310
AKTIVITAS ANTIPROLIFERASI EKSTRAK RIMPANG TEMUPUTIH [Curcuma zedoaria (Christm) Roscoe] TERHADAP SEL LESTARI TUMOR SECARA
IN VITRO
{Anti-proliferation Activity of Curcumae Extracts
[Curcuma zedoaria (Christm) Roscoe] against Tumor Cell Lines In-Vitro} Ros Sumarny1, Bambang P. Priosoeryanto2, Meliana Tham1, Hannes1
1Fakultas Farmasi Universitas Pancasila Jakarta 2 Fakultas Kedokteran Hewan Institut Ppertanian Bogor
email: rosaries15@yahoo.com
ABSTRACT
Screening of candidate of antitumor compounds begins with research on lethality test on microorganisms such as shrimp larvae. The study is further continued to test the cytotoxicity of various polarities of plant extracts against various type of tumor cell lines. This study aimed to obtained the value of Lethality Concentration Fifty (LC50) of the water, methanol, ethyl acetate and n - hexane extract of curcumae on shrimp larvae mortality using Brine Shrimp Lethality Test ( BSLT) followed by observing the cytotoxicity against MDCK cell lines (Madin-Darby Canine Kidney Epithelial Cells) and MCA - B1 cell lines (canine oral acanthomatous epulis). The results showed that n-hexane extract demonstrated the highest toxicity with LC50 value of 66 ppm whereas IC50 value of 81.6 ppm for MDCK cells and IC50 value of 77.4 ppm for MCA - B1 cells.
Keywords: Curcumae extracts, anti-proliferation, MDCK cells, MCA-B1 cells PENDAHULUAN
Tumor atau neoplasma adalah pertumbuhan sel yang berlebihan dan tidak terkontrol, dapat diikuti dengan metastasis pada satu atau lebih jaringan. Kanker adalah istilah umum untuk semua tumor ganas (malignant tumor) yaitu tumor yang menyebar dan ganas, sedangkan tumor yang tidak menyebar dan tidak ganas disebut tumor jinak (benign tumor). Pengembangan obat anti-tumor ditujukan untuk memperoleh obat anti-tumor yang lebih selektif dengan sifat toksisitas minimal dan mencegah resistensi obat yang disebabkan oleh ketidakstabilan genetika tumor. Salah satu strategi pengembangan obat anti-tumor adalah dengan menemukan senyawa yang mendasarkan target aksinya pada gen pengatur pertumbuhan atau proliferasi sel (Gibbs, 2000).
Indonesia kaya akan sumber bahan obat alam yang dikenal dengan Obat Asli Indonesia (OAI) atau obat herbal yang telah dimanfaatkan oleh masyarakat di Indonesia secara turun temurun. Tumbuhan obat asal Indonesia yang sering digunakan untuk pengobatan tumor antara lain: Cathranthus
roseus/Vinca rosea, Sonchus arvensis,
Dioscorea bulbifera, Gynura procumbens, Kaempferia rotunda, Curcuma zedoaria. Di
antara tumbuhan tersebut ada yang berkhasiat sebagai sitostatika, imunomodulator, anti-inflamasi, hepatoprotektor dan analgesik (Saputra et al. 2000). Hasil penelitian Murakami et al. (1998) pada uji saring secara in vitro ekstrak etanol dari 107 jenis tanaman dari 48 famili tanaman terhadap sel Raji dan uji tumor
promoter
311
virus activation, diperoleh hasil sebanyak 71
% ekstrak etanol tanaman menghambat 30 % atau lebih aktivasi virus EB pada kadar 200 mg/mL. Diantara jenis tanaman tersebut yang terbanyak bersifat anti-tumor berasal dari famili Zingiberaceae dan Umbelliferae.
Dalam dasawarsa belakangan ini C.
zedoaria atau dikenal dengan nama
daerahnya kunyit putih, temu putih, atau koneng bodas secara tradisional rimpangnya (rhizoma) digunakan untuk pengobatan kanker serviks dan meningkatkan efektivitas kemoterapi pada penderita kanker (Dalimartha 2003). Pemakaian obat tradisional oleh masyarakat terutama dalam pengobatan tumor dilakukan dengan alasan yang bersifat medis, kejiwaan maupun sosial ekonomi. Pada kanker stadium lanjut, obat tradisional jelas tidak bermakna memperpanjang umur penderita tetapi bermanfaat meningkatkan kualitas hidup penderita Pengobatan tumor dengan obat
yang berasal dari tumbuhan dimaksudkan sebagai usaha pencegahan (kemopreventif) dan selalu diberikan dalam bentuk kombinasi dengan beberapa macam tumbuhan (Saputra et al. 2000).
Penelitian ini bertujuan untuk menilai potensi penghambatan proliferasi dari beberapa ekstrak rimpang temu putih terhadap sel tumor MDCK dan MCA-B1. Ekstrak dibuat dengan cara ekstraksi bertingkat dengan cairan penyari yang berbeda polaritasnya yakni n-heksana, etil asetat dan metanol, dilanjutkan dengan penapisan fitokimia untuk mengetahui golongan senyawa kimia yang terkandung dalam masing-masing ekstrak. Uji Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) terhadap larva udang Artemia salina dilakukan untuk memperoleh nilai Lethality Concentration fifty (LC50).
METODOLOGI PENELITIAN Alat
Alat yang digunakan: alat gelas,
rotavapor (Buchii), penangas air,
spektrofotometer Vis (Shimadzu UV-1201), mikroskop fase kontras (ID03 Zeiss Jerman), hemositometer Neubauer (Marienfield), sentrifus (Joan tipe CR 412), inkubator (Juan tipe 1G 150), laminar
airflow (Holten tipe HV 2472), multiwell culture disk 24 lubang, tabung nitrogen cair
(Taylor-Whaston) suhu -196◦C, cyro gloves,
vortex.
Bahan
Bahan penelitian: Rimpang temu putih [Curcuma zedoaria (Christm) Roscoe] diperoleh dari BALLITRO, sel lestari MDCK dan sel MCA-B1 diperoleh dari Laboratorium Kultur Jaringan, Laboratorium Patologi Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor, metanol, n-heksana, etil asetat, pereaksi penapisan fitokimia, telur udang laut (Artemia salina), medium penumbuh DMEM, FBS 10%,
fungizone 0,1%, penisilin-streptomisin, tripan biru, alkohol, akuades.
Tempat Penelitian: determinasi tanaman dilakukan di Herbarium Bogoriense LIPI Cibinong; ekstraksi, penapisan fitokimia dan BSLT dilakukan di Laboratorium Penelitian Dosen Fakultas Farmasi Universitas Pancasila, sedangkan uji aktivitas antiproliferasi dengan sel lestari tumor dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan, Laboratorium Patologi Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor
Prosedur Penelitian:
1. Pembuatan ekstrak dengan cara maserasi bertingkat
Sebanyak 1 kg serbuk rimpang temuputih dimaserasi dan diaduk dengan n-heksana (3 kali @ 1500 mL), diaduk, diletakkan pada tempat yang terlindung dari cahaya, kemudian disaring, dipekatkan dan diperoleh ekstrak n-heksana. Ampas dimaserasi dengan etil asetat (3x1500 mL), disaring, dipekatkan dan diperoleh
312 ekstrak etil asetat. Ampas kembali dimaserasi dengan
kembali dengan metanol (3x1500 mL), disaring, dipekatkan dan diperoleh ekstrak metanol.
Ekstrak air dibuat dengan cara infundasi dengan penyari air (dibuat infus 10%. Filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan penguap berputar (rotavapor) pada suhu 1000C sampai diperoleh ekstrak kental.
2. Penapisan fitokimia serbuk dan ekstrak Dilakukan sesuai metode Fransworth untuk identifikasi golongan alkaloid, flavanoid, saponin, tanin, kuinon, steroid/triterpenoid,kumarin dan minyak atsiri (Fransworth,1986)
3. Pengujian toksisitas dengan metode Brine
Shrimp Lethality Test (BSLT) (Meyer,
1982)
Merupakan uji pendahuluan untuk mengetahui daya ketoksikan dari ekstrak yang merupakan pedoman untuk uji sitotoksik dengan sel lestari tumor. Uji dilakukan terhadap 5 tingkat konsentrasi ekstrak terhadap 30 ekor nauplii (larva udang instar 3 Artemia salina) dengan 3 kali ulangan (triplo). Nilai LC50 (konsentrasi yang menimbulkan kematian pada 50 % populasi) diperoleh dari data analisis regresi log konsentrasi (sumbu X) dan probit (sumbu Y; prosentase kematian larva udang)
4. Pengujian antiproliferasi dengan sel MDCK dan sel MCA-B1
a. Pembuatan medium sel tumor
Medium pertumbuhan terdiri dari DMEM, FCS 10 %, antibiotik penisilin-streptomisin 5% , fungizone 0,1 % dan metil merah dengan pH 7,0-7,4.
b. Thawing sel tumor
Sel tumor dalam microtube diambil dari tabung nitrogen cair dan dilakukan
thawing menggunakan telapak tangan
yang saling menggosok untuk segera mencairkan sel dalam microtube. Isi
microtube dituang ke dalam tabung
reaksi kecil untuk disentrifuse selama 5 menit 1000 RPM, setelah supernatan
dibuang akan diperoleh pelet sel. Tambahkan 1 mL medium dan dikocok dengan pipet (up down) dan dilanjutkan dengan subkultur sel. c. Pengulturan sel tumor
Pada pengujian antiproliferasi sediaan uji digunakan multiwell culture dis 24 lubang yang masing – masing lubang memiliki kapasitas 1 mL (1000 µL). Masing-masing lubang diisi dengan 900 µL medium pertumbuhan, 50 µL sel lestari tumor dan 50 µL masing-masing ekstrak uji dengan konsentrasi tertentu. Setiap sel lestari tumor, mendapat perlakuan triplo dari ekstrak air, metanol, etil asetat dan n-heksana (masing-masing 3 tingkat konsentrasi).
Multiwell culture disk diinkubasi
selama 3-5 hari pada suhu 37◦C dan 5% CO2.
d. Perhitungan sel lestari
Perhitungan sel lestari dilakukan apabila sel pada lubang multiwell
culture dis sudah tumbuh optimal
menutupi seluruh permukaan lubang (confluence) kira–kira setelah 3 - 5 hari (tergantung jenis sel) diamati dengan mikroskop fase kontras. Perhitungan sel menggunakan Hemositometer Neubauer dan mikroskop cahaya dengan perbesaran 100 x. Setiap lubang dikocok, ambil 90 µl ditambah 10 µl tripan biru. Campuran sel ini diambil 10 µl untuk dihitung jumlah total sel (hidup dan mati) yang terdapat pada kamar hitung hemositometer Neubauer. Hasil perhitungan sel adalah hasil rata–rata jumlah sel dari semua ulangan pada setiap perlakuan, kemudian dikali dengan faktor konversi 104. Semakin
besar jumlah total sel kelompok perlakuan menunjukkan bahwa aktivitas penghambatan proliferasi anti tumor dari larutan uji semakin rendah. Aktivitas proliferasi dihitung dengan membagi total sel perlakuan dengan total sel kontrol negatif.
313
HASIL DAN DISKUSI
Tabel I. Hasil Penapisan Fitokimia
No Golongan Serbuk simplisia Ekstrak Air Ekstrak MeOH Ekstrak EtOAc Ekstrak n-Heksana 1 Alkaloid + - - - - 2 Flavonoid + + + + + 3 Saponin + + + + + 4 Tanin + + - + - 5 Kuinon + - - - - 6 Steroid/Triterpenoid + - + + + 7 Kumarin - - - - - 8 Minyak atsiri + - - - +
Gambar 1. Nilai LC50 Ekstrak Rimpang Temuputih
314
Diskusi
Penelusuran aktivitas biologik tertentu berdasarkan kandungan bahan bioaktif atau kelompok senyawa homolog merupakan peluang untuk pengembangan kandidat bahan baku obat atau bermanfaat sebagai zat identitas aktivitas biologis tumbuhan tersebut. Salah satu model eksplorasi untuk mencari senyawa bioaktif adalah fraksinasi/isolasi yang berpedoman hasil uji bioaktivitas (bioassay-guided fractionation) (Colegate, 1993). Uji bioaktivitas awal yang dapat dilakukan untuk memperoleh senyawa yang berpotensi sebagai anti tumor dimulai dengan uji ketoksikan terhadap larva udang, dengan nilai (LC50) kurang dari 1000 bpj
((Mclaughlin,1998), uji bioaktivitas dapat dilanjutkan dengan uji sitotoksisitas terhadap sel lestari tumor. Ekstrak Sel MDCK (sel tumor ginjal anjing) dan sel MCA-B1 (sel
tumor mulut anjing) adalah sel lestari tumor yang telah dikarakterisasi (Priosoeryanto, 1995) dan dapat digunakan sebagai model sel lestari untuk pengujian aktivitas antiproliferasi. Berdasarkan kajian pustaka yang dilakukan oleh Windono dan Parfati (2002) senyawa seskuiterpenoid yang terdapat dalam C zedoaria adalah golongan bisabolan (ar-turmeron, -turmeron, zingiberen, detetrahidro-ar-turmeron), eleman (-elemen, kurzerenon), germakran (germakron, kurdion, neokurdion, dehidrokurdion, furanodien, 13-hidroksigermakron, kurzeon), eudesman (kurkolonol), guaian (guaidiol, aerugidiol, kurkumol, kurkumenon, kurkumenol, isokurkumenol, prokurkumenol, epikurkumenol, zedoarondion, zedoarol, zedoaron) dan spirolakton (kurkumanolid A dan B).
KESIMPULAN
Hasil penapisan fitokimia pada serbuk simplisia dan ekstrak rimpang temuputih diperoleh bahwa pada serbuk simplisia dan semua ekstrak mengandung senyawa golongan flavonoid dan saponin. Daya toksikan tertinggi terhadap larva Artemia
salina diperoleh pada ekstrak n-heksana
dengan nilai LC50 sebesar 66 bpj. Nilai IC50 tertinggi diperoleh pada perlakuan ekstrak n-heksana dengan nilai IC50 terhadap sel MDCK sebesar 81,6 bpj dan terhadap sel MCA-B1 sebesar 77,4 bpj.
DAFTAR PUSTAKA
Colegate SM, Molyneux RJ. 1993. Bioactive natural products. CRC Press; 15-17,286-311.
Dalimartha S. Ramuan Tradisional untuk Pengobatan Kanker. Jakarta: PT Penebar Swadaya; 2001.h.1-7.
Farnsworth NR. Biological and Phytochemical Screening of Plant. J. Pharm.Sci.; 1986.h.225-265.
Gibbs JB. 2000. Mechanism-based target identification and drug discovery in cancer research. Science: 287:1969-1973.
Mclaughlin JL Rogers LL., Anderson JE. The use of biological assay to evaluater botanicals Drug Information Journal,
32. USA: Drug Information Association Inc; 1998.h.514-24.
Meyer BN, et al. Brine Shrimp: A Conventient General Bioassay for Active Plant Constituents. Planta Medika; 1982.h.31-34.
Murakami A, Morita H, Safitri R, Ramlan A, Koshimizu K, Ohigashi H. 1998. Screening for in vitro anti-tumor promoting activities of edible plants from Indonesia. Cancer Detect Prev 22 (6);516-525
Priosoeryanto BP, Tateyama S, Yamaguchi R, Uchida K. Establishment of a cell line (MCA-B1) derived from a canine oral acanthomatous epulis.. Research
315 in veterinary Science. 1995; 58.h.101-102.
Saputra K, Maat S, Soedoko R. 2000. Terapi biologi untuk kanker. Airlangga University Press.
Windono T, Parfati N. 2002. Curcuma zedoaria (Bergius) Roscoe Kajian pustaka dan aktivitas farmakologik. Artocarpus 2(1):1-10
