2.6. Aktivitas anti-venom dan netralisasi venom 2.6.1. Aktivitas proteolitik
Proses penghambatan kasein pencernaan yang disebabkan oleh venom cobra dan russell’s viper oleh daun biru dan hijau Vitex negundo yang digunakan sebagai ukuran aktivitas penghambatan proteolitik yang [20]. Sebuah larutan yang dibuat dari 1% kasein (b/v) dalam 20 mM buffer fosfat mM (mengandung 150 mM NaCl, pH 8) diinkubasi dengan konsentrasi yang berbeda (protein mg/ ml) dari ekstrak tanaman (100-500μg) bersama dengan venom cobra dan russell’s viper selama1 jam pada 37°C. Setelah itu, ditambahkan 0,5 ml 10% TCA dan konsentrasi protein dalam supernatan ditentukan pada 625 nm. Aktivitas proteolitik dihitung menggunakan tripsin sebagai protease standar.
2.6.2. Aktivitas prokoagulan
Aktivitas prokoagulan diuji sesuai dengan metode yang dijelaskan sebelumnya sebagaimana telah diubah dengan studi lain [21].
Sejumlah jenis venom (racun) yang dilarutkan dalam normal saline, ditambahkan ke plasma sitrat manusia pada 37oC. Dicatat waktu pembekuan dan dosis koagulan minimum (MCD) yang ditentukan sebagai dosis racun yang diinduksi dari pembekuan plasma dalam 60 detik. Dalam pengujian netralisasi, jumlah konstan venom cobra dan russell’s viper dicampur dengan berbagai pengenceran ekstrak tumbuhan (1.2, 1.4, 1.6, 1.8, dan 2.0 mg/ml). Selanjutnya, campuran diinkubasi selama 30 menit pada 37oC. Kemudian, 0.1ml campuran ditambahkan ke 0.3 ml plasma sitrat dan waktu pembekuan dicatat. Dalam tabung kontrol, plasma diinkubasi baik dengan racun atau ekstrak tanaman saja. Netralisasi didefinisikan sebagai dosis efektif yang dapat benar-benar menetralisir aktivitas koagulan.
2.6.3. Aktivitas fosfolipase A2
Aktivitas fosfolipase A2 diukur menggunakan uji hemolitik langsung di plat kuning telur gel agarosa oleh metode yang dijelaskan dalam penelitian lain [22]. Peningkatan dosis racun cobra dan russell’s viper yang ditambahkan hingga 3 mm sumur pada gel agarose (0,8% dalam PBS, pH 8,1) yang mengandung 1,2% eritrosit domba, 1,2% kuning telur sebagai sumber lesitin dan 10 mM CaCl2. Plat diinkubasi semalam pada suhu 37oC dan diukur diameter dari halo hemolitik. Minimum Indirect Hemolytic Dose (MIHD) menunjukkan dosis racun yang menghasilkan halo hemolitik dengan diameter 11 mm. Kemampuan ekstrak tanaman dalam menetralisir aktivitas fosfolipase adalah ditentukan dengan mencampur jumlah konstan racun dengan berbagai jumlah ekstrak tumbuhan (0,6, 0,8, 1,0, 1,2 dan 1.4mg / ml) dan diinkubasi pada 37oC selama 30 menit. Kemudian aliquot dari 10μl dari campuran ditambahkan ke sumur gel agarose kuning telur-eritrosit domba. Plat diinkubasi pada suhu 37oC selama 20 jam. Netralisasi dinyatakan sebagai konsentrasi ekstrak tumbuhan yang dapat mengurangi 50 % halo hemolitik jika dibandingkan dengan efek induksi oleh racun sendiri. 2.6.4. Aktivitas fibrinolitik
Daftar Pustaka [20] Doley R, Mukherjee AK, Toxicon, 2003, 41(1), 81-91.
[21] Laing GD1, Theakston RD, Leite RP, Da Silva WD, Warrell DA, Toxicon, 1992, 30(10), 1219-25.
[22] Theakston RDG, Reid HA, Bull World Health Org, 1983, 61, 949-956. [23] Gutierrez JM, Avila C, Rojas E, Cerdas L, Toxicon, 1988, 26: 411-413
[24] Rojas G, Gutierrez JM, Gene JM, Gomez M, Cerdes I, Revista de Biologia Tropical,
