1 DETEKSI VIRUS AVIAN INFLUENZA DENGAN UJI HI PADA
SAMPEL DARAH AYAM DI BALAI KARANTINA PERTANIAN KELAS 1 JAMBI
KARYA TULIS ILMIAH
REZA NUGRAHA E0F116011
PROGRAM STUDI DIPLOMA III KESEHATAN HEWAN FAKULTAS PETERNAKAN
UNIVERSITAS JAMBI 2021
“DETEKSI VIRUS AVIAN INFLUENZA DENGAN UJI HI PADA SAMPEL DARAH AYAM DI BALAI KARANTINA PERTANIAN KELAS 1 JAMBI”
KARYA TULIS ILMIAH
Oleh:
2 REZA NUGRAHA
E0F116011
Telah Diuji Dihadapan Tim Penguji
Pada hari Senin, Tanggal 07 bulan Juni Tahun 2021 dan dinyatakan Lulus Ketua : Dr. drh. Sri Wigati, M.Agr. Sc.
Anggota : 1. Drh. Anie Insulistyowati, M.P.
: 2. Ir. Sestilawarti, M.P Menyetujui:
Dosen Pembimbing
PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa Karya Tulis Ilmiah (KTI) saya dengan judul “deteksi virus avian influenza dengan uji HI pada sampel darah ayam di Balai Karantina Pertanian Kelas 1 Jambi” adalah karya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks yang dicantumkan dalam bentuk daftar pustaka di bagian akhir dari karya tulis ilmiah ini sesuai dengan kaidah penulisan ilmiah yang berlaku.
Dr. drh. Sri Wigati, M.Agr. Sc.
NIP. 196208311989022001 Tanggal :
Wakil Dekan Bidang Akademik, Ketua Program Studi DIII Kerjasama dan Sistem Informatika Kesehatan Hewan
Fakultas Peternakan Fakultas Peternakan
Universitas Jambi Universitas Jambi
Dr. Ir. Syafwan, M.Sc. Dr. drh. Hj. Fahmida Manin, M.P.
NIP. 196902071993031003 NIP. 196208311989022001
Tanggal : Tanggal :
3 Jambi, Juni 2021
Reza Nugraha
4 RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Desa Sungai Gebar Barat pada tanggal 26 Juli 1998, sebagai anak ketiga dari tiga bersaudara dari pasangan Legiman dan Sulimah. Penulis menyelesaikan pendidikan dasar di SDN 05/V Sungai Gebar pada tahun 2010, pendidikan menengah pertama di MTS Salafiyyah Sungai Gebar pada tahun 2013, dan pendidikan menengah atas di MAN 1 Kuala Tungkal pada tahun 2016.
Tahun 2016 penulis diterima sebagai mahasiswa di Program Studi Diploma III Kesehatan Hewan Universitas Jambi melalui jalur Ujian Masuk Bersama (UMB).
Tanggal 01 Februari sampai dengan 29 Maret tahun 2019 penulis melaksanakan Praktek Kerja Lapang di Balai Karantina Pertanian Kelas 1 Jambi. Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Ahli Madya, penulis melakukan penulisan Karya Tulis Ilmiah dengan judul “Deteksi virus avian influenza dengan uji HI pada sampel darah ayam di Balai Karantina Pertanian Kelas 1 Jambi” dibawah bimbingan Dr. drh. Sri Wigati, M.Agr. Sc.
Jambi, Juni 2021
Reza Nugraha
DETEKSI VIRUS AVIAN INFLUENZA DENGAN UJI HI PADA SAMPEL DARAH AYAM DI BALAI KARANTINA PERTANIAN KELAS 1 JAMBI
5 Disajikan Oleh : Reza Nugraha
Dibawah bimbingan Dr. drh. Sri Wigati, M.Agr. Sc.
Program Studi Kesehatan Hewan Fakultas Peternakan Universitas Jambi Jln. Jambi-Ma.Bulian KM. 15 Mendalo Darat Jambi
RINGKASAN
Avian Influenza (AI) atau yang lebih dikenal dengan flu burung disebabkan oleh virus influenza yang bermutasi menjadi patogen. Kegiatan ini bertujuan untuk mendeteksi keberadaan virus AI pada ayam yang akan dikirim keluar dari provinsi Jambi. Uji HA (Haemaglutination Assay) dan HI (Haemaglutination Inhibition), merupakan uji yang bertujuan untuk mendeteksi antibodi terhadap virus Avian Influenza. Materi yang digunakan 15 sampel serum darah ayam. Antigen AI (standar), PBS dan RBC 1%. Prinsip Uji HA adalah aglutinasi yang bertujuan untuk mengukur titer antigen dan prinsip uji HI adalah hemaglutinasi yang bertujuan untuk mengukur titer antibodi. Hasil dari pengujian HA untuk penentuan titer antigen AI 4 HAU adalah 160 µl pada pengenceran26dan 320 µl pada pengenceran 27. Hasil dari uji HI rata rata nilai titer 22 dan 23 yaitu menunjukkan bahwa dari 15 sampel serum darah ayam yang diperiksa tidak mengandung titer antibody terhadap virus Avian Influenza.
Dapat disimpulkan bahwa ayam tersebut tidak pernah terpapar oleh virus Avian influenza.
Kata kunci: Avian Influenza, uji haemaglutination assay, uji haemaglutination inhibition
PRAKATA
Puji syukur kepada Allah SWT atasrahmatNya yang melimpah, sehingga penulisan Karya Tulis Ilmiah (KTI) dapat diselesaikan dengan baik.dalam penulisan
6 Karya Tulis Ilmiah ini, tentu tak lepas dari pengarahan dan bimbingan dari berbagai pihak. Maka pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan rasa hormat dan terima kasih kepada:
1. Prof. Dr. Ir. Agus Budiansyah M.S. selaku Dekan Fakultas Peternakan Universitas Jambi.
2. Dr. drh. Fahmida Manin, M.P, selaku ketua Program Diploma III Kesehatan Hewan Fakultas Peternakan Universitas Jambi.
3. Dr. drh. Sri Wigati, M.Agr. Sc selaku Pembimbing
4. Drh. Hendra Purwana, MM selaku Subkoordinator Substansi Karantina Hewan 5. Drh. Haris, drh Angga, drh Fitria, drh Yulia Ariza selaku Dokter hewan di Balai
Karantina Pertanian Kelas 1 Jambi
6. Kedua orang tua tercinta Bapak Legiman dan Ibu Sulimah serta kedua kakak saya yang selalu memberikan perhatian dan semangat.
7. Teman-teman Prodi D-III Kesehatan Hewan khususnya angkatan 2016.
Penulis menyadari Karya Tulis Ilmiah (KTI) ini masih memiliki kekurangan, karena itu kritik dan saran yang sifatnya membangun sangat penulis
harapkan.Akhirnya penulis berharap semoga karya tulis ini bisa bermanfaat bagi kita semua.
Jambi, Juni 2021
Reza Nugraha
7 DAFTAR ISI
Halaman LEMBAR PENGESAHAN ...
PERNYATAAN ...
RIWAYAT HIDUP ...
PRAKATA ... i
DAFTAR ISI ... ii
DAFTAR TABEL ... iii
DAFTAR GAMBAR ... iv
BAB 1 PENDAHULUAN ... 1
1.1 Latar Belakang ... 2
1.2 Tujuan ... 2
1.3 Manfaat ... 2
BAB II TINJAUN PUSTAKA ... 3
2.1 Etiologi Avian Influenza ... 3
2.2 Sumber Infeksi Avian Influenza ... 3
2.3 Cara Penularan Avian Influenza ... 4
2.4 Gejala Klinis Virus Avian Influenza ... 4
2.5 Pengendalian dan Pencegan Virus Avian Influenza ... 5
2.6 Uji HA dan Uji HI ... 6
BAB III MATERI DAN METODA ... 9
3.1 Tempat dan Waktu Kegiatan ... 9
3.2 Materi dan Peralatan Kegiatan ... 9
3.3 Metode Kegiatan ... 9
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 16
4.1 Hasil Uji HA ... 16
4.2 Hasil Uji HI ... 17
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 20
5.1 Kesimpulan ... 20
5.2 Saran ... 20
DAFTAR PUSTAKA ... 21
8 DAFTAR TABEL
Halaman Tabel
1. Skema uji HI ... 15 2. Hasil uji HA ... 16 3. Hasil uji HI ... 18
9 DAFTAR GAMBAR
Halaman Gambar
1. Struktur virus Avian Influenza ... 3
2. Ayam yang teserang virus AI terjadi pendarahan pada pial dan jengger ... 5
3. Contoh hasil uji HA positif dan negatif ... 7
4. Contoh hasil uji HI positif dan negatif ... 8
5. Pengambilan darah ayam pada vena brachialis ... 10
6. PBS tablet dari OXOID dan Aqubides 500 ml ... 11
7. RBC 10% (Reed Blood Cell)... 11
8. Uji HA dan contoh hasil uji positif dan negatif ... 13
9. Contoh hasil uji HA ... 14
10. Uji HI dan contoh hasil uji positif dan negatif ... 15
11. Hasil uji HA ... 17
12. Hasil uji HI pada 4 sampel ... 19
13. Hasil uji HI pada 4 sampel ... 19
10 BAB 1
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Serangan Avian Influenza (AI), dilaporkan pertama kali sebagai “Fowl Plaque” di Italia pada 1878 oleh Perrocinto, yang saat ini disebut dengan Highly Pathogenic Avian Influenza (HPAI) (Akoso, 2006). Pada tahun 1997, virus Avian Influenza subtipe H5N1 mewabah di Hongkong menyerang ayam dan burung peliharaan. Menurut World Health Organization (WHO) dan Office International des Epizooties (OIE), virus ini dapat menular pada manusia dan berakibat fatal.
Outbreak (wabah) virus AI di kawasan Asia khususnya Asia Tenggara pada pertengahan tahun 2003 dilaporkan di beberapa negara seperti Indonesia, Kamboja, Thailand, Republik Demokrasi Rakyat Laos, Malaysia dan Vietnam.
Jenis strain yang teridentifikasi adalah H5N1 dan diklasifikasikan sebagai (HPAI) yang dapat menyebabkan kematian pada populasi burung, ayam dan itik (WHO, 2007).
Avian influenza adalah penyakit Influenza pada unggas yang disebabkan oleh virus influenza tipe A subtipe H5N1 yang termasuk dalam famili Orthomyxovirus. Virus ini berukuran 80–120 nm, berbentuk Pleomorphic, mempunyai amplop, mengandung Ribonucleatacid (RNA) dengan penjuluran Glokoprotein yang mempunyai aktivittas haemaglutinasi, neurominidase dan antigenisitas. Penyakit influenza pada unggas bersifat sangat akut yang dapat menyebabkan penurunan produktifitas unggas dengan gejala klinis berupa gangguan pernafasan bagian atas dan gangguan reproduksi serta dapat menimbulkan kematian hingga 100% pada kasus virus yang sangat patogen dan dapat menghasilkan anak ayam yang carrier. (Easterday, et al., 1997).
Penyakit Avian influenza dapat ditanggulangi dengan melakukan pemusnahan hewan tersangka, sedangkan pencegahan penyakit dapat dilaksanakan dengan program vaksinasi yang sesuai (Frame, 2000). Avian influenza telah menyebabkan wabah yang serius di beberapa negara terutama di Asia. Walaupun saat ini tranmisi penyakit ini antara manusia ke manusia masih sangat jarang, akan tetapi pengawasan dan monitoring perlu terus menerus
11 ditingkatkan guna mangantisipasi semakin meningkatnya adaptasi virus HPAI ini terhadap manusia.
Penularan virus AI dapat terjadi melalui kontak langsung antara unggas sakit dengan unggas yang peka. Unggas yang terinfeksi virus AI mengeluarkan virus dari saluran pernafasan, konjungtiva dan feses. Penularan dapat juga terjadisecara tidak langsung misalnya melalui udara yang tercemar material atau debuyang mengandung virus AI (Aerosol, 2000).
Untuk diagnosa laboratorium dan identifikasi keberadaan virus AI maka Balai Karantina Pertanian melakukan uji HA dan HI pada ayam yang akan dikirim keluar dari provinsi Jambi.Uji HA (haemaglutination Assay) dan uji HI (haemaglutination inhibition), merupakan uji serologi yang digunakan untuk mendiagnosa penyakit avian influenza. Uji HA bertujuan untuk mengukur titer antigen sedangkan tujuan dari uji HI yaitu untuk mengukur titer antibodi.
Kegiatan ini dilakukan untuk tujuan diagnosa laboratorium pada penyakit AI pada ayam yang akan dikirim ke luar Provinsi Jambi.
1.2 Tujuan
Tujuan dari kegiatan Praktek Kerja Lapangan ini adalah untuk mendiagnosa penyakit Avian Influenza pada ayam dengan metode uji HA dan HI untuk mendeteksi keberadaan virus AI pada sampel darah ayam.
1.3 Manfaat
Manfaat dari Karya Tulis Ilmiah (KTI) ini adalah untuk memberikan informasi mengenai virus Avian influenza dan carapengujian virus Avian influenza dengan pengujian HI.
12 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.2.1 Etiologi Avian Influenza
AI disebabkan oleh virus influenza yang tergolong family Orthomyxoviridae. Tidak seperti kebanyakan virus, yang memiliki bentuk konsisten, virus influenza dapat berbentuk bola bundar, berfilamen atau berbentuk diantara keduanya. Dalam strukturnya terdapat banyak bentukan duri, tonjolan seperti paku pada seluruh permukaannya. Ada dua jenis protein yang berbentuk seperti paku, batang dan segitiga. Protein ini disebut hemagglutinin(HA), dan protein yang lain adalah enzim yang berbentuk persegi disebut neuraminidase. Kedua protein ini terletak di permukaan virus influenza (Nidom, 2009), dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1 : Struktur virus Avian Influenza
Terdapat 2 jenis spikes yaitu yang mengandung hemaglutinin (HA) dan yang mengandung neuraminidase (NA), yang terletak dibagian terluar dari virion (Horimoto dan Kawaoka, 2001).Di Indonesia wabah Avian Influenza meledak pada akhir tahun 2003sampai awal tahun 2004.
2.2.2 Sumber Infeksi Avian Influenza
Wabah Flu Burung ini disebabkan oleh virus Avian Influenza (AI), virus menyebar ke seluruh dunia melalui burung yang berpindah dari satu daerah ke daerah lain. Adanya reservoir pada hewan liar merupakan suatu faktor penting dalam ekologidari virus AI. Virus AI dari burung migran yang menjadi reservoir akan disebarkan melalui feses yang jatuh di peternakan unggas terutama
13 peternakan ayam dandapat menjangkiti peternakan-peternakan unggas lain melalui sumber air minumdan pakan yang terkontaminasi (Rahardjo, 2004).
Burung merpati diidentifikasi sebagai salah satu spesies yang memiliki potensi untuk membawa virus penyakit ke manusia. Hasil surveilan (Balitvet, 2005) dan hasil penelitian (Ellis et al., 2004), menunjukkan terdapat burung liar dan burung merpati yang terpapar virus Avian Influenza.
2.2.3 Cara Penularan Avian Influenza
Penularan atau transmisi darivirus influenza secara umum dapatterjadi melalui inhalasi, kontak langsung dan kontak tidak langsung(Bridges, et.al., 2003). Sebagianbesar kasus infeksi HPAI pada manusia disebabkan penularan virus dari unggas ke manusia (Beigel, et.al., 2005).
Virus AI berkembang biak pada jaringan tropisma seperti saluran pernapasan, pencernaan, pembuluh darah, limfosit, syaraf, ginjal dan atau sistem reproduksi. Virus dapat diisolasi dari feses dan dari saluran pernapasan dalam jumlah yang cukup besar dari burung-burung terkena infeksi. Dengan asumsi yang logis karena virus terdapat dalam sekresi, penyebaran penyakit dapat berlangsung melalui air minum yang tercemar. Burung-burung dapat terinfeksi melalui masuknya virus ke dalam kantung konjungtiva, hidungatau tenggorokan. Bukti laboratorium dan lapangan menunjukan bahwa virus dapat diambil dari permukaan dan dalam telur (Rahardjo, 2004).
2.2.4 Gejala Klinis Virus Avian Influenza
Gejala klinis hewan yang terserang virus Avian Influenza di lapangan bervariasi. Masa inkubasi virus AI bervariasi antara tiga sampai tujuh hari tergantung dari isolate virus, dosis virus, spesies, dan umur burung (Beard, 1998).
Tingkat keganasan virus AI (HPAI dan LPAI) merupakan faktor utama yang mempengaruhi gambaran gejala klinis yang sangat bervariasi tergantung faktor spesies yang terserang, umur, jenis kelamin, kekebalan tubuh dan faktor lingkungan(Tabbu,2000).Pada kasus tertentu, penyakit ini dapat berlangsung sangat cepat, unggas dapat mati mendadak tanpa didahului gejala tertentu dan dapat mencapai 100% (Tabbu, 2000). Masa inkubasi virus Avian influenza sekitar 2 sampai 4 harisetelah terinfeksi (Yuen KY, et.al.1998). Namun berdasarkan hasil
14 laporan belakangan ini masa inkubasinya bisa mencapai antara 4 sampai 8 hari (Chotpitayasunondh, et.al.,2005).
Gambar 2 : Ayam yang terserang virus avian influenza terjadi pendarahan pada pial dan jengger.
Bentuk akut (HPAI) ditandai dengan adanya proses penyakit yang cepat disertai mortalitas tinggi, gangguan produksi telur (berhenti atau menurun secara drastis), gangguan pernapasan (batuk, bersin, ngorok), lakrimasi (leleran dari mata) berlebihan, edema di daerah kepala dan muka, pendarahan jaringan subkutan yang diikuti pada kulit (terutama didaerah kaki, kepala, dan pial), diare dan gangguan saraf, dapat dilihat pada Gambar 2.
2.2.5 Pengendalian dan Pencegahan Virus Avian Influenza
Avian Influenza tidak dapat diobati, oleh sebab itu melakukan langkah strategis mengendalikan menjalarnya AI antar unggas sangat penting untuk membantu mengurangi resiko kesehatan masyarakat yang mungkin timbul dari virus AI subtipe H5N1. Prinsip pengendalian dan pemberantasan yang efektif adalah program monitoring dan survei nasional yang menyeluruh dan terintegrasi, peningkatan praktek biosecurity pada semua tingkatan skala produksi pengolahan serta laboratorium yang berhubungan dengan unggas atau peralatan yangdigunakan untuk unggas, pendidikan peternak dan pekerja lainnya termasukdokter hewan dan paramedik mengenai pengendalian dan pemberantasan virus AI, karantina dan pengendalian lalu lintas unggas dan produk unggas serta limbah peternakan tertular Virus AI, pemusnahan unggas hidup yang terekspos unggas tertular dalam satu kandang, pemetaan wilayah untuk menentukan wilayah tertular, terancam dan bebas, penggunaan vaksin sebagai salah satu elemen program pengendalian dan pemberantasan (EID,2006).Upaya yang dapat
15 dilakukan untuk mencegah penyebaran AI diantaranya adalah pengamanan biologis yang ketat, pelaksanaan aspek-aspek manajemen untuk menghilangkan sumber infeksi secara optimal serta vaksinasi.
2.2.6 Uji HA dan Uji HI
Uji HA dan uji HI merupakan uji serologi yang digunakan untuk mendeteksi adanya antibodi spesifik. Seperti antibodi terhadap agen infeksi yang mempunyai hemagglutinin (contoh: ND, EDS, IB, dan AI), dan untuk identifikasi/ mengetahui jenis virus.Untuk diagnosis penyakit Avian Influenza, uji HI adalah uji yang mendeteksi reaksi pengikatan antibodi dengan antigen.
Antibodi adalah zat kebal tubuh yang dilepaskan oleh sel darah putih limfosit, sedangkan antigen adalah zat yang bisa memicu dilepaskannya antibodi. Bibit penyakit seperti virus dan bakteri adalah contoh antigen (Baratawidjaja, 1998).
Organisme tertentu mampu mengaglutinasi eritrosit unggas dan mamalia.
Organisme yang melakukan hemaglutinasi diantaranya adalah virus dari family Orthomyxoviridae.
Uji HA (Haemaglutination Assay). Prinsip pengujian haemaglutination Assay (HA) adalah reaksi ikatan antara antigen dan RBC maka akan terjadi Aglutinasi, tujuan dari uji HA yaitu untuk mengetahui suatuvirus yang mempunyai kemampuan mengaglutinasi eritrosit atau untuk mengetahui titer virus dengan mengamati dasar sumuran paling akhir yang menunjukan adanya agregat, tanda adanya hemaglutinasi positif eritrosit adalah dasar dan hambatan aglutinasi dengan menggunakan antiserum subtipe H yang spesifik. Pengujian HA dilakukan dengan menggunakan sampel darah berupa eritrosit. Jika terdapat endapan homogen, (Gambar 3), pada dasar microplate, maka dapat dinyatakan HA + (positif). Sebaliknya jika tidak terjadi perubahan (tidak ada endapan homogen), dapat dinyatakan dengan HA - (negatif). Penggumpalan eritrosit terjadi karena asam sialat pada permukaan eritrosit terikatoleh hemagglutinin yang dimiliki oleh virus (Muflihanah, 2009).
16 Gambar 3: Contoh hasil uji HA positif dan negatif
Uji HI (Haemaglutination Inhibition). Prinsip dari pengujian HI adalah reaksi ikatan antara antibodi yang terkandung dalam serum yang diperiksa dan jumlah antigen hemaglutinin AI yang digunakan sebanyak 4 HAU (Haemaggutination Unit). Aglutinasi sel darah merah oleh virus atau antigen AI dapat dihambat oleh antibodi atau zat kebal terhadap AI. Tujuan dari uji HI adalah mengukur titer antibodi atau antiserum agar diketahui status kekebalan tubuh dan Mengidentifikasi suatu virus. Bila terdapat antibodi dalam jumlah mencukupi untuk membentuk kompleks dengan virion, hemaglutinasi akan terhambat.
Sebaliknya bila antibodi terdapat dalam jumlah yang tidak mencukupi maka eritrosit akan diaglutinasi oleh antigen dan membentuk endapan.
Pengujian HI merupakan metode yang relatif murah dan sederhana untuk mengukur antibodi haemaglutinin spesifik pada serum yang sudah divaksinasi.
Hasil uji HI positif ditandai dengan adanya endapan pada dasar microplate, tidak ada aglutinasi (OIE,2012). Antibodi yang mencukupi dalam serum darah ayam, mampu membentuk kompleks dengan virion yang dapat menyebabkan haemaglutinasi terhambat dan eritrosit akan terlihat mengendap di dasar sumuran microplate. Bila jumlah antibodi tidak mencukupi maka eritrosit akan diaglutinasikan oleh virus dan akan terlihat adanya aglutinasi pada dasar sumuran microplate (Fenner et al.,1995). Dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4: Contoh hasil uji HI positif dan negatif
17 Uji HA dan HI dilakukan di microplate. Uji HI dilakukan setelah diperoleh hasil positif pada uji HA . Secara singkat, metode kerja uji HI adalah pengenceran bertingkat serum sampel hingga pengenceran terbesar yang masih sanggup menghambat aglutinasi sel darah merah. Hasil positif jika tidak terjadi haemaglutinasi dan hasil negatif jika terjadi haemaglutinasi. Hasil yang didapat diformulasikan sehingga diketahui titer antibodinya sehingga dapat dibandingkan dengan standar titer protektif (Selleck, 2007). Dalam pengujian HI dibutuhkan beberapa variabel pengujian yang dapat mempengaruhi hasil dan akurasi pengujian yaitu microplate, pengenceran, pembacaan, interpretasi, antigen, antiserum dan sel darah merah (Selleck dan Axell, 2008). Menurut OIE (2008), hasil uji HI positif ditandai dengan adanya endapan pada dasar microplate, tidak ada aglutinasi (endapan). Titer HI dihitung berdasarkan pengenceran tertinggi serum yang dapat menghambat terjadinya hemaglutinasi. Pemeriksaan serologi yang dilakukan dengan uji HI dianggap positif apabila titer antibodi ≥ 24dengan antigen 4 HAU (OIE,2012).
Metode ini mempunyai beberapa kelebihan yaitu relatif simpel, murah reagen dan RBC yang diperlukan, mudah mempersiapkannya, dan tidak membutuhkan alat yang canggih untuk membacanya cukup dengan melihat ada tidaknya aglutinasi yang terjadi antara antibodi sampel dan antigen Avian influenza dengan menggunakan reading mirror. Sedangkan untuk kekurangan yang dimiliki uji ini diantaranya titrasi antigen harus dilakukan setiap pengujian, interpretasi hasil uji memerlukan keahlian khusus serta adanya prosedur yang berbeda dari masing-masing laboratorium dapat memberikan hasil yang berbeda pula (Hewajuli, 2008).
18 BAB III
MATERI DAN METODE
3.1 Tempat dan Waktu Kegiatan
Kegiatan praktek kerja lapanganan (PKL) dilaksanakan di Balai Karantina Pertanian Kelas 1 Jambi pada tanggal 01 Februari sampai 29 April 2019.
3.2 Materi dan Peralatan Kegiatan
Materi yang digunakan dalam kegiatan ini adalah:serum darah ayam, Antigen AI dari (PUSVETMA), Serum Kontrol AI Positif dan Negatif dari (PUSVETMA). Larutan PBS (Phasphate Buffered Saline), RBC 1% (Red Blood Cell) dan larutan alsever.
Adapun Alat yang digunakan pada kegiatan praktek kerja lapang ini adalah:
Laminar airflow, sentrifus, mikroplate, mikrotip, refrigerator, mikropipet, thermoshaker, ph meter, autoclave, mikrotube, alumunium foil, ph meter, tabung sentrifus,spuit, masker dan handscoon.
3.3 Metode Kegiatan
Adapun metode diagnosa penyakit AI dengan metode uji HA (Haemaglutination Assay) dan HI (Haemaglutination Inhibition), terbagi menjadi dua tahap yaitu: tahap persiapan uji HA dan HI dan tahap pengujian uji HA dan HI.
3.3.1 Tahap Persiapan Uji HA dan HI
Sebelum melaksanakan pengujian ada beberapa kegiatan yang perlu di persiapkan terlebih dahulu yaitu : Pengambilan sampel darah ayam, Pembuatan Phaspate Buffered Saline (PBS), dan pembuatan Red Blood Cell (RBC) 1%.
A. Pengambilan Sampel Darah Ayam
Pengambilan sampel darah dilakukan pada saat pengiriman ayam keluar/masuk ke Provinsi Jambi. Sampel yang dilakukan pengujian adalah serum darahnya. Pengambilan sampel dilakukan atas izin dari balai karantina dan pemilik hewan serta didampingi oleh Dokter hewan/Paramedik di Balai Karantina Pertanian Kelas 1 Jambi. Adapun prosedur kegiatan dalam pengambilan sampel darah yaitu:
19 1. Pengambilan sampel darah ayam menggunakan spuit 3cc melalui vena
brachialis di kiri atau kanan bawah sayap, dapat dilihat pada Gambar 5.
2. Darah ayam yang sudah diambil selanjutnya dimiringkan selama 3/4 jam dan dibiarkan hingga darah terpisah dengan serum.
3. Koleksi serum dan dimasukan kedalam microtube.
4. Selanjutnya simpan serum darah pada refrigator dengan suhu (4°-10°), hingga saat dilakukan uji HA dan HI.
Gambar 5 : Pengambilan darah ayam pada vena brachialis dan Serum darah ayam
B. Pembuatan PBS (Phasphate Buffered Saline)
Cara Pembuatan PBS dilakukan dengan cara sebagai berikut:
1. PBS tablet Oxoiddan aquabides (Gambar 6), dicampurkan dengan perbandingan 1 tablet PBS untuk 100 ml aquabides dalam beaker glass.
2. Kemudian dihomogenkan dengan menggunakan magnetik stirrer, dan disterilkan dengan menggunakan autoclave pada suhu 121°C selama 20 menit 3. Diukur pH PBS tersebut menggunakan pH meter. Jika terlalu asam
ditambahkan NaOH dan jika terlalu basa ditambahkan HCl hingga mencapai Ph 7,2.
4. Setelah dingin, ditutup dengan alumunium foil dan diberi label tanggal pembuatan lalu disimpan pada refrigator dengan suhu 4°C.
20 Gambar 6: PBS tablet dari OXOID dan Aqubides 500 ml
C. Pembuatan Red Blood Cell (RBC)1%
Adapun prosedur cara pembuatan RBC 1% adalah sebagai berikut:
1. Diambil darah ayam dimasukkan ke tabung sentrifus lalu dicampurkan dengan larutan alsever dengan perbandingan 1:1
2. Selanjutnya disentrifus dengan kecepatan1500 rpm selama 10 menit
3. Dibuang supernatan (sisa larutan alsever) dengan menggunakan mikropipet 4. Ditambahkan PBS dan disentrifus pada kecepatan 1500 rpm selama 10 menit, 5. Ulangi sebanyak 3 dan 4 kali hingga larutan PBS menjadi bening (Gambar 7).
Untuk mendapatkan RBC 10 % dilakukan pengenceran menggunakan PBS dengan perbandingan 1:9 Sebanyak 1 ml RBC ditambah PBS 9 ml dapat dilihat pada Gambar 7. Kemudian dari RBC 10% tersebut diambil 1 ml dan ditambahkan 9 ml PBS dengan perbandingan1:9 lalu dihomogenkan, sehingga akan diperoleh RBC 1%.
Gambar 7: Pembuangan supernatan dan RBC 10% (Reed Blood Cell)
21 3.3.2 Tahap Pengujian Virus AI dengan Uji HA dan HI
Setelah semua tahap persiapan sudah dilakukan dan selesai, dilanjutkan dengan tahap pengujian yaitu: Uji Haemaglutination Assay (HA) dan Uji Haemaglutination Inhibition (HI).
A. Uji Haemaglutination Assay (HA)
Metode uji HA yang digunakan adalah metode kuantitatif. Metode ini, selain digunakan untuk mengetahui titer antigen, juga dapat digunakan untuk retritasi antigen yaitu untuk mengecek apakah antigen yang akan dilakukan uji HImemiliki titer 4 HA unit. Prinsip dari uji HA yaitu terjadinya Aglutinasi(Red Blood Cell) RBC oleh haemaglutinin. Tujuan dari uji HA yaitu untuk mengukur titer antigen AI yang akan digunakan pada uji HI (Haemagglutination Inhibition).
Adapun prosedur uji HA adalah sebagai berikut:
1. Sumuran microplate diisi 25 μl PBS dari sumuran 1-12. Alat yang digunakan untuk mengisi sumuran adalah mikropipet 25 μl.
2. Selanjutnya sumuran 1 diisi antigen 25 μl dengan mikropipet.(Gambar 8).
3. Antigen dihomogenkan dengan cara menghisap dan mengeluarkan kembali pada sumuran 1, kemudian dipindahkan ke sumuran 2 demikian seterusnya sampai sumuran ke 11.
4. Sumuran 12 tidak diberikan antigen digunakan sebagai kontrol eritrosit.
5. Ditambahkan kembali 25 μl PBS kedalam semua sumuran dengan mikropipet 6. Selanjutnya semua sumuran di isi dengan 25 μl RBC 1 %.
7. Kemudian microplate dihomogenkankan dengan Thermo shaker dan di inkubasi selama 40 menit pada suhu kamar.
8. Kemudian periksa hasil uji HA dan dibaca titernya (Pembacaan titer sebaiknya dibandingkan dengan kontrol).
Pembacaan Hasil uji HA yaitu dinyatakan positif apabila berbentuk seperti pasir halus pada dasar sumuran plat mikro, dapat dilihat pada Gambar 9.
Aglutinasi terjadi karena adanya reaksi hemaglutinin dengan RBC 1%.
Selanjutnya ditentukan titer antigen 4 HAU sebagai nilai virus optimal yang akan dipakai pada uji HI.
22 Gambar 8 : Pengujian HA dan contoh hasil uji positif (A) dan negatif (B)
Cara Penentuan Titer Antigen 4 HAU. Titer HA selanjutnya dibaca dan ditentukan nilai 4 HAU yaitu pengenceran antigen tertinggi yang masih dapat menghaemaglutinasi RBC. Cara penentuan titer antigen 4 HAU sebagai berikut:
1. Sebagai contoh: Titer HA yang terbentuk pada sumuran nomor 6 maka suspense antigen 4 HAU akan dibuat dari pengenceran 26.
2. Maka: 2
6
22
=
24 = 16. Jadi perbandingan antara antigen dan PBS yaitu 1:15, maka 1bagian antigen dan 15 bagian PBS.3. Contoh: dengan menggunakan perbandingan 1:15, maka 10 µlantigen + 150µl PBS = 160 µl.
Gambar 9: sumber internet: Contoh hasil uji HA
Setelah uji HA selesai dilakukan dan didapatkan hasil titer antigen, dilanjutkan dengan pengujian Back Titrasi HA, dengan tujuan untuk memastikan apakah benar bahwa titer antigen tersebut memiliki nilai 4 HAU yang dibutuhkan untuk pengujian HI. Metode kerja uji Back Titrasi sama dengan cara kerja uji HA, yang membedakan yaitu pada uji back titrasi menggunakan antigen yang di dapatkan pada pengenceran tertinggi uji HA. Pembacan Hasil uji back titrasi tidak boleh lebih dari 24 dapat dilihat pada Gambar 9.
23 B. Uji Haemaglutination Inhibition (HI)
Uji HI merupakan pengujian serologis berupa hambatan antibodi spesifik terhadap aktivitas hemaglutinasi antigen virus AI. Tujuan dari uji HI yaitu untuk mengukur titer antibodi ditentukan berdasarkan atas hambatan pada pengenceran yang tertinggi yang masih mampu mengikat antigen (pada konsentrasi 4 HAU) dan menghambat aglutinasi sel darah merah. Kontrol positif dan negatif disertakan dalam pengujian. Adapun cara kerja uji HI adalah sebagai berikut:
1. PBS Sebanyak 25 μl diisi ke sumuran microplate dari sumuran1 sampai 12.
2. Serum kontrol positif AI dimasukkan 25 μl pada sumuran baris pertama (A1).
3. Serum kontrol negatif AI dimasukkan 25 μl pada sumuran baris kedua (B1).
4. Kemudian ditambahkan serum sampel pada sumuran 1 baris ketiga (C1) 25 μl, 5. Lalu dihomogenkan dengan memindahkan ke sumur 2 sampai sumuran 11,
dapat dilihat pada Gambar 10.
6. Selanjutnya 25 μl campuran serum dan PBS dibuang dari sumur 11.
7. Pada sumuran ke-12 tidak diberikan serum karena sumuran 12 sebagai kontrol.
8. Kemudian ditambahkan antigen 25 µl di sumuran 1 sampai 11 lalu dihomogenkan dengan thermo shaker.
10. Selanjutnya diinkubasi pada suhu ruangan selama 30 menit.
11. Lalu ditambahkan RBC 1% sebanyak 25 μl ke dalam sumuran 1 sampai 12 12. kemudian dihomogenkan menggunakan thermo shaker dan diinkubasi pada
suhu kamar selama 40 menit.
13. kemudian dibaca hasil uji HI tersebut.
Pembacaan hasil titer uji HI ditunjukkan pada pengenceran serum tertinggi yang masih memberikan inhibition (hambatan) pada antigen 4 HAU. hasil dinyatakan positif menghambat aglutinasi eritrosit, jika setelah inkubasi terdapat endapan eritrosit berbentuk titik di tengah sumuran maka menunjukan hasil positif. Inhibisiditetapkan dengan melakukan pengamatan serum darah pada sumuranmicroplate, bila dimiringkan terlihat RBC (Reed Blood Ceel) yang membentuk tetesan air mata yang serupa dengan control (Gambar 10), menunjukan titer antibodi positif (Indriani dkk. 2006).
24 Gambar 10 : Uji HI dan contoh hasil Uji HI positif (A) dan negatif (B) Tabel 1 Skema uji HI (Haemaglutination Inhibition).
Sumuran
No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
PBS µl 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Serum* µl 25
Pengenceran
µl 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 buang
Antigen 4**
HAU µl 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 - Homogenkan dan inkubasi selama 30 menit
RBC 1% µl 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Homogenkan dan inkubasi selama 40 menit
Titer serum 21 22 23 24 25 26 27 28 29 210 211 kontrol
Ket. *Serum darah sampel **Hasil perhitungan titer antigen pada uji HA
25 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil Uji HA (Haemaglutination Assay)
Pengujian deteksi antibodi Avian Influenza pada sampel darah ayam yang dimulai pada bulan Februari hingga April 2019, dilakukan dengan menggunakan uji HA dan HI. Jumlah sampel yang di uji adalah 15 sampel serum darah ayam yang diambil 5 kali selama 2 bulan. Berdasarkan uji HA yang dilakukan memberikan hasil positif terhadap uji ini dan dapat dihitung titer antigen 4HAU.
Hasil pengujian HA disajikan pada Tabel 2.
Tabel2.Hasil uji HA untuk menentukan titer antigen 4 HAU.
No Tanggal Pengujian
Jumlah sampel
Hasil positif pada Sumuran
Nilai titer
Jumlah pengenceran
Total ag
1 26/02/2019 4 1-7 27 32 = 1:31 320 µl
2 27/02/2019 2 1-6 26 16 = 1:15 160 µl
3 28/02/2019 3 1-7 27 32 = 1:31 320 µl
4 22/03/2019 2 1-6 26 16 = 1:15 160 µl
5 29/03/2019 4 1-6 26 16 = 1:15 160 µl
Jumlah 15
Ket. Ag: Antigen
Berdasarkan Tabel 2. Pengujian HA dilakukan pada microplate, dengan pembacaan hasil yaitu adanya hasil positif ditunjukkan dengan adanya aglutinasi pada dasar cawan mikro, yaitu terbentuk presipitat seperti pasir halus, dapat dilihat pada Gambar 11. Hal tersebut menunjukkan bahwa virus tersebut adalah virus AI yang mempunyai glikoprotein haemaglutinin. Hasil negatif tampak karena pada dasar cawan mikro tidak terbentuk presipitat tetapi berbentuk seperti mata air jatuh. (Susanti et al., 2007). Hasil uji HA ini digunakan untuk pembuatan antigen 4HAU, lalu dilanjutkan dengan uji Hemaglutinasi Inhibisi (HI) untuk mendeteksi adanya antibodi virus Avian influenza.
26 Gambar 11: (A). Hasil uji HA terlihat aglutinasi pada sumuran ke 6 dan (B).
Hasil uji HA Back Titrasi aglutinasi terjadi pada sumuran 2
Menurut (Suarez, 2000), apabila hasil uji HA positif dapat dilanjutkan dengan uji HI untuk menentukan titer antibodi. Interpretasi uji HI berbeda dengan uji HA, karena bila hasilnya positif, maka pada dasar cawan mikro akan tampak adanya endapan seperti butiran pasir halus.
4.2 Hasil Uji HI (Haemaglutination inhibition)
Uji Haemaglutination Inhibition (HI), merupakan salah satu uji serologi standar yang direkomendasikan OIE (Office International des Epizooties), dengan tujuan untuk mendeteksi keberadaan antibodi yang terdapat pada serum darah ayam yang diperiksa. Prinsip uji HI adalah hambatan aglutinasi RBC (Reed Blood Cell) oleh virus akibat terikatnya virus tersebut dengan antibodi spesifik. Oleh karena itu uji HI hanya bisa digunakan untuk virus yang mengaglutinasi RBC (Syukron et al., 2013).
Pengujian pemeriksaan antibodi virus Avian influenza dilakukan di Laboratorium Balai Karantina Pertanian Kelas 1 Jambi secara kualitatif menggunakan metode Haemaglutunation Inhibition (HI), dengan menggunakan 15 sampel serum darah ayam yang akan dikirim keluar dari Provinsi Jambi.
Kelebihan dari uji ini adalah relatif simpel, murah serta reagen dan RBC yang diperlukan untuk pengujian dapat dipersiapkan dengan mudah oleh masingmasing laboratorium. Sedangkan kekurangan-kekurangan yang dimiliki uji ini diantaranya titrasi antigen harus dilakukan setiap pengujian, interpretasi hasil uji memerlukan keahlian khusus serta adanya prosedur yang berbeda dari masing- masing laboratorium dapat memberikan hasil yang berbeda (Selleck, 2007). Hasil uji HI disajikan pada Tabel 3.
Tabel 3. Hasil uji HI pada 15 sampel serum darah ayam.
A B
27 No Tanggal
Pengujian
Kode sampel
Hasil sumuran Hasil uji
Nilai titer*
Tidak aglutinasi Aglutinasi
1 26/02/2019 A26-19 4-11 1-3 Negatif 23
A26-20 3-11 1-2 Negatif 22
A26-21 4-11 1-3 Negatif 23
A26-22 4-11 1-3 Negatif 23
2 27/02/2019 B27-23 5-11 1-4 Negatif 23
B27-24 4-11 1-3 Negatif 23
3 28/02/2019 C28-25 3-11 1-2 Negatif 22
C28-26 4-11 1-3 Negatif 23
C28-27 5-11 1-4 Negatif 24
4 22/03/2019 D22-28 3-11 1-2 Negatif 22
D22-29 3-11 1-2 Negatif 22
5 29/03/2019 E29-30 4-11 1-3 Negatif 23
E29-31 3-11 1-2 Negatif 22
E29-32 5-11 1-4 Negatif 24
E29-33 4-11 1-3 Negatif 23
Jumlah 15 15 23
Ket. *Titer antibodi
Berdasarkan Tabel 3. Dari hasil uji HI yang dilakukan menunjukkan bahwadari 15 sampel darah ayam yang dilakukan uji HI tersebut tidak terdapat antibodi Avian Influenza yang artinya ayam tersebut negatif AI dan bisa keluar dari Provinsi Jambi. Antibodi yang terbentuk pada serum darah ayam. Rata rata nilai titer antibodi adalah kurang dari 24, dapat dilihat pada Gambar 12 dan 13, oleh sebab itu titer antibodi terhadap virus AI tidak protektif (Negatif). Penentuan ketegori titer antibodi positif dan negatif berdasarkan ketentuan Direktorat Jenderal Peternakan (2005), adalah berdasarkan nilai titer antibodi yang positif adalah lebih dari24, sedangkan nilai titer antibodi dengan nilai titer yang yang kurang dari 24 adalah negatif. Hal ini menunjukan bahwa pada seluruh sampel tersebut tidak terdapat antibodi AI.menunjukkan hasil yang negatif karena terjadi aglutinasi tidak lebih dari sumuran 4. Hal ini ditandai dengan adanya eritrosit
28 yang menyebar pada dasar lubang di microplate, berbentuk seperti endapan dan untuk pembacaan pada microplate terlihat dengan jelas.
Gambar 12: Hasil uji HI pada 4 sampel Gambar 13: Hasil uji HI pada 4 sampel Pembacaan Gambar hasil uji di atas, sebagai berikut: hemaglutinasi sempurna (100%) adalah hemaglutinasi terlihat jelas berupa lapisan eritrosit secara merata pada dasar sumuran dan penjernihan dari cairan bagian atas tanpa terjadinya pengendapan eritrosit berbentuk titik di tengah sumuran. Hasil penilaian jika telah terjadi endapan pada sumur kontrol maka dimulai pembacaan serum. Serum yang positif mengandung antibodi ditandai dengan dihambatnya pengendapan tidak seperti sumur kontrol. Titer serum ditentukan dari pengenceran serum yang tertinggi yang masih mampu menghambat antigen untuk mengaglutinasi sel darah merah ayam. Menurut (Fiqri 2011), pada pengujian Haemaglutination Inhibition (HI) dengan menggunakan sampel serum, plasma, yolksac dinyatakan positif (eritrosit mengumpul ditengah dasar lubang di microplate dan bila digoyangkan berbentuk seperti kancing) jika mempunyai titer lebih dari 24. Nilai ini dibaca pada lubang terakhir yang tidak ditemukan adanya aglutinasi sel darah merah.
29 BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil pengujian dengan melakukan uji HA dan HI terhadap 15 sampel serum darah ayam yang dilakukan pada bulan Februari sampai April tahun 2019, di Balai Karantina Pertanian Kelas 1 Jambi. Dapat disimpulkan bahwa pada sampel serum darah yang dilakukan uji hasilnya adalah 15 sampel negatif, artinya tidak ditemukan adanya antibodi AI (Avian Influenza).
5.2 Saran
Setelah melakukan pengujian ini maka saran yang dapat diberikan adalah:
Perlu adanya penambahan fasilitas Laboratorium untuk peneguhan diagnosa penyakit Avian Influenza, denganuji Polymerase Chain Reaction (PCR) dan supaya adanya kerjasama antara Balai Karantina Pertanian Kelas 1 Jambi dan Balai Veteriner (BVet) dan wilayah kerja jambi untuk bisa melakukan pemantauan terhadap penyakit Avian Influenza agar bisa menjadi status daerah bebas Avian Influenza.
30 DAFTAR PUSTAKA
Akoso,B. T. 2006. “Waspada Flu Burung” Penyakit Menular Pada Hewan danManusia.Kanisius.Yogyakarta.
Amanu, S. 2005. Studi Serologi Dengan Uji Hambatan Hemaglutinasi TerhadapAngsa Yang Dapat Bertindak Sebagai PembawaNew Castle
DiseasediD.I. Yogyakarta.http://i-
ib.ugm.ac.id/jurnal/download.php?dataId=8360.
Baratawidjaja, K.G. 1998. ImunologiDasar. Edisi Ketiga. Penerbit Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Jakarta.
Bread, C.W. 1998.Avian Influenza (Fowl Plaque.Influenza). In A Laboratory Manual for The Isolationand Identification of Avian Pathogens, 3d ed.
H.G. Purchase et al., eds., Kennet square, PA: American Association
Avian Pathologist, pp. 110-113.
www.vet.uga.edu/vpp/gray_book/FAD/aka.htm [5maret 2006].
Direktorat Kesehatan Hewan Direktorat Jenderal Peternakan dan Kesehatan Hewan Kementerian Pertanian.2005. Jakarta.
Easterday, B.C., 1997. Influenza dalam Disiase of Poultry.Edisi x, Calnek, B.W.
(Eds).Lowa State University Press Ames. USA. Hal.: 582-605.
Ellis, T.M., R.B. Bousfield., L.A. Bissett., K.C. Dyrting., G.S. Luk., S.T. Tsuin., K. Sturm Ramirez., R.G. Webster., Y. Guan dan J.S dan Malik Peiris.
2004. Investigation of Outbreak of Highly Pathogenic H5N1 Avian Influenza in Water Fowl and Wild Bird in Hongkong in late 2000. Avian Path.5: 492 – 505.
Emerging Infection Disease (EID). 2006. Control of Avian Influenza in Poultry.
http://www.vetcite.org/ publish/items/003162/idex.html. [12 September 2006].
Hewajuli, D.A., Dharmayanti. 2008. Karakterisasi dan Identifikasi Virus Avian Influenza (AI). [Makalah].Balai Besar Penelitian Bogor. Bogor
Horimoto, T., Y. Kawaoka. 2001. Pandemic Threat Posed ByAvian Influenza A Viruses. Clinical Microbiology Reviews. 14 (1): 129-149.
Indriani, R., N.L.P.I. Dharmayanti., L. Parede., danR.M.A. Adjid. 2006. Kajian Vaksinasi Avian Influenza Subtipe H5N1 Pada Burung Puter (Stretopeliabitorquata) dan Merpati (Columba livia). Balai Penelitian Veteriner. Bogor.
Muflihanah, 2009. Serological Diagnostic of Avian Influenza Infections.
Hasanuddin University.Makasar.
31 Nidom, C.A., 2009. Menelusuri Penyebaran Virus Flu Burung di Indonesia
(20032007). Airlangga University Press. Surabaya.
OIE, 2012. OIE. Terrestrial manual, Avian Influenza. Chapter 2.3.4.
Rahardjo, Y. 2004. Avian Influenza, Pencegahan, Pengendalian, dan Pemberantasannya. Gallus Indonesia Utama. Jakarta.
Selleck, P. 2007. Serological Tests for The Detection of Antibodies Againts Avian Influenza. CSIRO Australian Animal Health Laboratory, Geelong, Australia.
Tabbu, C.R. 2000.Penyakit Ayam dan Penanggulangannya: Penyakit Bakterial, Mikal, dan Viral. Kanisius.Yogyakarta. 1: 232 - 244
Suarez, D.L., M. Perdue., T. Rowe., C. Bender., J. Huang dan D. Swayne .1998.
Comparisons ofHighly Virulent H5N1 Influenza A Viruses Isolated fromHumans and Chickens from Hongkong. J.Virol. 72: 6678-88.
WHO, 2007. Influenza Research at The Human and Animal Interface: Report of WHO Working Group. Switzerland. WHO/CDS/EPR/GIP/2007.3.
