1
Produksi Poli-γ-Asam Glutamat dari Bacillus subtilis B112 dengan Variasi Konsentrasi Asam L-Glutamat Sebagai Sumber Karbon dalam Media Fermentasi
Abubakar Sidik1, Linar Z. Udin2 dan Safri Ishmayana1
1)
Jurusan Kimia, FMIPA Universitas Padjadjaran, Jln. Raya Bandung-Sumedang km. 21 Jatinangor 45363
2)
Puslit Kimia Terapan LIPI Bandung, Jln. Cisitu-Sangkuriang Bandung 40135
*)
Penelitian ini didanai oleh Dirjen Dikti Departemen Pendidikan Nasional dengan surat perjanjian pelaksanaan penelitian 031/SP2H/PP/DP2M/III/2007 tanggal 29 Maret 2007
ABSTRAK
Poli-γ-asam glutamat (PGA) dan hasil degradasinya aman bagi manusia sehingga dapat dimanfaatkan dalam industri makanan, kosmetik dan obat-obatan. Meskipun banyak digunakan pada berbagai bidang industri, bahan ini masih diimpor dari luar negeri. Oleh karena itu, perlu dikembangkan suatu proses untuk memproduksi PGA dalam jumlah yang banyak dan dengan kualitas yang baik. Penelitian ini dilakukan untuk mencari variasi konsentrasi sumber karbon yang dapat menghasilkan PGA dengan jumlah yang banyak dengan menggunakan Bacillus subtilis B112 sebagai mikroorganisme yang digunakan pada proses fermentasi. Metode penelitian yang dilakukan adalah proses produksi PGA dengan metode fermentasi lompok kemudian hasil fermentasi dianalisis beberapa parameternya. Analisis yang dilakukan meliputi pH, pertumbuhan bakteri, berat kering sel dan viskositas. Isolasi dilakukan dengan tahapan sentrifugasi, pengendapan dengan metanol, dialisis dan liofilisasi. Berat molekul dan komposisi asam amino PGA masing-masing ditentukan dengan menggunakan SDS PAGE dan KLT. Hasil penelitian menunjukan bahwa komposisi media fermentasi yang optimum untuk menghasilkan PGA adalah 3% asam L-glutamat. PGA yang diperoleh dengan variasi 3% asam L-glutamat adalah sebanyak 53,3 mg. Penentuan berat molekul dengan menggunakan SDS-PAGE menunjukan bahwa PGA yang dihasilkan memiliki berat molekul diatas 205 kDa.
Kata Kunci: Asam L-glutamat, B. Subtilis B112, PGA
Poly-γ-Glutamic Acid Production from Bacillus subtilis B112 with Variation of L-Glutamic Acid Concentration as Carbon Source in Fermentation medium
ABSTRACT
Poly- γ-glutamic acid (PGA) and its degradation products are save to human, so that it can be used in foods, cosmetics, and drugs industries. Even though this compound is widely used in various industries, this material is still imported. Because of this reason, it is needed to develop a process that can be used to produce PGA in large number and good quality. The objective of this research is to determine carbon concentration variation that can produce PGA in large amount by using B. subtilis B112 as microorganism that was used in fermentation process. PGA production was done by batch fermentation method and the fermentation results were then analyzed for some its characteristics. The analyses that were done are pH measurement, bacterial growth curve, dry cell mass, and viscosity. Isolation was done using centrifugation, precipitation with methanol, dialysis, and lyophilization. Molecular mass and amino acid composition of the isolated PGA was determined using SDS-PAGE and TLC, respectively. The results of our research shows that fermentation media that is optimum for PGA production is 3% of glutamic acid. Isolated PGA with 3% of L-glutamic acid in fermentation media was 53.3 mg. Molecular weight determination using SDS-PAGE showed that the PGA has a molecular weight more than 205 kDa.
2 PENDAHULUAN
Poli-γ-asam L-glutamat (PGA) merupakan salah satu produk bioteknologi yang dapat diaplikasikan pada berbagai bidang seperti industri makanan, kosmetik dan obat-obatan. Salah satu metode yang dapat dilakukan untuk memproduksi PGA adalah dengan metode fermentasi. Produk ini banyak digunakan di berbagai negara termasuk di Indonesia. Namun, meskipun Indonesia banyak menggunakan PGA sebagai salah satu bahan baku di industrinya, selama ini PGA masih diimpor. Pengembangan proses-proses yang berkaitan dengan produksi bahan-bahan produk fermentasi banyak dilakukan untuk mengoptimalkan produk yang diperoleh. Demikian juga untuk produksi PGA.
PGA merupakan suatu biopolimer yang dapat didegradasi oleh alam, terutama diproduksi oleh galur Bacillus subtilis (Kubota et al., 1993) Polimer ini diklasifikasikan sebagai pseudo-poli asam amino yang hanya mengandung glutamat sebagai monomernya, baik asam D-glutamat maupun asam L-glutamat (Cormwick & Gross, 1995). PGA terbentuk dari monomer glutamat melalui ikatan α-amino dan γ-asam karboksilat (Goto & Kunioka, 1992).
Penelitian mengenai produksi PGA dengan metode fermentasi telah dilakukan di Laboratorium Biokimia FMIPA Unpad bekerjasama dengan Puslit Kimia terapan LIPI dengan menggunakan bakteri B. subtilis dengan berbagai strain yang berbeda. Hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa B. subtilis B112 menghasilkan PGA dengan hasil terbaik. Oleh karena itu perlu dilakukan optimasi produksi, salah satunya adalah dengan mengatur komposisi media fermentasi sehingga dapat diperoleh PGA dengan kualitas dan kuantitas yang lebih baik.
Poli- γ-asam L-glutamat dapat dihasilkan oleh berbagai organisme, seperti bakteri, sianobakteri dan biji tumbuhan. Beberapa bakteri dapat menghasilkan PGA di luar sel (Troy, 1973, Goto & Kunioka, 1992). PGA dapat larut dalam air dan bersifat dapat diuraikan secara biologis (biodegradable) dengan berat molekul yang relatif tinggi, yaitu sekitar 100.000-1.000.000. PGA dapat digunakan sebagai bahan pengental, pelepas berjangka (sustained release), pembawa obat (drug carier) sertas dalam industri makanan, kosmetik dan obat-obatan (Kunioka & Goto, 1994).
Polimer PGA juga diharapkan dapat menjadi sumber baru dalam industri yang biodegradable. Sebagai contoh Yahata et al. (1992) melaporkan bahwa PGA benzil ester dapat dimanfaatkan sebagai serat dengan kualitas dinamik yang bagus dan Kunioka (1996) melaporkan manfaat lain dari PGA yaitu sebagai hidrogel yang dibuat melalui irradiasi-γ di dalam larutan PGA.
3
Tujuan penelitian ini adalah untuk menentukan pengaruh variasi konsentrasi asam L-glutamat sebagai sumber karbon dalam media fermentasi terhadap pembentukan PGA oleh bakteri B. subtilis B112 pada media fermentasi glutamat-sitrat.
METODE PENELITIAN Pemeliharaan kultur
B. subtilis B112 ditumbuhkan oada media agar miring yang mengandung 0,5 g
natrium klorida, 0,5 g bakto pepton, 0,3 g ekstrak daging, dan 2,7 g agar bakto. Semua bahan dicampur dakam 100 mL air suling, dipanaskan sampai larut. Kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak ± 5 mL dan ditutup dengan kapas, disterilisasi selama 20 menit pada suhu 121oC dengan tekanan 15 psi. Selanjutnya tabung reaksi ini dimiringkan dan didiamkan sampai menjadi padat. Media agar miring tersebut selanjutnya ditanami B. subtilis B112 dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Setelah dibiakan dalam media agar miring, B. subtilis B112 disuspensikan dengan air suling steril untuk kemudian dibiakan secara aerob dalam media inokulum.
Aktivasi kultur
Media inokulum mengandung 0,3 g polipepton, 0,06 g ekstrak ragi, 0,03 g magnesium sulfat heptahidrat dan dilarutkan dalam 30 mL air suling serta disterilisasi dalam autoclave selama 20 menit pada asuhu 121oC dengan tekanan 15 psi. Ke dalam media inokulum yang telah steril ditambahkan 3 mL suspensi B. subtilis B112 dan dikocok selama 24 jam dengan kecepatan 150 rpm dan suhu 37oC. Media inokulum yang telah teraktivasi ini kemudian ditambahkan 30 mL larutan gliserol 20% (b/v) dan dipanaskan pada suhu 60oC selama 10 menit. Untuk penyimpanan dalam waktu yang cukup lama kultur bakteri dalam media inokulum ini dapat disimpan pada suhu -20oC.
Fermentasi
Media yang telah diaktivasi disubkultur ke dalam media fermentasi yang mengandung glutamat-sitrat dengan variasi asam L-glutamat, yaitu 0; 1; 2 dan 3%. Zat lain yang ditambahkan pada masing-masing konsentrasi tersebut adalah 0,5 g amonium sulfat, 2 g asam sitrat, 0,1 g kalium dihidrogen fosfat, 0,05 g natrium dihidrogen fosfat dihidrat, 0,05 g magnesium sulfat heptahidrat, 0,002 g mangan sulfat monohidrat, 0,05 g besi (III) klorida heksahidrat, 0,02 kalsium klorida dan 50 g biotin dan dilarutkan dalam 100 mL air suling. Media fermentasi ini diatur pH-nya sampai 7,5 dengan menggunakan natrium hidroksida dan disterilisasi selama 20 menit pada suhu 121oC dengan tekanan 15 psi. Media fermentasi yang telah steril ditambahkan kultur bakteri yang telah diaktivasi dalam
4
media inokulum dan kemudian dikocok pada kecepatan 150 rpm dan suhu 37oC. Pengambilan sampel dilakukan setiap 12 jam mulai dari jam ke-0 sampai jam ke-96. Isolasi PGA
Pengendapan dengan pelarut organik
Supernatan ditambahkan empat volume metanol, kemudian dibiarkan semalam, selanjutnya disentrifugasi selama 15 menit pada 4000 rpm untuk mengumpulkan endapan. Endapan ini dilarutkan dalam air suling (0,5 gram/ 100 mL) kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 4500 rpm selama 15 menit.
Dialisis
Supernatan yang diperoleh dimasukkan ke dalam membran selofan dan dialisis dalam air suling sampai semua garam-garam pengotornya keluar.
Liofilisasi
Ekstrak hasil dialisis kemudian diliofilisasi dengan menggunakan alat pengering beku dan diperoleh ekstrak PGA.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Perubahan pH Media dengan Variasi Konsentrasi Asam L-glutamat
Perubahan nilai pH untuk keempat variasi konsentrasi asam L-glutamat yang dilakukan, cenderung konstan, yaitu berkisar antara 6,29 dan 7,64. Dari Gambar 3 terlihat bahwa pada jam ke-0 dan dan jam ke-12 pH media fermentasi menurun. Penurunan pH ini disebabkan bakteri B. subtilis B112 hasil aktivasi mengalami proses adaptasi dengan media fermentasi. Hal tersebut dapat dilihat dari kurva pertumbuhan bakteri (Gambar 4), dimana bakteri langsung memasuki fasa eksponensial tanpa mengalami fase adaptasi yang panjang. Fase adaptasi dipersingkat karena bakteri terlebih dahulu diaktivasi pada media inokulum. Setelah jam ke-24, pH media cendrung mengalami kenaikan. Hal ini dapat disebabkan karena asam L-glutamat yang terdapat pada media dibentuk menjadi PGA, sehingga jumlah asam bebas di dalam media berkurang dan menyebabkan naiknya pH media.
Pertumbuhan B. subtilis B112 dengan Variasi Konsentrasi Asam L-Glutamat
Pertumbuhan bakteri pada media fermentasi memiliki pola yang sama untuk keempat variasi yang dilakukan. Keempat variasi menunjukan fasa adaptasi yang pendek, hal ini dikarenakan baktri yang ditambahkan ke dalam media fermentasi sudah diaktifkan terlebih dahulu dalam media inokulum. Peningkatan pertumbuhan ini disebabkan karena bakteri mengalami pembelahan sel. Pada jam ke-12 sampai jam ke-48 semua perlakuan
5
menunjukkan terjadinya fase eksponensial, yang ditunjukan dengan meningkatnya kurva pertumbuhan. Pada jam ke-60, hampir semua kurva menunjukan terjadinya fasa stasioner menuju kematian, kecuali untuk variasi 3% asam L-glutamat yang masih mengalami fase eksponensial. Terjadinya hal tersebut dimungkinkan karena perbedaan ketersediaan nutrien diantara ke empat variasi tersebut. Ketika nutrien yang tersedia berkurang pada variasi konsentrasi glutamat yang lain, pada variasi glutamat 3%, nutrien masih tersedia, sehingga masih dapat tumbuh. Setelah nutrien yang tersedia habis, maka pertumbuhan sel akan terhenti dan mulai memasuki fase kematian.
5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 Waktu Fermentasi (jam)
p H m e d ia 0% glutamat 1% glutamat 2% glutamat 3% glutamat
Gambar 3 Perubahan pH media dengan berbagai konsentrasi asam L-glutamat selama proses fermentasi produksi PGA dengan B. subtilis B112
0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 Waktu Fermentasi (jam)
OD 660 0% glutamat 1% glutamat 2% glutamat 3% glutamat
Gambar 4 Kurva pertumbuhan B. subtilis B112 dalam media dengan berbagai konsentrasi asam L-glutamat
6
Berat Kering Sel dengan Variasi Konsentrasi Asam L-Glutamat
Berat kering sel untuk semua perlakuan media fermentasi menunjukan pola yang mirip dengan kurva pertumbuhan. Pada jam ke-12 sampai jam ke 60 terjadi fase eksponensial. Setelah melewati jam ke-60, mulai memasuki fase stasioner dan kematian.
Kemiripan yang terutama terjadi pada variasi 3% asam L-glutamat. Pada konsentrasi tersebut, pola sama dengan yang terjadi pada kurva pertumbuhan, yaitu ketika variasi lainnya mulai memasuki fasa stasioner dan kematian, pada variasi 3% asam L-glutamat, berat kering sel nya masih meningkat.
0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 Waktu Fermentasi (jam)
Be ra t Ke ri n g Se l (g ) 0% glutamat 1% glutamat 2% glutamat 3% glutamat
Gambar 5 Berat kering sel pada media fermentasi dengan berbagai konsentrasi asam L-glutamat 0,92 0,94 0,96 0,98 1,00 1,02 1,04 1,06 1,08 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 Waktu Fermentasi (jam)
v is k o s it a s (c P) 0% glutamat 1% glutamat 2% glutamat 3% glutamat
Gambar 6 Nilai viskositas media fermentasi dengan berbagai konsentrasi asam L-glutamat yang ditentukan dengan metode Otswald
Perubahan Viskositas dengan Variasi Konsentrasi Asam L-Glutamat
PGA yang diproduksi oleh B. subtilis merupakan produk ekstraseluler yang disekresikan sebagai cairan kental (Kunioka & Goto, 1994). Oleh karena itu derajat
7
kekentalan media hasil produksi dapat dijadikan indikator terbentuknya produk PGA pada media fermentasi. Semakin kental larutan media, mengindikasikan bahwa produk PGA yang terbentuk juga semakin banyak. Oleh karena itu untuk menentukan variasi mana yang menghasilkan PGA paling banyak, maka dilakukan pengukuran viskositas sampel.
Penambahan asam L-glutamat sebesar 3%, menunjukan harga viskositas yang lebih tinggi dibandingkan dengan variasi lainnya. Nilai viskositas tertinggi terjadi pada konsentrasi asam L-glutamat 3% pada waktu fermentasi 48 jam, yaitu sebesar 1,0646. Hal ini menunjukkan bahwa penambahan asam L-glutamat dapat meningkatkan biosintesis PGA. Asam L-glutamat yang merupakan unit penyusun PGA sangat diperlukan dalam media fermentasi. Meskipun demikian, B. subtilis juga dapat memproduksi asam L-glutamat intraselule yang juga dapat digunakan untuk biosintesis PGA.
Isolasi PGA Hasil Fermentasi dengan Variasi Konsentrasi Asam L-Glutamat
Pengambilan sampel untuk mendeteksi PGA dengan elektroforesis SDS-PAGE dan kromatografi lapis tipis dilakukan berdasarkan nilai viskositas yang paling tinggi untuk setiap variasi konsentrasi asam L-glutamat.
Tabel 1 Nilai viskositas dan perolehan ekstrak PGA pada berbagai konsentrasi asam L-glutamat dalam media fermentasi
Konsentrasi L-asam L-glutamat (%) Waktu Fermentasi (Jam) Viskositas (cP) Ekstrak PGA (mg) 0 24 1,0027 18,4 1 48 1,0067 38,4 2 96 1,0193 51,6 3 48 1,0646 53,3
Pada nilai viskositas yang tertinggi dilakukan pengendapan dengan menggunakan empat volume metanol, kemudian disentrifugasi, dialisis dan diliofilisasi sehingga diperoleh ekstrak PGA. Ekstrak PGA ini dideteksi berat molekulnya dengan menggunakan elektoforesis SDS-PAGE dan monomer asam L-glutamatnya dideteksi menggunakan kromatografi lapis tipis setelah ekstrak PGA terlebih dahulu dihidrolisis dengan menggunakan HCl 6 N. Hasil isolasi PGA (Tabel 1) menunjukkan bahwa PGA paling banyak diperoleh pada konsentrasi asam L-glutamat 3% dan waktu fermentasi 48 jam. Nilai viskositas pada variasi tersebut juga mengindikasikan bahwa PGA paling banyak diproduksi pada variasi tersebut.
8 1 2 3 4 5 205 kDa 116 kDa 97,4 kDa 66 kDa 45 kDa 29 kDa PGA
Elektroforesis SDS-PAGE PGA Hasil Fermentasi dengan Variasi Konsentrasi Asam L-Glutamat
Menurut Yamaguchi et al. (1996), PGA memiliki berat molekul 275 kDa dan pita PGA berada di atas marker miosin. Pada penelitian ini diperoleh hasil elektroforesis yang mendekati dengan hasil yang diperoleh Ito et al. (1996) dimana pita PGA berada di atas marker myosin (205 kDa) dan diperkirakan berat molekul PGA tersebut sekitar 275 kDa (Gambar 7).
Dari Gambar 4.5 dapat dilihat bahwa PGA terdeteksi pada media fermentasi yang mengandung asam L-glutamat, sedangkan pada media fermentasi yang tidak mengandung asam L-glutamat tidak terdeteksi adanya pita di atas marker miosin. PGA yang dihasilkan dari isolasi dengan methanol ini masih belum murni. Hal ini dapat terlihat dari adanya pita-pita protein lain, terutama diantara berat molekul 45 dan 66 kDa. Diduga pita-pita-pita-pita protein tersebut merupakan enzim-enzim yang berperan dalam pembentukan PGA yang turut terdeteksi. Salah satu enzim yang terdeteksi adalah PGA hidrolase yang mempunyai berat molekul sebesar 68 kDa. Enzim ini dapat mendegradasi PGA menjadi asam L-glutamat pada waktu pertumbuhan sel (Tanaka et al., 1993).
Gambar 7 SDS PAGE hasil pembentukan PGA pada berbagai konsentrasi asam L-glutamat. Lajur 1 protein standar; lajur 2=0% asam L-glutamat; lajur 3=1% asam L-glutamat; lajur 4=2% asam L-glutamat; lajur 5=3% asam L-glutamat.
9
1 2 3 4 5
Kromatografi Lapis Tipis PGA Hasil Fermentasi dengan Variasi Konsentrasi Asam L-Glutamat
Gambar 8 Kromatogram hasil hidrolisis PGA produk fermentasi dengan variasi konsentrasi asam L-glutamat. Eluen yang digunakan butanol:asam asetat:air suling (4:1:1). Lajur 1= standar asam L-glutamat; lajur 2= 0% asam L-glutamat; lajur 3= 1% asam L-glutamat; Lajur 4= 2% asam L-glutamat; Lajur 5= 3% asam L-glutamat.
Hasil yang diperoleh pada kromatografi lapis tipis adalah deteksi unit monomer pembentuk PGA, yaitu asam L-glutamat. Ekstrak PGA terlebih dahulu dihidrolisis dengan HCl 6 N untuk memecah ikatan peptida pada PGA. Pada hasil KLT (Gambar 8) terlihat bahwa semua variasi konsentrasi mengandung asam L-glutamat sebagai monomer pembentuk PGA. Pada ekstrak PGA hasil fermentasi tanpa penambahan asam L-glutamat terdeteksi noda asam L-glutamat. Diduga asam L-glutamat yang yang terdeteksi ini merupakan asam L-glutamat intraseluler yang tidak terpolimerisasi karena tidak adanya enzim-enzim pembentuk PGA. Enzim-enzim pembentuk PGA dapat teraktivasi dengan adanya penambahan asam L-glutamat secara ekstraseluler yang ditambahkan pada media fermentasi.
Penampakan noda-noda asam L-glutamat pada KLT ini menunjukkan bahwa B.
subtilis B112 dapat memproduksi asam L-glutamat intraseluler pada semua variasi
konsentrasi asam L-glutamat dalam media fermentasi glutamat-sitrat dan PGA yang diproduksi hanya dapat terbentuk dengan adanya penambahan asam L-glutamat ke dalam media fermentasi.
10 KESIMPULAN DAN SARAN
Dari hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan dengan menggunakan konsentrasi asam glutamate sebesar 3%, diperoleh kondisi optimum produksi PGA. Pada kondisi ini diperoleh nilai viskositas tertinggi, yaitu 1,0646 cP dan ekstrak PGA senbanyak 53,3 g. Hasil SDS-PAGE menunjukan bahwa bakteri B. subtilis B112 dapat memproduksi PGA dengan berat molekul diatas 205 kDa dengan penambahan asam glutamat pada media fermentasi. Tanpa penambahan asam glutamat, tidak terdeteksi adanya PGA yang terbentuk.
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk menentukan kondisi optimum lainnya, sehingga diperoleh suatu kondisi optimum yang dapat menghasilkan PGA dalam jumlah dan kualitas yang lebih baik.
UCAPAN TERIMAKASIH
Penelitian ini didanai oleh Dirjen Dikti Departemen Pendidikan Nasional dengan surat perjanjian pelaksanaan penelitian 031/SP2H/PP/DP2M/III/2007 tanggal 29 Maret 2007. Oleh karena itu kami mengucapkan terimakasih kepada Dirjen Dikti yang telah menyediakan dana tersebut sehingga penelitian ini dapat terlaksana.
DAFTAR PUSTAKA
Cromwick, A.M. & Gross, R.A. 1995. Effects of manganese (II) on Bacillus licheniformis ATCC 9945A physiology and γ-poly(glutamic acid) formation. Int. J. Macromol. 17. 259-267. Goto, K. & Kunioka, M. 1992. Biosynthesis and hydrolysis of poly (-γ-glutamic acid) from
Bacillus subtilis IFO 3335. Biosci. Biotech. Biochem. 56: 1031-1036
Ito, T., Tanaka, T., Ohmaci, T. & Asads, Y. 1996. Glutamic acid independent production of poly-(γ-glutamic acid) by B. subtilis TAM-4. Biosci. Biotech. Biochem. 60(8): 1239-1242. Kunioka, M. & Goto, A. 1994. Biosynthesis of poly (γ-glutamic acid) from L-glutamic acid, citric
acid and amonium sulphate in B. subtilis IFO3335. Appl. Microbiol. Biotech.. 40. 867-872. Kunioka, M. 1996. Biodegradable hydrogels prepared from microbial poly (amino acid)s.
Proceeding of The International Workshop on Green Polymers. 390.
Kubota, H., Matsunobu, T., Uotani, K., Takebe, H. Satioh, A., Tanaka, T. & Taniguchi, M. 1993. Production of poly (γ-glutamic acid) by B. subtilis F-2-01. Biosci. Biotech. Biochem. 57. 1212-1213.
Tanaka, T., Yaguchi, T., Hiruta, O., Futamura, K., Uotami, K., Satoh, A. & Taniguchi, M. 1993. Screening for microorganisms having poly(γ-glutamic acid) endohydrolase activity and the enzyme production by Myrothecium sp. TM42222. Biosci. Biotech. Biochem. 57: 1808-1810.
Troy, F.A. 1973. Chemistry and biosynthesis of the poly (γ-D-glutamyl) capsule in B. subtilis. 1. Properties of the Membrane-mediated biosynthesis reaction. J. Biol. Chem. 248. 305-315. Yahata, K., Sadanobu, J. & Endo T. 1992. Preparation of poly-benzyl-γ-glutamic acid fiber. Polym.
Prepr. Jpn. 41.1077-1082.
Yamaguchi, F., Ogawa, Y., Kikuchi, M., Yuasa, K. & Motai H. Detection of γ-polyglutamic acid(γ-PGA) by SDS-PAGE. Biosci. Biotech. Biochem. 60. 255-258.
