Analisis Penanda RAPD (Random Amplifield Polymorphic DNA ) Untuk Analisis Keragaman Genetik Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) Sumatera Utara

(1)

Lampiran 1. Gambar Sampel Aksesi Andaliman

Gambar Andaliman Dairi

(2)

(3)

Lampiran 2. Pembuatan Larutan Stok dan Buffer

A. Pembuatan Larutan Stok

• CTAB 5 % (100 ml):

Timbang NaCl sebanyak 2.0 gram dan CTAB sebanyak

5.0 gram. Masukkan bahan kimia ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 100 ml

aquades. Aduk campuran larutan dengan menggunakan stirrer kemudian

diletakkan diatas hote plate.

• Tris HCl 1 M pH 8.0 (100 ml):

Timbang Tris sebanyak 12.114 gram.

Masukkan Tris ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades. Aduk

campuran larutan dengan menggunakan stirrer kemudian diletakkan diatas hote

plate. Selanjutnya, ditambahkan 4.2 ml HCl pekat sedikit demi sedikit sampai pH

mencapai 8. Masukkan ke dalam gelas ukur, kemudian volume ditepatkan

dengan aquades hingga volume larutan menjadi 100 ml.

• Tris HCl 1 M pH 7.4 (50 m):

Timbang Tris sebanyak 6.057 gram. Masukkan

Tris ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 30 ml aquades. Aduk campuran

larutan dengan menggunakan stirrer kemudian diletakkan diatas hote plate.

Selanjutnya, ditambahkan NaOH 2.5 M sedikit demi sedikit sampai pH mencapai

7.4. Masukkan ke dalam gelas ukur, kemudian volume ditepatkan dengan

aquades hingga volume larutan menjadi 50 ml.

• EDTA O.5 M pH 8.0 (100 ml):

Timbang EDTA sebanyak 18.612 gram dan

(4)

• NaCl 5 M (l00 ml):

Timbang NaCl sebanyak 29.22 gram. Masukkan ke dalam

erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades. Aduk campuran larutan dengan

menggunakan stirrer kemudian diletakkan diatas hote plate. Masukkan ke dalam

gelas ukur, kemudian volume ditepatkan dengan aquades hingga volume larutan

menjadi 100 ml.

**Semua bahan di atas disterilkan dengan menggunakan autoklaf kecuali CTAB 5%.

B. Pembuatan Larutan Buffer

• Buffer Ekstraksi/CTAB (100 ml):

Campurkan

40 ml CTAB 5%, 25.1 ml NaCl

5 M, 4 ml EDTA 0.5 M pH 8.0, 10 ml Tris HCl 1 M pH 8.0 dan 20.8 ml aquades.

• Buffer TAE 50 X (100 ml):

Campurkan 24.2 ml Tris HCl 1 M pH 7.4, 5.7 ml

Asam Asetat Glasial, 10 ml EDTA 0.5 M PH 8.0, dan aquades hingga volume

larutan menjadi 100 ml.

• Buffer TAE 1X (500 ml):

Campurkan 10 ml Buffer TAE 50 X dan 490 ml

aquades.

• Buffer TE (50 ml):

Campurkan 0.5 ml Tris HCl 1 M PH 8.0, 0.1 ml EDTA 0.5

M PH 8.0 dan 49.4 ml aquades.

• Kloroform Isoamilalkohol 24 : 1 (50 ml):

Campurkan 48 ml Kloroform dan 2

ml Isoamilalkohol.

(5)

Lampiran 3. Alur Penelitian

Sampel DNA Andaliman

Isolasi DNA

Uji Kualitas

Uji Kuantitas

Proses PCR-RAPD

Elektroforesis

(6)

Lampiran 4. Proses Isolasi DNA

Sampel daun andaliman ditimbang 0.2 gram dan digerus sambil

ditambahkan nitrogen cair dan PVPP

Sampel dimasukkan ke dalam tabung yang bberisi 1 ml buffer

ekstraksi dan 10 µl β-mercaptoetanol

Tabung di vortex dan diinkubasi dalam waterbath selama 30

menit pada suhu 65

0

C

Supernatan ditambahkan 1 ml KIAA (24:1) dan disentrifus

dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit

Supernatan ditambahkan 1 ml KIAA (24:1) dan disentrifus

dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit

Supernatan ditambahkan 1 ml isopropanol dan diinkubasi pada

suhu 4

0

C selama semalama

Tabung disentrifus pada pada kecepatan 13.000 rpm selama 10

menit dan dikeringkan

Pelet dilarutkan dengan buffer TE 100µl

Campuran ditambahkan dengan etanol absolute dingin dan

diinkubasi dalam freezer (-20

0

C) selama 30 menit

Campuran disentrifus dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit

Pelet dicuci dengan etanol 70% dan dikeringkan

Pelet dilarutkan dengan 100 µl buffer TE

(7)

Lampiran 4. Proses PCR-RAPD

Komposisi Master Mix volume 25 µl :

Go Taq PCR 12.5 µl

Nuclease free water 9.5 µl

Primer 1 µl

DNA sampel 2 µl

Running PCR sebanyak 45 siklus :

Denaturasi awal 94

0

C 2 menit

Denaturai 94

0

C 1 menit

Annealing 36

0

C 1 menit

Extension 72

0

C 2 menit

Post extension 72

0

C 10 menit

Kondisi akhir PCR 4

0

C tak terbatas

(8)

Lampiran 5. Proses elektroforesis hasil PCR-RAPD

Agar rose 2.6 gram ditambahkan

dengan 130 ml buffer TAE 1 x

Campuran dipanaskan dengan hot

plate

Campuran ditambahkan 1.5 µl EtBr

Larutan gel dituang kedalam cetakan

yang telah dipasang sisir

Gel yang telah mengeras

dipindahkan ke dalam chamber

berisi buffer TAE 1 x

Sampel hasil PCR, marker dan

loading dye dimasukkan ke dalam

sumur gel dengan perbandingan

(8:5:2)

Alat elektroforesis dihubungkan

dengan power supply 80 volt

(9)

Lampiran 6. Foto Uji Kuantitas

Gambar 10. Alat spektrofotometer

(10)

(11)

Lampiran 8. Hasil Fotosintesis

Gambar 12. Hasil elektoroforesis dengan Primer OPD-13

Gambar 13. Hasil elektroforesis dengan Primer OPI-20

(12)

Gambar 14. Hasil elektoforesis dengan Primer OPN-10

(13)

Lampiran 9. Hasil Skoring Pita 30 Individu Pada Kelima Primer

Tabel 5. Hasil scoring pita andaliman pada kelima primer

(14)

5 0 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

6 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

OPM-

01 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1

4 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1

5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1

6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0

(15)

(16)

Lampiran 11. Faktorial Koordinat

Tabel 13. Faktorial Analisis (PCoA)

Axis Axis 2 Axis 3 Axis 4 Axis 5