II. MATERI DAN METODE PENELITIAN
1. Materi Penelitian, Lokasi dan Waktu Penelitian 1.1. Materi Penelitian
1.1.1. Alat
Alat yang digunakan adalah akuarium berukuran 40 X 60 X 60 cm3 dan ketinggian air adalah 40 cm, aerator, heater, timbangan dengan ketelitian 0,1 g, ember, seser, baki, alat bedah, homogeniser listrik, sentrifugator, spektrofotometer, botol film,tabung reaksi, tabung eppendorf, rak tabung, lemari pendingin, inkubator, pipet tetes,micro pipettedanpipette tip.
1.1.2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikan Nilem (Osteochilus hasselti C.V.) ukuran ±30 gram, pellet dengan kandungan protein 25% (Merk dagang “TAKARI”), larutan kasein 1% dalam air, akuades, 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7,2-8,0), larutan protein standar (0,05 mg/ml – 1,0 mg/ml kasein), pereaksi A (2 % Na2CO dalam 0,1 M NaOH), pereaksi B (0,5 % CuSO . 5H O dalam 1 % Na-K tartat), pereaksi C (campuran 50 ml pereaksi A dengan 1 ml pereaksi B), pereaksi D (larutan 1 N pereaksi Folon Ciocalteu), larutan 0,05 M Na HPO buffer (pH 8,0– 9,0), larutan 1 % (w/v) kasein, larutan 8 % (w/v) trichloroacetic acid (TCA), larutan tyrosine standard (10 μ g/ml – 250 μ g/ml), larutan pati 1% dalam 20
Penelitian dilakukan di laboratorium Fisiologi Hewan Fakultas Biologi Unsoed.Uji aktivitas protease dan amilase dilakukan di laboratorium Riset Unsoed. Penelitian dilaksanakan selama 6 bulan dari bulan Juni 2013 hingga Januari 2014
2.Teknik Pengambilan Sampel 2.1. Pengambilan Sampel
Metode yang digunakan dalam penelitian ini yaitu metode survey. Dengan menggunakan Teknik Pengambilan Sampel. Ikan nilem dikelompokan kedalam empat kelompok yaitu kelompok 1 pada jam 06:00 WIB (P1); kelompok 2 pada jam 12:00 WIB (P2); kelompok 3 pada jam 18:00 WIB (P3); dan kelompok 4 pada jam 24:00 WIB (P4). Pengambilan intestin dilakukan sebanyak 4 kali dengan selang waktu 6 jam sekali.
2.2. Variabel yang diamati
2.3. Cara kerja
Cara Kerja yang dilakukan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut. 2. 3.1.Persiapan Akuarium
Akuarium yang digunakan dalam penelitian adalah akuarium fiber berukuran 40 x 60 x 60 cm³ yang di isi air tawar sebanyak 100 liter, dilengkapi dengan heater 280C sistem air dan diaerasi.
2.3.2. Pengadaan Ikan Uji
Ikan uji untuk percobaan ini diperoleh dari mitra kerja yaitu Mina Artha, Sumbang, Banyumas dengan bobot sebesar ±30 g/ekor. Sebelum digunakan untuk percobaan ikan terlebih dahulu diaklimasi selama 14 haridi Laboratorium Fisiologi Hewan untuk penyesuaian terhadap kondisi laboratorium dan kualitas pakan uji. Selama aklimasi ikan Nilem diberi pakan buatan (pelet) dengan kandungan protein 25% dan dilakukan pengaturan media pemeliharaan untuk mendukung kebutuhan hidup ikan.
2.3.2. Penebaran dan Pemberian Pakan Ikan Uji
2.3.4. Pembedahan ikan
Empat kelompok ikan yaitu kelompok jam 06:00; 12:00; 18:00; dan 24:00 dibedah masing-masing pada jam yang telah ditentukan mulai dari lubang anus sepanjang garis medio-ventral tubuh ke arah depan sampai dekat sirip dada. Pengguntingan dilakukan secara hati-hati agar organ yang terletak di sebelah dalam tidak ikut tergunting, kemudian daging bagian atas dibuka dengan pinset,ambil bagian viscera ikan, lalu saluran pencernaan ikan diisolasi, setelah saluran pencernaan diperoleh lalu dimasukan kedalam botol film
2.3.5. Preparasi homogenate intestine (Nataliaet al., 2004)
Saluran pencernaan ikan yang telah diisolasi lalu dibersihkan diatas lempengan es, kemudian intestin ikan dilumatkan atau dihancurkan menggunakan homogeniser listrik dalam 50 mM Tris-buffer (pH 7,2-8,0) dingin dengan rasio 1 : 4 (w/v), homogenat yang diperoleh kemudian disentrifugasi menggunakan sentrifuse elektrik bersuhu -4°C pada kecepatan (12000 rpm selama 10 menit atau 10000 rpm selama 20menit) fraksi lipid yang mengambang dikeluarkan dan cairan supernatan ditampung untuk digunakan uji aktivitas enzim (Natalia et al., 2004). Kadar protein supernatan ditentukan dengan metode Lowryet al., (1951 dalamFurne et al., 2005).Larutan ekstrak enzim harus disimpan pada suhu dibawah 0°C atau dalam lemari es.
2.3.6. Penentuan kadar protein supernatan dengan metode Lowry(Furneet al., 2005)
konsentrasi berurut-urut 0,05 mg/ml, 0,10 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,50 mg/ml, dan 1,0 mg/ml. Disiapkan 1 tabung untuk larutan sampel, ke dalam tabung sampel dimasukkan 0,5 ml larutan sampel (ekstrak vicera) yang kadarnya kira-kira di bawah 0,25 mg/ml. Kesemua tabung (5 tabung standar dan semua tabung sampel) ditambah 5 ml pereaksi C, kocok dan biarkan selama 10 menit pada suhu kamar. Setelah 10 menit ditambahkan 0,5 ml pereaksi D, kocok segera dan dibiarkan pada suhu kamar selama 30 menit. Diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 660 nm, dicatat hasilnya dan dibuat kurva standarnya. Kadar protein sampel ditentukan dengan cara memplotkan angka absorbansi sampel ke dalam kurva standar.
2.3.7. Pengukuran Aktivitas Protease Digesti menggunakan Metode Hidrolisis Kasein (Hidalgoet al., 1999)
Disiapkan 7 buah tabung reaksi, masing-masing tabung diberi label. Satu buah tabung untuk sampel, satu buah tabung untuk kontrol, satu buah tabung untuk blanko dan 4 buah tabung keempat untuk standar dengan konsentrasi (larutan 0,01 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,10 mg/ml dan 0,25 mg/ml) larutan tirosin 1%. Masukkan ke dalam tabung sampel 0,35 ml larutan kasein 1%, 0,30 ml larutan buffer dan 0,10 ml larutan ekstrak kasar enzim. Diinkubasi selama 60 menit pada suhu 37°C, dan dihentikan reaksi dengan menambahkan 0,75 ml larutan tricholoacetic acid (TCA) 8%.
ditambahkan dengan 0,75 ml TCA.
Tabung standar diisi dengan 0,35 ml larutan tirosin standar, lalu ditambahkan 0,30 ml buffer, 0,10 ml akuades, dan diinkubasi selama 60 menit pada suhu 37°C. Semua tabung dimasukkan kedalam refrigerator selama 1 jam, campuran reaksi disentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm selama 10 menit. Diukur absorbansinya pada panjang gelombang 280 nm. Hasilnya dicatat dan dibuat kurva standarnya. Aktivitas enzim ditentukan dengan cara memplotkan angka absorbansi sampel ke dalam kurva standar.
2.3.8. Pengukuran Aktivitas Amilase dengan metode Somogy-Nelson (Hidalgoet al., 1999)
Disiapkan 7 buah tabung reaksi, masing-masing tabung diberi label. Satu buah tabung untuk sampel, satu buah tabung untuk kontrol, satu buah tabung untuk blanko dan 4 buah tabung untuk standar dengan konsentrasi (larutan 0,01 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,10 mg/ml dan 0,25 mg/ml) larutan maltosa 1%. Masing-masing tabung standar diisi dengan 0,70 ml larutan maltosa standar 1%, kemudian ditambah 0,10 ml akuades. Ke dalam tabung sampel diisi 0,70 ml amilum 1% dan ekstrak kasar enzim 0,10 ml, ke dalam tabung blanko diisikan 0,80 ml akuades, tabung kontrol diisi dengan 0,10 ml akuades dan ditambahkan 0,70 ml dinitrosalicylic acid(DNS).
