i
KARAKTERISASI GEN PARTICULATE METHANE
MONOOXYGENASE (pMMO) BAKTERI METANOTROF
ASAL SAWAH
ANNISA RETNO FITRIANI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
ABSTRAK
ANNISA RETNO FITRIANI. Karakterisasi Gen Particulate Methane Monooxygenase (pMMO)
Bakteri Metanotrof Asal Sawah. Dibimbing oleh IMAN RUSMANA dan ALINA AKHDIYA. Bakteri metanotrof adalah bakteri pengoksidasi metan yang memiliki enzim yang spesifik yaitu enzim metan monooksigenase (MMO). Aplikasi bakteri metanotrof dapat mengurangi emisi metan di lahan sawah. Terdapat dua jenis enzim MMO, yaitu soluble MMO
(sMMO) dan particulate MMO (pMMO). Enzim pMMO adalah enzim terikat membran yang
dimiliki oleh seluruh bakteri metanotrof. Isolat BGM 1 dan SKM 14 menunjukkan morfologi koloni yang berbeda ketika ditumbuhkan pada media Nitrate Mineral Salt (NMS) + 1% metanol.
Amplifikasi gen pMMO dengan menggunakan primer A189f dan A682r menunjukkan pita DNA berukuran ~300 bp untuk isolat BGM 1 dan ~500 bp untuk isolat SKM 14. Sekuen yang diperoleh dianalisis menggunakan program BLAST-N dan BLAST-X. Analisis sekuen amplikon dari BGM 1 menggunakan program BLAST-N dan BLAST-X berturut-turut menunjukkan kemiripan tertinggi dengan sekuen gen (87%) dan asam amino pada protein (71%) acyl-coA dehydrogenase Xanthobacter autotrophicus Py2. Sedangkan analisis sekuen amplikon dari SKM
14 menggunakan program BLAST-N dan BLAST-X berturut-turut menunjukkan kemiripan tertinggi dengan sekuen gen (84%) dan asam amino pada protein (62%) subunit B cytochrome bc1
Sinorhizobium fredii HH103.
Kata kunci: Metan, Bakteri metanotrof, Enzim pMMO
ABSTRACT
ANNISA RETNO FITRIANI. Characterization of Particulate Methane Monooxygenase (pMMO)
Gene of Methanotrophs from the Rice Field. Under direction of IMAN RUSMANA and ALINA AKHDIYA.
Metanotrophic bacteria are a methane oxidizing bacteria that have specific enzyme called methane monooxygenase (MMO). Application of metanotrophic bacteria can reduce emission of methane in rice fields. There are two types of MMO enzymes, i.e. soluble MMO (sMMO) and particulate MMO (pMMO). The pMMO enzyme is a membrane-bound enzyme that is present in all metanotrophic bacteria. BGM 1 and SKM 14 isolates showed a different colony morphology when grown on Nitrate Mineral Salt (NMS) medium + 1% methanol. The pMMO gene amplification using A189f and A682r primer showed a ~300 bp and ~500 bp of DNA band for BGM 1 and SKM 14 isolates respectively. The sequences were analyzed using BLAST-N and BLAST-X program. Analysis of amplicon sequence from BGM 1 using BLAST-N and BLAST-X program showed highest similarity with sequence of gene (87%) and amino acid in protein (71%) acyl-coA dehydrogenase Xanthobacter autotrophicus Py2 respectively. Whereas analysis of
amplicon sequence from SKM 14 using BLAST-N and BLAST-X program showed highest similarity with sequence of gene (84%) and amino acid in protein (62%) subunit B cytochrome bc1 Sinorhizobium fredii HH103 respectively.
iii
KARAKTERISASI GEN PARTICULATE METHANE
MONOOXYGENASE (pMMO) BAKTERI METANOTROF
ASAL SAWAH
ANNISA RETNO FITRIANI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Judul
: Karakterisasi Gen
Particulate Methane Monooxygenase
(pMMO)
Bakteri Metanotrof Asal Sawah
Nama
: Annisa Retno Fitriani
NIM
:
G34080114
Menyetujui:
Mengetahui:
Ketua Departemen Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Sc
NIP 196410021989031002
Tanggal Lulus:
Pembimbing II,
Alina Akhdiya, M.Si
NIP 196812082001122001
Pembimbing I,
Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si
NIP 196507201990021002
v
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya, sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Desember 2011 sampai 2012 ini ialah Karakterisasi Gen Particulate Methane Monooxygenase (pMMO) Bakteri Metanotrof Asal Sawah.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si dan Ibu Alina Akhdiya, M.Si atas bimbingan, bantuan pendanaan, dan pengarahan yang diberikan selama penelitian dan penyusunan skripsi ini. Terima kasih kepada Bapak Dr. Tri Atmowidi, M.Si. atas saran dan masukan yang telah diberikan sehingga tulisan ini menjadi lebih baik. Terima kasih juga kepada Papa, Mama, Teh Fifi, Kak Beny, Aziz, dan Tika atas segala doa, dukungan, dan kasih sayangnya. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Hadi Rakhmanto, Tri Lugina, Retno, Ayang, Raya, Rima, Rizqi Ammar, Nida, Rini, Tata, Tya, dan Desti atas dukungan dan bantuan yang diberikan. Terima kasih juga kepada keluarga besar laboratorium Mikrobiologi, Whendi, Citra, Andri, Azizah, Ai, Dita, Issanto, Aida, Prima, Putri, Kak Sipri, Mbak Lena, Pak Jaka, Bu Heni, Mas Aldian, serta teman-teman Biologi 45 atas segala doa, dukungan, dan perhatiannya. Serta pihak-pihak yang secara tidak langsung telah membantu dalam pengumpulan data karya ilmiah ini.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, November 2012
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Pekalongan pada tanggal 15 April 1991 dari ayah Joni Aliando dan Ibu Henny. Penulis merupakan anak kedua dari empat bersaudara.
Tahun 2008 penulis lulus dari SMA Negeri 5 Bogor dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui Seleksi Masuk Perguruan Tinggi Negeri. Penulis memilih program studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif menjadi anggota Divisi Pengembangan Sumber Daya Manusia (PSDM) Himpunan Mahasiswa Biologi (Himabio) pada tahun 2009-2010, Ketua Divisi Kesekretariatan Grand Biodiversity Biologi IPB tahun 2010, Sekretaris Masa Pengenalan Departemen (MPD) Biologi tahun 2010, Divisi Acara Workshop dan Diskusi Artikel Ilmiah Populer Biologi tahun 2010. Penulis menjadi peserta lomba Pekan Ilmiah Mahasiswa FMIPA tahun 2010 dengan judul “Ragam Cendawan Entomopatogen di Wahana Wisata Cangkuang”.
Penulis melakukan studi lapang di Taman Wisata dan Cagar Alam Pangandaran dengan judul makalah “Keragaman Kapang dan Khamir yang Berasosiasi dengan Serangga dan Sarang Serangga di Taman Wisata Alam Pangandaran”. Penulis juga melakukan Praktik Lapang di Perusahaan Daerah Air Minum (PDAM) Tirta Pakuan Kota Bogor pada bulan Juli 2011, dengan judul makalah “Manajemen Pengolahan Air di Perusahaan Daerah Air Minum Tirta Pakuan Kota Bogor”. Penulis juga menerima beasiswa Peningkatan Prestasi Akademik (PPA) pada tahun ajaran 2011-2012.
vii
DAFTAR ISI
Halaman DAFTAR TABEL ... iv DAFTAR GAMBAR ... iv DAFTAR LAMPIRAN ... iv PENDAHULUAN ... 1 Latar belakang ... 1 Tujuan ... 1BAHAN DAN METODE ... 1
Waktu dan Tempat ... 1
Bahan... ... 1
Metode Penelitian ... 1
Peremajaan dan Pengkulturan Bakteri Metanotrof... ... 1
Isolasi Genom, Amplifikasi Gen pMMO, dan Visualisasi Amplikon ... 1
Perunutan DNA dan Analisis Bioinformatika ... 2
HASIL ... 2
Peremajaan dan Pengkulturan Bakteri Metanotrof ... 2
Amplifikasi Gen pMMO dan Visualisasi Amplikon ... 2
Perunutan DNA dan Analisis Bioinformatika ... 3
PEMBAHASAN ... 3 SIMPULAN ... 4 SARAN ... 4 DAFTAR PUSTAKA ... 4 LAMPIRAN ... 6
DAFTAR TABEL
Halaman 1. Morfologi koloni isolat bakteri metanotrof BGM 1 dan SKM 14 pada media NMS ... 2 2. Hasil analisis sekuen amplikon gen pMMO dengan menggunakan program BLAST-N... . 3
3. Hasil analisis sekuen amplikon gen pMMO dengan menggunakan program BLAST-X ... 3
DAFTAR GAMBAR
Halaman 1. Koloni isolat bakteri metanotrof yang ditumbuhkan pada media NMS + 1% metanol.
(A) Koloni BGM 1 berwarna putih. (B) Koloni SKM 14 berwarna krem jingga ... 2 2. Pita DNA hasil amplifikasi gen pMMO dari isolat bakteri metanotrof BGM 1 dan
SKM 14... ... 3
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman 1. Komposisi media Nitrate Mineral Salt (NMS) 300 ml + 1% metanol ... 7
2. Sekuen pita DNA isolat BGM 1 dan SKM 14... 8 3. Hasil sekuen gen pMMO, BLAST-N, dan BLAST-X isolat BGM 1 dan SKM 14 ... 10
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Suasana anaerob pada bagian bawah sedimen sawah merupakan habitat yang sesuai untuk bakteri penghasil metan (metanogen). Bakteri metanogen menggunakan CO2, metil,
dan asetat sebagai sumber karbon yang kemudian diubah menjadi metan melalui proses metanogenesis. Sebaliknya pada permukaan sedimen terdapat oksigen terlarut sehingga suasananya menjadi aerob dan sangat cocok untuk pertumbuhan bakteri metanotrof. Bakteri metanotrof adalah bakteri Gram negatif yang menggunakan metan sebagai sumber karbon untuk menghasilkan energinya. Whittenburry et al. (1970) menggolongkan
bakteri metanotrof ke dalam lima genus berdasarkan perbedaan morfologi, tipe bentuk fase istirahat, struktur membran intrasitoplasma, dan beberapa karakter fisiologis. Kelima genus tersebut ialah
Methylomonas, Methylobacter, Methylococcus, Methylosistis, dan Methylosinus. Sedangkan
berdasarkan perbedaan jalur biosintesisnya (jalur RuMP dan Serin), bakteri metanotrof digolongkan menjadi tiga tipe, yaitu metanotrof tipe I (Methylomonas dan Methylobacter), tipe II (Methylosistis dan Methylosinus), dan tipe X (Methylococcus capsulatus) (Hanson & Hanson 1996).
Karakteristik penting dari metanotrof ialah memiliki enzim metan monooksigenase (MMO) yang dapat mengkatalisis metan menjadi metanol. Oksidasi metan oleh bakteri metanotrof di lahan sawah dapat mencapai 80% dari total metan yang diproduksi oleh bakteri metanogen (Conrad & Rothfus 1991). Selain dapat mengoksidasi metan, enzim MMO juga berperan dalam degradasi berbagai senyawa polutan seperti trikloroetilen, isomer-isomer dari dikloroetilen, vinil klorida, dan kloroform (Graham et al. 1992). Terdapat dua
tipe MMO, yaitu soluble MMO (sMMO) dan particulate MMO (pMMO) (Hanson &
Hanson 1996). Enzim pMMO merupakan enzim terikat membran yang dimiliki oleh seluruh bakteri metanotrof dan dapat terekspresi dalam media dengan kandungan tembaga yang tinggi. Sedangkan enzim sMMO hanya dimiliki oleh beberapa bakteri metanotrof dan dapat terekspresi dalam media dengan kandungan tembaga rendah (Stanley et al. 1983).
Laboratorium Mikrobiologi FMIPA IPB, telah mengoleksi beberapa isolat bakteri metanotrof yang berasal dari lumpur sawah di Bogor dan Sukabumi. Beberapa isolat telah
diidentifikasi secara molekular dan dikarakterisasi secara terbatas reaksi fisiologis dan biokimianya. BGM 1 merupakan isolat yang mampu mengakumulasi amonium lebih tinggi dibandingkan isolat lainnya, sedangkan SKM 14 merupakan isolat yang memiliki nilai oksidasi metan tertinggi (Hapsari 2008). Hasil analisis gen 16S rRNA yang dilakukan oleh
Astuti (2009) memperlihatkan bahwa BGM 1 memiliki tingkat kemiripan 74% dengan
Methylocystis rosea strain SV97T dan SKM 14
memiliki tingkat kemiripan 65% dengan
Methylobacter sp. Clone
GASP-OKA-565-E11. Kedua isolat tersebut memiliki enzim pMMO namun belum dilakukan karakterisasi gennya. Informasi mengenai karakterisasi gen
pMMO dari isolat BGM 1 dan SKM 14 dapat
digunakan landasan ilmiah untuk pemanfaatan bakteri tersebut di lahan pertanian.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi gen particulate methane monooxygenase (pMMO) pada metanotrof asal
sawah Bogor dan Sukabumi.
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Desember 2011 sampai Agustus 2012 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA, IPB.
Bahan
Bakteri yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat bakteri metanotrof BGM 1 dan SKM 14. Kedua bakteri ini diisolasi dari lumpur sawah asal Bogor dan Sukabumi (Hapsari 2008).
Metode
Peremajaan dan Pengkulturan Bakteri Metanotrof. Kultur bakteri metanotrof diremajakan dan dikulturkan pada media agar NMS + 1% metanol (Lampiran 1) dengan teknik gores kuadran. Inkubasi dilakukan pada suhu ruang selama 3-14 hari.
Isolasi DNA Genom, Amplifikasi Gen
pMMO, dan Visualisasi Amplikon. DNA
genom diisolasi dari kultur padat bakteri metanotrof yang ditumbuhkan dengan cara sebagaimana disebutkan diatas. Isolasi DNA genom dilakukan menurut metode Lazo (Lazo
et al. 1987). Amplifikasi gen penyandi pMMO
dilakukan menggunakan primer spesifik, yaitu A189F (GGNGACTGGGACTTCTGG) dan
A682r (Bourne et reaksi PCR sebagai ber Buffer KOD µl dNTPs, 1 DNA templa Polymerase selama 30 (Perkin El kondisi rea denaturasi ( menit), ann (72ºC, 1 m menit). Am agarosa kem Bromide ( dilakukan Translumina Perunu Bioinforma DNA hasil memanfaatk Base di Si dibandingka terdapat pad Blast-N dan Center for mengetahui isolat yang menggunaka Alignment E al. 2011). Peremajaan Metanotrof Isolat SKM 14 ya + 1% meta morfologi k Gambar 1). putih dan ko jingga. Kec isolat juga lebih cepat d (GAASGC al. 2001). To sebanyak 50 rikut: 31,5 μ D Hot Start, 3 1,5 μl masing-ate, dan 1 μl (1U/μl). A siklus mengg lmer Biosyst aksi PCR se 94ºC, 5 menit nealing (54ºC menit), dan po mplikon dilar mudian diwar (EtBr). Visu menggunaka ator. utan DNA atika. Perunu l amplifikasi kan jasa perus ingapura. Sek an dengan da GenBank m n Blast-X dari Biotechnology tingkat kemir dianalisa. An an software Editor dan M
HA
n dan Pen f bakteri meta ang ditumbuhk anol selama 1 koloni yang b Koloni isol oloni isolat SK cepatan pertum berbeda. Iso dibandingkan CNGAGAAGA otal volume ca μl dengan ko μl ddH2O, 5 3 μl 25mM M -masing prime KOD Hot Sta Amplifikasi d gunakan mes tem, USA) ebagai beriku t), denaturasi C, 1 menit), ost-elongasi ( rikan pada rnai dengan E ualisasi pita an perangka A dan utan nukleotid i dilakukan sahaan sekuen kuen yang d data sekuen menggunakan situs NCBI (N gy Information ripan gen pMM nalisis bioinfo Bioedit S MEGA 5.0 (TaSIL
ngkulturan anotrof BGM kan pada med 14 hari menu berbeda (Tabe at BGM 1 b KM 14 berwar mbuhan kolon olat BGM 1 isolat SKM 1 AASGC) ampuran omposisi µl 10x MgSO4, 5 er, 1,5 μl art DNA dilakukan sin PCR dengan ut: pra-(94ºC, 1 elongasi (75ºC, 7 1% gel Ethidium a DNA at UV-Analisis da pada dengan nsing 1st diperoleh n yang program National n) untuk MO dari formatika Sequence amura et Bakteri M 1 dan dia NMS unjukkan el 1 dan berwarna rna krem ni kedua tumbuh 4. T S G A A m m u S Tabel 1 M m pa Isolat M BGM 1 SKM 14 l Gambar 1 K ya N B K jin Amplifikasi Amplikon Visualisasi menggunakan menunjukkan untuk isolat B SKM 14 (Gam Morfologi ko metanotrof BG ada media NM Morfologi kolo Putih, licin, cembung Krem jingga, licin, cembun Koloni isolat ang ditumbu NMS + 1% m GM 1 berw Koloni SKM ngga. Gen pMMO i DNA n primer A pita DNA b BGM 1 dan ~ mbar 2). loni isolat b GM 1 dan SK MS oni Kecep tumb 12 ha , ng 10 ha bakteri meta uhkan pada metanol. (A) K rwarna putih 14 berwarna O dan Visu hasil ampl A189f dan berukuran ~3 ~500 bp untuk (A (B bakteri KM 14 atan buh ari ari anotrof media Koloni h. (B) a krem ualisasi lifikasi A682r 300 bp k isolat A) B)Gambar 2 Perunutan Bioinforma Hasil (Lampiran 2 BLAST-N 87% (245/2 sekuen gen Xanthobacte sekuen a menunjukka nukleotida o B cytochrom HH103 (Ta menggunaka sekuen amp kemiripan dehydrogena BG8. Sedan menunjukka Cytochrome (Tabel 3 dan
M
Pita DNA h pMMO da metanotrof B (Keterangan DNA ladder, Sumur 2 = BG DNA atika analisis seku 2) BGM 1 m menunjukkan 281 nukleoti n acyl-coA er autotrophi amplikon p an tingkat kem overlap) denga me bc1 pada abel 2 dan L an program likon BGM 1 71% d ase pada Methngkan sekuen an tingkat ke e b pada M n Lampiran 3)
1
hasil amplifik ari isolat BGM 1 dan S M = mark , Sumur 1 = S GM 1). dan uen amplikon menggunakan n tingkat ke ida overlap) dehydrogenas icus Py2. Se pMMO SKM miripan 84% ( an sekuen gen Sinorhizobiu Lampiran 3). BLAST-X menunjukkan dengan A hylomicrobium n amplikon S miripan 62% Methylocystis s ).~ 5
~ 30
2
kasi gen bakteri SKM 14. ker 1 kb SKM 14, Analisis pMMO program emiripan dengan se pada edangkan M 14 (135/160 n subunit um fredii Analisis terhadap n tingkat Acyl-CoA m album SKM 14 % dengan sp. SC2 T I B S a b T I B S m d p j d B m t s S p ( F d d500 bp
00 bp
Tabel 2 Has pMM pro Isolat Sekue yang BGM 1 dehydGen a p Xanth autot SKM 14 Gen s cyto bc Sinor fredi a 245/281 nukl b 135/160 nuk Table 3 Has pMM pro Isolat Sekue yang BGM 1 Acy dehyd p Methy bium B SKM 14 Cytocp Meth sp Isolat b memiliki mo dengan SKM putih sedang ingga (Tabe dipengaruhi o Bakteri metan macam pigme terlarut sepert sering ditemu Selain itu, produksi pig (Hanson & Ha Frenzel 2001) dan karotenoi dipengaruhi o sil analisis se MMO denga gram BLAST en bakteri homolog i acyl-coA drogenase pada hobacter trophicus Py2 subunit B ochrome 1 pada rhizobium i HH103 leotida overlap kleotida overlasil analisis sek
MMO denga gram BLAST en bakteri homolog i yl-CoA drogenase pada ylomicro m album BG8 chrome b pada hylocystis p. SC2
PEMBAH
bakteri met orfologi kolo 14. Koloni kan SKM 1 el 1). Warn oleh pigmen y notrof mengh en terlarut dan ti putih, krem ukan (Murrell beberapa pe gmen kuning anson 1996), , serta pigmen id (Holt et al oleh faktor ge ekuen ampliko an menggu T-N % identitas akN 87%a C 07 84%b H 68 ap ap kuen ampliko an menggu T-X % dentitas akN 71% ZP 98 56 62% YP 06 02HASAN
tanotrof BG oni yang b i BGM 1 ber 14 berwarna na koloni b yang diproduk hasilkan berm n tak larut. P m, dan oranye l & Dalton eneliti melap g atau keco pink muda (E n oranye kem . 1994). Pigm enetis, faktor3
on gen unakan No. kses CP00 781. 1 HE61 890. 1 on gen unakan No. kses P_0 865 66.1 P_0 659 200. 1 GM 1 erbeda rwarna krem bakteri ksinya. macam-Pigmen e lebih 1992). porkan oklatan Eller & erahan mentasi r umurbiakan, dan tahapan fisiologis bakteri (Murrell & Dalton 1992).
Oksidasi metan pada bakteri metanotrof diinisiasi oleh enzimmethane monooxygenase
(MMO) yang mampu menambahkan satu atom oksigen ke dalam molekul metan untuk membentuk senyawa metanol. Selain mengkatalisis reaksi oksidasi metan, enzim MMO terikat membran (pMMO) juga berperan dalam proses degradasi senyawa hidrokarbon terhalogenasi seperti trikloroetilen (Dispirito et al. 1992). Enzim pMMO tersusun atas tiga
subunit yaitu α, β, dan γ yang masing-masing disandikan oleh gen pmoA, pmoB, dan pmoC
(Semrau et al. 1995).
Amplifikasi gen pMMO menggunakan
primer A189f dan A682r menghasilkan pita DNA dengan ukuran ~500 bp dan ~300 bp berturut-turut untuk isolat BGM 1 dan SKM 14. Analisis sekuen amplikon dari BGM 1 menggunakan program BLAST-N dan BLAST-X berturut-turut menunjukkan kemiripan tertinggi dengan sekuen gen (87%) dan asam amino pada protein (71%) acyl-coA dehydrogenase Xanthobacter autotrophicus
Py2. Sedangkan analisis sekuen amplikon dari SKM 14 menggunakan program BLAST-N dan BLAST-X berturut-turut menunjukkan kemiripan tertinggi dengan sekuen gen (84%) dan asam amino pada protein (62%) subunit B cytochrome bc1 Sinorhizobium fredii HH103.
Hasil analisis kedua sekuen amplikon tersebut tidak sesuai dengan gen target (pMMO
pada bakteri metanotrof). Ketidaksesuaian hasil analisis tersebut diduga disebabkan antara lain oleh spesifitas primer yang rendah, sekuen yang dianalisis terlalu pendek, atau keterbatasan data base pada GeneBank.
Primer A189F/A682r diduga kurang spesifik untuk mengamplifikasi gen pMMO
bakteri tropis walaupun primer ini berhasil diaplikasikan untuk mendeteksi serta menganalisis keragaman gen pMMOA
metanotrof di padang rumput dan oaks di Denmark (Bourne et al. 2001). Holmes et al.
(1995) melaporkan bahwa primer A189F/A682r juga dapat mengamplifikasi gen
Ammonium Mono-oxygenase (AMO) yang
terdapat pada bakteri pengoksidasi amonium. Selain primer tersebut, gen pMMO juga dapat
diamplifikasi menggunakan primer A189f/mb661 yang lebih spesifik untuk mendeteksi gen pMMO bakteri metanotrof
(Bourne et al. 2001).
Ketepatan dan nilai tingkat kemiripan pada hasil analisis kesejajaran sekuen menggunakan program BLAST-N dan BLAST-X juga sangat dipengaruhi oleh
panjang sekuen DNA yang dianalisis dan kelengkapan data base yang terdapat pada GeneBank. Semakin panjang sekuen yang dianalisis dan semakin banyak data base yang terdapat pada GeneBank, maka semakin tinggi tingkat ketepatan dan nilai tingkat kemiripan yang akan diperoleh. Sebagian besar data yang terdapat pada GenBank berasal dari sampel daerah temperate. Sedangkan sekuen DNA
yang dianalisis pada penelitian ini berasal dari bakteri tropis. Oleh karena itu, hasil analisis sekuen amplikon gen pMMO yang diperoleh
dalam penelitian ini tidak sesuai dengan gen target.
SIMPULAN
Morfologi isolat BGM 1 dan SKM 14 memperlihatkan perbedaan warna koloni, tepian, dan elevasi. BGM 1 memperlihatkan warna koloni putih, tepian licin, dan elevasi cembung, sedangkan SKM 14 memperlihatkan warna koloni krem jingga, tepian licin, dan elevasi cembung. Analisis sekuen amplikon dari BGM 1 menggunakan program BLAST-N dan BLAST-X berturut-turut menunjukkan kemiripan tertinggi dengan sekuen gen (87%) dan asam amino pada protein (71%) acyl-coA dehydrogenase Xanthobacter autotrophicus
Py2. Sedangkan analisis sekuen amplikon dari SKM 14 menggunakan program BLAST-N dan BLAST-X berturut-turut menunjukkan kemiripan tertinggi dengan sekuen gen (84%) dan asam amino pada protein (62%) subunit B cytochrome bc1 Sinorhizobium fredii HH103.
Ketidaksesuaian hasil analisis tersebut diduga disebabkan antara lain oleh spesifitas primer yang rendah, sekuen yang dianalisis terlalu pendek, atau keterbatasan data base pada GeneBank.
SARAN
Perlu dilakukan lebih lanjut penelitian terhadap gen pMMO BGM 1 dan SKM 14
dengan menggunakan primer yang lebih spesifik.
DAFTAR PUSTAKA
Astuti DD. 2009. Karakterisasi Fisiologi dan Identifikasi Molekuler Isolat-Isolat Bakteri Metanotrof Asal Sawah Wilayah Bogor dan Sukabumi [skripsi]. Bogor: Fakultas MIPA, Institut Pertanian Bogor.
5
Bourne DG, McDonald IR, Murrell JC. 2001. Comparison of pmoA PCR primer sets as
tools for investigating methanotroph diversity in three Danish soils. Appl Environ Microbiol 67:3802-3809.
Conrad R and Rothfus F. 1991. Methane oxidation in the soil surface layer of aflooded rice field and the effect of ammonium. Biol Fertil Soil 12:28-32.
Dispirito AA et al. 1992. Trichloroethylene
oxidation by the membrane associated methane monooxygenase in type I, type II and type X methanotrophs.
Biodegradation 2:151–164.
Eller G, Frenzel P. 2001. Changes in activity and community structure of methane-oxidizing bacteria over the growth period of rice. Appl Environ Microbiol
67:2395-2403.
Graham DW, Korich DG, Leblanc RP, Sinclair NA, Arnold RG. 1992. Application of a colorimetric plate assay for soluble methane monooxygenase activity. Appl Environ Microbiol 58:2231-2236.
Hanson R, Hanson TE. 1996. Metanotropic bacteria. J Microbial Rev 60:439-471.
Hapsari W. 2008. Isolasi dan karakterisasi bakteri metanotrof asal sawah di Bogor dan Sukabumi [skripsi]. Bogor : Institut Pertanian Bogor.
Holmes AJ, Costello A, Lidstrom ME, Murrell JC. 1995. Evidence that particulate methane monooxygenase and ammonia monooxygenase may be evolutionarily
related. FEMS Microbiol Lett 132:203–
208.
Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA, Staley JT, Williams ST. 1994. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Ed ke-9.
Lippincott William & Wilkins: a Wolter Kluwer Co.
Lazo GR, Roffey R, Gabriel DW. 1987. Conservation of plasmid DNA sequences and pathovar identification of strain
Xantholomonas campestris. Pytopathology 77: 1461-1467.
Murrell JC, Dalton H. 1992. Methane and Methanol Utilizers. New York:
Springer-Verlag.
Semrau et al. 1995. Particulate methane
monooxygenase genes in methanotrophs.
J Bacteriol 177:3071-3079.
Stanley SH, Prior SD, Leak DJ, Dalton H. 1983. Copper stress underlies the fundamental change in intracellular location of methane monooxygenase in methane-oxidizing organisms: studies in batch and continuous culture. Biotechnol Lett 5:487-492.
Tamura K et al. 2011. MEGA5: Molecular
evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol Biol Evol 28:2731-2739.
Whittenburry RKC, Phillips, Wilkinson JG. 1970. Enrichment, isolation and some properties of methane utilizing bacteria. J Gen Microbiol 61:205-218.
7
Lampiran 1 Komposisi media Nitrate Mineral Salt (NMS) 300 ml + 1% metanol
1. 120 µl NH4Cl 2. 1200 µl CaCl2 3. 0.3 g MgSO4 4. 150 µl Trace Element 5. 1632 µl KH2PO4 6. 0.3 gr NaNO3 7. 2151 µl Na2HPO4 8. 6 g agar 9. 300 ml akuades 10. 1% metanol
Lampiran 2 Sekuen pita DNA isolat BGM 1 dan SKM 14 BGM 1
Lampiran 3 Hasil sekuen gen pMMO, BLAST-N, dan BLAST-X isolat BGM 1 dan SKM 14
A. Urutan nukleotida gen pMMO isolat BGM 1
ACGACACCGTGAGGAAGAAGGGGTCCACCACCTCGTCGTTGGACTTGTCG CCGTCGACGATGGGGCCCACGAGAGCCTCCTTGGACATCACCTCCTTTTC CACCACGATGGGCCCCGACTGGTTGCCGCGGAGGCCCAGGCCGTCCCACT CGGAGGGGTTGGCCTTCACCTCGTCCTTGGTGACGAGGAAGGGGAAAGGT CGGAATAGTCACCAGAGAATCCGGGGCTGGTGGTCTGCACTATGTACCAG TCTCAAAAGCCTCCGGAGGTGGTCCAGGAGGCCTTCTTCTCCGCCT B. Hasil BLAST-N sekuen gen pMMO isolat BGM 1 dengan data GenBank
11
D. Urutan nukleotida gen pMMO isolat SKM 14
CAACCTGTTCTCGTCTCTGAACGAGATCATCCCGGGTGTCGGCACCGCCATCGTCG AATGGCTGTGGGGCGGCTACTCCGTCTCCGGCACGACGCTGAACCGCTTCTTCTCG CTCCACTACCTGCTGCCGTTCGTGCTTGCCGGCCTGGTCGTCCTGCACATCTGGGC GCTGCACGTCGCGGGTCAGAACAATCCGACGGGTCTCGACATCAAGACCAAGGCC GACGCCGTGCCGATGTTCCCGTTTGCGGTTGCCAAGGACGCAGTCGGCCTGTTCGC GTTCCTGCTGCTGTTCGCCT
