, rus, antialeantialergi, dan rgi, dan dapat mencegah dapat mencegah osteoosteoporosporosis. is. (an semua(an semua kromatografi bekerja berdasarkan metode kromatografi.
kromatografi bekerja berdasarkan metode kromatografi.
Kromatografi juga merupakan pemisahan camuran senyawa menjadi senyawa Kromatografi juga merupakan pemisahan camuran senyawa menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya. )ntuk itu, kemurnian bahan atau komposisi murninya dan mengetahui kuantitasnya. )ntuk itu, kemurnian bahan atau komposisi campu
campuran ran dengdengan an kandukandungan yang ngan yang berbedberbeda a dapat dianalisis dapat dianalisis dengadengan n benarbenar. . $i$idak dak hanya kontrol kualitas, analisis bahan makanan dan lingkungan, tetapi juga kontrol hanya kontrol kualitas, analisis bahan makanan dan lingkungan, tetapi juga kontrol dan optimasi reaksi kimia dan proses berdasarkan penentuan analitik dari kuantitas dan optimasi reaksi kimia dan proses berdasarkan penentuan analitik dari kuantitas mat
materiaerial. l. $$ekeknolnologi ogi yayang ng penpentinting g untuntuk uk anaanalisilisis s dan dan pempemisahisahan an prepreparparatiatif f padpadaa campuran bahan adalah prinsip dasar kromatografi.
campuran bahan adalah prinsip dasar kromatografi.
*emisahan senyawa biasanya menggunakan beberapa tekhnik kromatografi. *emisahan senyawa biasanya menggunakan beberapa tekhnik kromatografi. *em
*emilihilihan an tekteknik nik krokromatmatogrografi afi sebasebagiagian n besbesar ar berbergangantuntung g padpada a sifasifat t kelkelarutarutanan senyawa yang akan dipisahkan.
"emua kromatografi memiliki fase diam +dapat berupa padatan, atau kombinasi cairan-padatan dan fase gerak +berupa cairan atau gas. ase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda.
Kromatografi #apis $ipis +K#$ merupakan cara pemisahan campuran senyawa menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya yang menggunakan. Kromatografi juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun cuplikannya.
K#$ dapat dipakai dengan dua tujuan. *ertama, dipakai selayaknya sebagai metode untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif atau preparatif. Kedua, dipakai untuk menjajaki sistem pelarut dan sistem penyangga yang akan dipakai dalam kromatografi kolom atau kromatografi cair kinerja tinggi +ritter et al , 11.
K#$ dapat digunakan untuk memisahkan senyawa / senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida / lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas. K#$ juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi dan isolasi senyawa murni skala kecil. *elarut yang dipilih untuk pengembang disesuaikan dengan sifat kelarutan senyawa yang dianalisis. &ahan lapisan tipis seperti silika gel adalah senyawa yang tidak bereaksi dengan pereaksi / pereaksi yang lebih reaktif seperti asam sulfat.
(ata yang diperoleh dari K#$ adalah nilai 0f yang berguna untuk identifikasi senyawa. ilai 0f untuk senyawa murni dapat dibandingkan dengan nilai 0f dari senyawa standar. ilai 0f dapat didefinisikan sebagai jarak yang ditempuh oleh senyawa dari titik asal dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut dari titik asal. leh karena itu bilangan 0f selalu lebih kecil dari 1,.
Pelaksanaan KLT
1. ase (iam
ase diam yang digunakan dalam K#$ merupakan penjerap berukuran kecil dengan diameter partikel antara 1-3 4m. "emakin kecil ukuran rata-rata partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja K#$ dalam hal efisiensi dan resolusinya.
*enjerap yang paling sering digunakan adalah silika dan serbuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi yang utama pada K#$ adalah adsorpsi dan partisi +andjar 5 0ohman, 26.
2. ase erak
ase gerak pada K#$ dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan mencoba-coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. "istem yang paling sederhana ialah campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. &erikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak 7
1. ase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena K#$ merupakan teknik yang sensitif.
2. (aya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga 0f terletak antara ,2-,8 untuk memaksimalkan pemisahan.
3. )ntuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti juga menentukan nilai 0f. *enambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil ben9ene akan meningkatkan harga 0f secara signifikan +andjar 5 0ohman, 26.
3. *enotolan "ampel
)ntuk memperoleh roprodusibilitas, !olume sampel yang ditotolkan paling sedikit ,: 4l. ;ika !olume sampel yang ditotolkan lebih besar dari 2-1 4l, maka penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar totolan
+andjar 5 0ohman, 26.
<. *engembangan
&ila sampel telah ditotolkan maka tahap selanjutnya adalah mengembangkan sampel dalam bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhi dengan uap fase gerak. $epi bagian bawah lempeng tipis yang telah ditotoli sampel dicelupkan kedalam fase gerak kurang lebih ,:-1 cm. $inggi fase gerak dalam bejana harus dibawah lempeng yang telah berisi totolan sampel.
&ejana kromatografi harus tertutup rapat dan sedapat mungkin !olume fase gerak sedikit mungkin, akan tetapi harus mampu mengelusi lempeng sampai ketinggian lempeng yang telah ditentukan. )ntuk melakukan penjenuhan fase gerak, biasanya bejana dilapisi dengan kertas saring. ;ika fase gerak telah mencapai ujung
dari kertas saring, maka dapat dikatakan bahwa fase gerak telah jenuh +andjar 5 0ohman, 26.
:. (eteksi &ercak
(eteksi bercak pada K#$ dapat dilakukan secara kimia dan fisika. =ara kimia yang biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui cara penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas. =ara fisika yang dapat digunakan untuk menampakkan bercak adalah dengan cara pencacahan radioaktif dan fluorosensi sinar ultra!iolet. luorosensi sinar ultra!iolet terutama untuk senyawa yang dapat berfluorosensi, membuat bercak akan terlihat jelas +andjar 5 0ohman, 26.
(eteksi senyawa dilakukan dengan menggunakan detektor )> di bawah sinar )> 2:< nm, indikator pada plat K#$ akan memancarkan warna hijau dan pada )> 3?? nm akan memancarkan warna ungu. Komponen yang menyerap cahaya pada 2:< atau 3?? nm akan tampak sebagai bercak gelap pada plat yang bercahaya +ibbons, 2?. Metode deteksi lain adalah dengan menggunakan pereaksi semprot
>. @lat dan &ahan
a. @lat yang digunakan i. *elat K#$
ii. *ensil
iii. *enggaris
i!. *ipa kapiler
!. Kertas saring
!i. #ampu )>
!ii. #ampu )>
!iii. "aringan !akum
b. &ahan yang digunakan i. 0impang kunyit ii. (iklometana iii. "erium ulfat i!. Metanol !. Atanol
>B. *rosedur *ercobaan
a. =ara penyiapan kromatografi lapis tipis
• *enotolan sampel pada plat K#$
*elat ditandai menggunakan pensil dan penggaris untuk posisi tempat sampel ditotolkn, sekitar 1cm dari bagian bawah plat. (igunakan pensil untuk memberi label sampel. Kemudian ditotolkan sampel diatas plat menggunakan
pipa kapiler sampai noda cukup tebal tetapi tidak melebar. "etelah noda pada plat kering, masukkan plat ke dalam wadah tertutup yang telah berisi pelarut yang sesuai. "ebelumnya pelarut dalam wadah dijenuhkan terlebiih dahulu dengan menempatkan kertas saring didalam wadah dan wadah harus tertutup. Kemudian dibiarkan pelarut menaiki plat didalam wadah perlahan sampai mencapai sekitar ,:cm dari bagian atas plat. "elanjutnya, dikeluarkan plat dan dibiarkan pelarut mengering di udara.
&eberapa senyawa organik berwarna. ;ika anda beruntung memisahkan sampel yang berwarna, maka penampakan noda dengan mudah terlihat. amun sebagian besar senyawa organik tak berwarna, oleh karena itu untuk penampakan noda diperlukan alat bantu. &iasanya plt K#$ menggunakan bahan indikator fluorens yang dapat memancarkan warna biru.
b. =ara Kerja
2 gram rimpang kunyit kering dalam :ml diklorometan direfluks selama 1 jam. =ampuran kemudian segera disaring dengan saringan !akum hinga diperoleh larutan kuning. #arutan lalu dipekatkan melalui destilasi pada penanggas air. 0esidu kuning kemerahan yang diperoleh kemudain dicampurkan dengan 2 ml n-heksana dan diaduk secara merata. =ampuran kemudian disaring lagi dengan penyaring !akum. *adatan yang dihasilkan selanjutnya dianalisis dengan kromatografi lapis tipis +$#= menggunakan eluen =C2=l2 7 MeC D 6 7 3 yang akan menunjukan 3 komponen utama. Casil elusi dilihat di bawah lampu )>, kemudian pita komponen utamanyadiberi tanda dengan ujung tumpul pipa kapiler. &agian pita yang dipilih kemudian dipisahkan dari komponen lainnnya dengan cara mengerok lapisan silia tersebut dan ditampung pada kertas. *indahkan silika tersebut ke dalam gelas kimia, larutkan dengan diklorometana, kemudian saring dan cuci dengan pelarut yang sama. )kur panjang gelombangnya menggunakan spektrofotometri )>->is. >BB. (ata pengamatan a. 0f D 3 6,2= ¿ b. 0f D 4,8 6,2=¿
c. 0f D ❑
6,2 D
>BBB. *embahasan
*ada praktikum kali ini dilakukan percobaan kromaografi lapis tipis, yaitu isolasi kurkumin dari kunyit. *ercobaan ini dilakukan dengan menggunakan ekstrak kunyit, diklorometana, metanol, etanol, plat K#$.
*ada percobaan ini akan diteliti komponen dari kunyit dengan menggunakan kromatografi lapis tipis +K#$. Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu analisis kualitatif dari suatu sampel yang ingin dideteksi dengan memisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan perbedaan kepolaran. *rinsip kerjanya yakni memisahkan sampel berdasarkan perbedaan kepolaran antara sampel dengan pelarut yang digunakan.
Metode ini memiliki dua komponen utama, yaitu fasa diam dan fasa gerak. asa diam merupakan fasa +bagian yang tetap dan tidak bergerak dalam sebuah sistem, sedangkan fasa gerak adalah fasa yang melalui lapisan yang menyelubungi permukaan fasa diam. *ada umumnya fase diam dari bentuk plat silika dan fase
geraknya disesuaikan dengan jenis sampel yang ingin dipisahkan. #arutan atau campuran larutan yang digunakan dinamakan eluen. "emakin dekat kepolaran antara sampel dengan eluen maka sampel akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut.
Kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. ;el silika +atau alumina merupakan fase diam. ase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang ditambahkan kedalamnya, di mana dapat berpendar flour ketika diberi pancaran sinar ultra!iolet +)>. ase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. ase diam yang digunakan pada kromatografi lapis tipis di percobaan ini yakni berupa lempeng'plat berukuran 2E? cm yang disebut juga $#=. $#= ini mengandung jel silika di mana merupakan bentuk dari silikon dioksida +silika. @tom silikon dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur ko!alen yang besar. amun, pada permukaan jel silika, atom silikon berlekatan pada gugus -C. ;adi, pada permukaan jel silika terdapat ikatan "i--C selain "i--"i. *ermukaan jel silika sangat polar dan karenanya gugus -C dapat membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai di sekitarnya, sebagaimana halnya gaya !an der Faals dan atraksi dipol- dipol.
"edangkan fase gerak yang digunakan yakni campuran larutan *A dan metanol dengan perbandingan yang ber!ariasi. >ariasi perbandingan campuran larutan *A dan metanol ini bertujuan agar dapat diperoleh larutan *A dan metanol yang mana memiliki polaritas yang sesuai dengan yang dibutuhkan pada karakteristik sampel +minyak atsiri, mulai dari yang polaritasnya rendah sampai polaritas yang tinggi. @walnya pada $#= dibuat pembatas berupa garis ,: cm dari bawah dan ,: cm dari atas menggunakan pensil dan setetes minyat atsiri diteteskan pada garis batas bawah. ungsi diberi penandaan pada garis di lempengan untuk menunjukkan posisi awal dan posisi akhir dari tetesan tersebut. Ketika bercak dari campuran itu mengering,
lempengan ditempatkan dalam sebuah gelas pengembang +chamber di mana berisi campuran larutan *A dan metanol dengan perbandingan yang ber!ariasi, kemudian ditutup. @lasan untuk menutup gelas pengembang +chamber adalah untuk meyakinkan bawah kondisi dalam gelas pengembang tersebut terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas pengembang +chamber dengan uap mencegah penguapan pelarut. )ntuk mengetahui bentuk noda +bercak-bercak pada $#= tidak
dapat diamati dengan mata telanjang. amun, harus menggunakan bantuan sinar )>. *enyinaran sinar )> pada lempengan, akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda dengan posisi bercak-bercak. &ercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap. "ementara )> tetap disinarkan pada lempengan. *ada posisi bercak-bercak yang timbul kemudian ditandai menggunakan pensil dan melingkarinya. Ketika pelarut mulai membasahi lempengan, pelarut pertama akan melarutkan senyawa-senyawa dalam bercak yang telah ditempatkan pada garis dasar. "enyawa-senyawa akan cenderung bergerak pada lempengan kromatografi sebagaimana halnya pergerakan pelarut. &agaimana cepatnya senyawa-senyawa di bawa bergerak ke atas pada lempengan, tergantung pada kelarutan senyawa dalam pelarut, besar atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut, dan tergantung pada bagaimana besar atraksi antara senyawa dengan jel silika.
"enyawa yang dapat membentuk ikatan hidrogen akan melekat +terjerap pada jel silika lebih kuat dibanding senyawa lainnya. *enjerapan merupakan pembentukan suatu ikatan dari satu substansi pada permukaan. $erdapat perbedaan bahwa ikatan hidrogen pada tingkatan yang sama dan dapat larut dalam pelarut pada tingkatan yang sama pula. Cal ini tidak hanya merupakan atraksi antara senyawa dengan jel silika saja, melainkan atraksi antara senyawa dan pelarut juga merupakan hal yang penting.
Cal ini akan mempengaruhi bagaimana mudahnya senyawa ditarik pada larutan keluar dari permukaan silika.
ilai 0f yang diperoleh dari percobaan berbeda-beda pada setiap perbandingan senyawa eluen. Cal ini dikarenakan pada setiap campuran perbandingan antara eluen *A dan metanol akan mengubah jenis kepolaran pada eluen. leh karena itu, kepolaran larutan sangat berpengaruh pada proses kromatografi ini.
(i dalam kromatografi, berlaku suatu prinsip umum7 #BKA (B""#>A #BKA, artinya polar menyukai yang polar dan tak polar menyukai tak polar. (alam hal ini, fasa diam yang polar akan mengikat lebih kuat komponen yang relatif polar, sedangkan fasadiam yang tak polar akan mengikat lebih kuat komponen-komponen yang juga tak polar. Cal yang sama berlaku bagi fasa gerak. asa gerak yang polar akan melarutkan lebih baik komponen yang juga polar, sebaliknya fasa gerak yang tak polar akan melarutkan relatif lebih baik komponen yang juga tak polar.
&erdasarkan hasil percobaan pada larutan eluen *A diperoleh hasil pada minyak cengkeh nilai 0f nya ,2 dan ,1?. "ebagai pembanding dari komposisi pada minyak cengkeh yaitu eugenol di mana memiliki nilai 0f ,:, hasil ini masih dikatakan sangat jauh dari pembandingnya. "edangkan pada minyak sereh diperoleh nilai 0f nya ,2 dan ,28. "ebagai pembanding dari komposisi pada minyak sereh yaitu geraniol +0f standar nya ,<3 dan sitronellol +0f standar nya ,?3. Casil pada minyak sereh pada nilai 0f 2 yakni ,28 cukup mendekati nilai 0f standar dari sitronellol. "ehingga, pada noda kedua ini dimungkinkan merupakan kandungan sitronellol pada minyak sereh.
&erdasarkan pada larutan eluen metanol diperoleh hasil pada minyak cengkeh yang mana nilai 0f nya diperoleh ,<. Casil ini cukup mendekati pembandingnya yaitu eugenol yang mana memiliki nilai 0f ,:.
&erdasarkan pada larutan eluen *A7metanol yakni 673 diperoleh hasil pada minyak cengkeh yang mana nilai 0f nya diperoleh ,1<. Casil ini sangat jauh dari pembandingnya yaitu eugenol yang mana memiliki nilai 0f ,:. "ehingga hasil ini
tidak dapat digunakan.
&erdasarkan pada larutan eluen *A7metanol 376 diperoleh hasil pada minyak cengkeh yang mana nilai 0f nya diperoleh ,<?. Casil ini hampir mendekati nilai 0f pembandingnya yaitu eugenol +0f nya ,:. "ehingga noda ini dapat dipastikan
sebagai eugenol. "ementara itu, pada minyak sereh diperoleh nilai 0f nya ,6. Casil ini hampir mendekati nilai 0f pembandingnya yaitu sitronellol +0f standar nya ,?3
walaupun kelebihan. "ehingga, dapat dipastikan bahwa noda tersebut merupakan kandungan sitronellal.
Kromatografi pada dasarnya adalah metode pemisahan berdasarkan proses migrasi dari komponen-komponen senyawa diantara dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak. ase gerak membawa 9at terlarut melalui media fase diam sehingga terpisah dari 9at terlarut lainnya yang terelusi lebih awal atau paling atau paling akhir karena perbedaan afinitas masing-masing9at terlarut dengan fase diam. ase diam disini adalah berupa 9at padat yang disebut adsorben yang digunakan adalah pelat K#$ silika gel.
"ilika gel merupakan adsorben yang paling banyak digunakan dalam kromatografi lapis tipis. "enyawa netral yang merupakan gugusan sampai tiga pasti dapat dipisahkan pada lapisan yang diaktifkan dengan memakai pelarut organik atau campuran pelarut yang normal. Karena sebagian besar silika gel bersifat sedikit asam, maka asam agak mudah dipisahkan, jadi meminimumkan reaksi asam-basa antara penjerap dengan senyawa yang dipisahkan. "edangkan fase gerak yang sering digunakan adalah berupa campuran dari pelarut organik dengan tujuan untuk memperoleh pemisahan yang lebih baik.
Kombinasi pelarut berdasarkan atas polaritasnya, sehingga akan diperoleh sistem pengembang yang cocok. (alam beberapa percobaan, pelarut tunggal memberikan hasil yang memuaskan, akan tetapi pada sebagian percobaan pelarut tunggal dapat menggerakkan bercak terlalu jauh sehingga kombinasi pelarut yang mempunyai polaritas yang berbeda sering digunakan. *elarut yang digunakan dalam percobaan ini adalah metanol, diklometana.
