PERFORMA ANALITIK ELKTRODE ENZIM GLUKOSA DEHIDROGENASE FLAVIN ADENIN DINUKLEOTIDA TERIMOBILISASI ZEOLIT TIPE A UNTUK DETEKSI GLUKOSA

PERFORMA ANALITIK ELKTRODE ENZIM GLUKOSA DEHIDROGENASE

FLAVIN ADENIN DINUKLEOTIDA TERIMOBILISASI ZEOLIT TIPE A UNTUK

DETEKSI GLUKOSA

1)

Raudhatul Fadhilah

,

2)

Latifah Kosim Darusman

,

3)

Dyah Iswantini

1)

Program Studi Pendidikan Kimia Universitas Muhammadiyah Pontianak, Pontianak (email: raudhatul_fadhilah@yahoo.com)

2)

Departemen Kimia Institut Pertanian Bogor, Bogor 3)

Pusat Studi Biofarmaka, Bogor

ABSTRACT

A glucose sensor was developed to measure glucose levels, both of blood glucose and

glucose in the foods and beverages. The analytical performance of these new glucose

sensors was continuously improved, producing better linearity and sensitivity. The technique

selection and immobilization matrix are key factors for sensor development, so that the

prospecting of materials that can be used as a matrix for supporting enzyme, continue to be

explore. The purpose of this study was to determine the linearity and sensitivity of the

enzyme glucose dehydrogenase (GDH) that were immobilized on zeolite type A. The

resulting enzyme electrode with zeolite type A showed linearity were 0.06 mM-10.00 mM.

Linear range that result is quite narrow when compared with the normal range of blood

glucose concentration in humans is from 4 to 6 mM, so that GDH-FAD enzyme electrode

with zeolite type A is more suitable to use in the determination of glucose concentration in

the foods and beverages. A GDH-FAD enzyme electrode showed a high sensitivity were

2.41 µA mM

-1

. High sensitivity was achieved by combining two immobilization techniques,

physical adsorption on zeolite and entrapment on carbon paste, so that electron transfer

becomes faster and efficient.

Keywords: enzyme electrode, linearity, sensitivity, zeolite type A

ABSTRAK

Sensor glukosa telah dikembangkan secara luas untuk mengukur kadar glukosa, baik

glukosa darah maupun glukosa dalam makanan dan minuman. Performa analitik sensor

glukosa terus ditingkatkan untuk menghasilkan sensor dengan rentang kerja dan sensitivitas

yang semakin baik. Faktor kunci keberhasilan dalam pengembangan sensor glukosa

berbasis enzim adalah ketepatan penggunaan teknik dan matriks imobilisasi sehingga

eksplorasi material yang dapat digunakan sebagai matriks pengimobilisasi terus dilakukan.

Tujuan dari penelitian ini adalah menentukan linearitas dan sensitivitas elektrode enzim

glukosa dehidrogenase flavin adenin dinukleotida (GDH-FAD) yang diimobilisasi pada zeolit

tipe A. Hasil penelitian menunjukkan bahwa elektrode enzim GDH-FAD yang diimobilisasi

dengan zeolit tipe A menghasilkan linearitas 0.06 mM-10.00 mM. Daerah linear yang

dihasilkan cukup sempit jika dibandingkan dengan rentang konsentrasi glukosa darah

normal pada manusia yaitu dari 4 sampai 6 mM, sehingga elektrode enzim GDH-FAD

dengan zeolit tipe A lebih cocok diaplikasikan dalam makanan dan minuman. Elektrode

enzim GDH-FAD menunjukkan sensitivitas yang tinggi yaitu 2,41 µA mM

-1

, hal ini

disebabkan oleh penggunaan dua teknik imobilisasi, yaitu adsorpsi fisik antara enzim

dengan zeolit dan penjebakan enzim dalam pasta karbon sehingga transfer elektron menjadi

lebih cepat dan efisien.

1. PENDAHULUAN

Pembangunan kesehatan Indonesia diarahkan guna meningkatkan kesadaran,

kemauan dan kemampuan hidup sehat bagi setiap penduduk agar terwujud derajat

kesehatan yang optimal. Perubahan gaya hidup terutama di kota-kota besar, menyebabkan

meningkatnya prevalensi penyakit degeneratif, seperti penyakit jantung koroner, hipertensi,

hiperlipidemia, diabetes mellitus dan lain-lain

[1]

. Kemajuan dan inovasi ilmu pengetahuan

dan teknologi di bidang kesehatan, memungkinkan dilakukannya upaya pengendalian

berupa kegiatan promosi dan pencegahan serta penanggulangan penyakit termasuk

penyakit tidak menular

[2]

. Penyakit tidak menular (PTM) bukan saja masalah di negara

industri, tetapi juga merupakan masalah di negara berkembang

[3]

. Berdasarkan estimasi

terkini dari WHO, penyakit tidak menular menyebabkan sekitar 52% kematian dan 38%

beban penyakit di SEAR (South East Asia Region), yaitu Bangladesh, Butan, India,

Indonesia, Korea Utara, Maldives, Myanmar, Nepal, Sri Lanka, dan Thailand. Penyakit tidak

menular seperti kanker, gangguan respirasi, kardiovaskular dan diabetes mellitus dapat

menimbulkan kerugian sosial ekonomi, khususnya masyarakat yang sedang berkembang

termasuk negara maju

[3]

.

Diabetes mellitus (DM) adalah penyakit kronis yang ditandai dengan kadar glukosa

darah yang tinggi akibat pankreas tidak memproduksi insulin yang cukup atau ketika tubuh

tidak dapat secara efektif menggunakan insulin yang dihasilkan. Berdasarkan data Badan

Kesehatan Dunia (WHO) pada tahun 2011, 346 juta orang di seluruh dunia mengidap

diabetes. Untuk Indonesia, WHO memprediksi kenaikan jumlah penderita DM dari 8,4 juta

pada tahun 2000 menjadi sekitar 21,3 juta pada tahun 2030. Tingginya angka tersebut

menjadikan Indonesia peringkat keempat jumlah penderita DM terbanyak di dunia setelah

Amerika Serikat, India, dan Cina

[4]

. Pendekatan baru untuk mendiagnosis, mengobati,

mengenali lebih awal dan pencegahan penyakit tersebut diperlukan untuk menghadapi

tantangan ini. Bagi penderita DM, menjaga glukosa darah mendekati normal dapat

mengurangi resiko komplikasi lanjutan. Untuk menjaga tingkat glukosa darah pada daerah

aman, diperlukan alat untuk memantau glukosa darah. Saat ini, sensor untuk keperluan

tersebut masih diimpor dari negara lain dengan harga yang relatif mahal. Oleh karena itu,

dibutuhkan penelitian yang intensif untuk mengembangkan pemenuhan biosensor yang

murah, akurat dan mudah penggunaanya.

Biosensor di dunia pertama kali dikembangkan oleh Leland Clark tahun 1956. Clark

menggunakan enzim glukosa oksidase (GOD) sebagai komponen pengenal analit yang

bereaksi spesifik dengan glukosa dan secara alamiah dihasilkan dari jamur Aspergillus

niger. Mekanisme kerja enzim ini sangat bergantung pada keberadaan oksigen. Akibatnya,

sama. Hal tersebut, mendorong penggantian enzim GOD dengan enzim glukosa

dehidrogenase (GDH). Enzim GDH spesifik terhadap substrat glukosa dan aktivitasnya tidak

dipengaruhi oleh kadar oksigen

[5]

. Koenzim yang cocok untuk membuat biosensor yang

tidak memerlukan O

2

sebagai akseptor elektron atau nikotin adenin dinukleotida (NAD)

sebagai koenzim, salah satunya adalah flavin adenin dinukleotida (FAD)

[6]

.

Perkembangan biosensor glukosa sampai saat ini di antaranya adalah elektrode enzim

GOD dengan film nanokomposit kitosan/grafena/nanopartikel emas yang dibuat oleh Shan

et al. (2010)

[7]

menunjukkan bahwa sensitivitas sensor glukosa sebesar 0.55 µA mM

-1

dengan daerah linear antara 2 sampai 10 mM (R = 0.999). Biosensor glukosa amperometri

memanfaatkan GDH-FAD yang diimobilisasi pada nanokomposit elektrode menghasilkan

sensitivitas 2.20 µA mM

-1

dengan menghasilkan 2 daerah linear, yaitu antara 50 sampai 960

µM dan dari 70 sampai 620 µM

[5]

.

Faktor kunci keberhasilan Monosik et al. (2012)

[5]

menghasilkan sensitivitas sensor

yang tinggi dikarenakan penggunaan kitosan sebagai matriks pengimobilisasi enzim. Enzim

diadsorpsi pada kitosan model sandwich sehingga menyediakan lingkungan yang hidrofilik

yang cocok dengan enzim. Oleh karena itu pencarian material lain sebagai matriks

pengimobilisasi enzim perlu dieksplorasi. Salah satu kandidat material yang paling

menjanjikan sebagai matriks pendukung adsorpsi enzim GDH adalah zeolit. Hal ini

disebabkan oleh sifat zeolit yang memiliki karakteristik struktur yang unik dan tahan

terhadap biodegradasi serta permukaan dapat dimodifikasi dan mudah disiapkan dengan

rongga mulai dari mikro pori (< 20 Å)

[8]

. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan menentukan

linearitas dan sensitivitas elektrode enzim glukosa dehidrogenase flavin adenin dinukleotida

(GDH-FAD) yang diimobilisasi pada zeolit tipe A.

2. METODE PENELITIAN

Penelitian ini terdiri atas 4 tahap. Tahap pertama yaitu pembuatan dan karakterisasi

elektrode pasta karbon. Tahap kedua, yaitu imobilisasi enzim GDH pada matriks zeolit tipe

A dan permukaan elektrode pasta karbon. Tahap ketiga, yaitu penentuan performa analitik

meliputi: sensitivitas dan linearitas pengukuran dengan metode elektrokimia.

2.1 Pembuatan dan karakterisasi elektrode pasta karbon

[9]

Elektrode pasta karbon dibuat dari campuran grafit dan parafin cair 2:1. Grafit dicampur

dengan parafin cair hingga membentuk pasta. Kemudian pasta karbon dimasukkan ke

dalam badan elektrode hingga memadat sampai ke permukaan kaca. Permukaan kaca

elektrode dihaluskan dan dibersihkan dengan ampelas dan kertas minyak. Elektrode ini

selanjutnya dikarakterisasi dengan elektrolit pendukung KCl 0.10 M menggunakan teknik

voltametri siklik. Pengukuran ini menggunakan elektrode pembanding Ag/AgCl dan

elektrode bantu kawat platina.

2.2 Imobilisasi enzim GDH pada zeolit tipe A

Enzim GDH diimobilisasi dengan metode adsorpsi menggunakan nanopartikel zeolit

dengan memodifikasi penelitian Salih (2012)

[10]

. Modifikasi yang dilakukan yaitu

penggantian enzim urease dengan enzim GDH. Imobilisasi enzim GDH dilakukan dengan

menyiapkan 8.0 U/mL enzim GDH, gliserol (10%). Setelah itu, zeolit tipe A dengan

komposisi tertentu dicampurkan dengan gliserol (10%) dan 1 mL larutan enzim GDH

kemudian diaduk hingga homogen. Campuran selanjunya dishaker selama 24 jam.

Kemudian larutan diteteskan pada permukaan elektrode pasta karbon dan didiamkan hingga

pelarutnya menguap/mengering. Selanjutnya permukaan elektrode dilapisi dengan membran

dialisis, ditutup dengan jaring nilon, dan diikat dengan parafilm. Elektrode kemudian

direndam dalam bufer fosfat pada suhu 5 ºC ketika tidak digunakan, untuk memberikan

keadaan yang sama dengan lingkungan sebenarnya. Elektrode dapat langsung digunakan

untuk pengukuran aktivitas GDH secara elektrokimia.

2.3 Penentuan parameter analitik

Sensitivitas metode analisis adalah perbandingan perubahan respon instrumental

terhadap perubahan konsentrasi analit. Sensitivitas diperoleh dari nilai kemiringan kurva.

Penentuan konsentrasi linear ditetapkan melalui pengukuran larutan standar D-glukosa

pada kondisi optimum elektrode dan parameter instrumen pada berbagai rentang

konsentrasi. Arus puncak yang terbaca dialurkan terhadap konsentrasi larutan standar untuk

memperoleh kurva kalibrasi. Linearitas dan daerah kerja diperoleh dari interpretasi kurva

kalibrasi. Konsentrasi yang memberikan hubungan linear adalah rentang konsentrasi kerja

elektrode. Hubungan yang linear dinyatakan dengan koefisien korelasi (r) yang mengikuti

Persamaan 1.

- =

∑ 0123 342̅617347 8 69

0:∑ 123 342̅6;<:∑ 173 347=6;<9>/;

(1)

Dengan x

i

adalah konsentrasi larutan D-glukosa ke-i, @̅ adalah konsentrasi rata-rata larutan

D-glukosa, y

i

adalah arus puncak yang terukur pada konsentrasi larutan D-glukosa ke-i dan

3. BAHAN DAN ALAT

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah enzim GDH berasal dari

Aspergillus sp. dengan aktivitas 1050 U/mg dibeli dari Sekisui Inggris, FADNa

2.

×H

2

O dibeli

dari Sigma, aquabides, air bebas ion, NaCl, KCl, gliserol, grafit, parafin cair, D-glukosa,

kalium ferisianida, larutan bufer fosfat, membran dialisis, NaOH, gas N

2

, amonium serium

sulfat, etanol, metanol, zeolit tipe A.

Alat atau instrumen yang digunakan dalam penelitian antara lain eDAQ

Potensiostat-Galvanostat (Ecorder 410) yang dilengkapi dengan perangkat lunak Echem v2.1.0 dengan

sistem 3 elektrode (elektrode Ag/AgCl sebagai elektrode pembanding, elektrode pasta

karbon sebagai elektrode kerja, elektrode platina sebagai elektrode bantu), sel elektrokimia,

scanning electron microscopy (SEM), pipet mikro serta alat-alat gelas yang lazim digunakan

di laboratorium.

4. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Imobilisasi enzim GDH pada zeolit tipe A

Imobilisasi enzim bertujuan meningkatkan sensitivitas enzim. Imobilisasi yang dilakukan

melalui model dengan ilustrasi seperti pada Gambar 1 berikut.

Gambar 1. Imobilisasi enzim pada zeolit tipe A

Gambar 1 memperlihatkan bahwa enzim diimobilisasi pada zeolit tipe A dan elektrode

pasta karbon. Pada model ini menggabungkan dua teknik imobilisasi (adsorpsi fisik dan

penjebakan), yaitu enzim diimobilisasi terlebih dahulu pada nanopartikel zeolit kemudian

diteteskan pada elektrode pasta karbon dan ditutup dengan membran dialisis. Untuk

mengetahui enzim telah terimobilisasi pada zeolit tipe A, dilakukan pencirian dengan

menggunakan SEM (Gambar 2).

+_δ

H H H H

δ+

O O O O

Elektrode pasta karbon

Membran

Zeolit

C

δ-

-δ

Gambar 2. Citra SEM (a) zeolit tipe A dan (b) enzim terimobilisasi pada zeolit tipe A

Keterangan: anak panah menunjukkan enzim

Gambar 2a memperlihatkan permukaan zeolit tipe A sebelum diimobilisasi, sementara

Gambar 2b memperlihatkan bahwa enzim telah terimobilisasi ke dalam matriks zeolit tipe A

yang ditandai dengan permukaan zeolit tipe A menjadi lebih kasar karena tertutupi oleh

enzim.

4.2 Parameter Analitik

Sensitivitas metode analisis adalah perbandingan perubahan respon instrumental

terhadap perubahan konsentrasi analit. Elektrode enzim dengan zeolit tipe A menunjukkan

nilai sensitivitas sebesar 2.41 µA mM

-1

. Semakin besar nilai sensitivitas menunjukkan bahwa

sedikit perubahan konsentrasi memberikan perubahan respon yang cukup besar

[11]

.

Elektrode enzim dengan zeolit A memiliki nilai sensitivitas lebih tinggi jika dibandingkan

dengan penelitian Monosik et al. (2012)

[5]

yang mengimobilisasi enzim GDH pada

nanokomposit kitosan yang memperoleh nilai sensitivitas sebesar 2.20 µA mM

-1

dan

elektrode enzim GOD dengan film nanokomposit kitosan/grafena/nanopartikel emas yang

dibuat oleh Shan et al. (2010)

[7]

,

yaitu sebesar 0.55 µA mM

-1

.

Daerah linear enzim dapat diketahui dengan mengukur aktivitas GDH dengan

memvariasikan konsentrasi substrat glukosa pada rentang konsentrasi 0.00 – 35.00 mM.

Linearitas hasil pengukuran diperlihatkan pada Gambar 3.

Gambar 3. Linearitas pengukuran kerja enzim GDH. Error bars = ± standar deviasi

Daerah linear untuk elektrode enzim dengan zeolit A (Gambar 3) berada pada rentang

konsentrasi 0.06–10.00 mM. Rentang konsentrasi ini tergolong sempit, karena rentang

konsentrasi glukosa darah normal pada manusia yaitu dari 4 sampai 6 mM

[7]

, sehingga

elektrode enzim dengan zeolit A kurang cocok diaplikasikan dalam penentuan konsentrasi

glukosa darah. Elektrode enzim dengan zeolit A lebih cocok diaplikasikan dalam penentuan

konsentrasi glukosa dalam makanan atau minuman.

5. KESIMPULAN DAN PROSPEK

Zeolit tipe A berhasil digunakan sebagai matriks imobilisasi enzim GDH dalam

meningkatkan sensitivitas enzim GDH, dengan nilai sensitivitas sebesar 2.41 µA mM

-1

.

Elektrode enzim dengan zeolit tipe A menghasilkan daerah kerja yang sempit 0.06-10.00

mM sehingga lebih cocok diaplikasikan dalam penentuan kadar glukosa dalam makanan

dan minuman. Penelitian lanjutan diperlukan untuk mengaplikasikan biosensor GDH-FAD

yang diimobilisasi pada zeolit tipe A ke dalam sampel makanan dan minuman sehingga

biosensor ini dapat digunakan untuk mengontrol makanan dan minuman yang mengandung

glukosa.

6. UCAPAN TERIMAKASIH

Kami mengucapkan terima kasih kepada Dr. Zaenal Abidin dari Divisi Kimia Anorganik

Departemen Kimia IPB yang telah menyediakan zeolit tipe A.

7. PUSTAKA

[1]. Sukardji K, et al. Pedoman diet diabetes mellitus. Cetakan III. Jakarta: Balai

Penerbit FKUI; 2007.

y = 2,41x + 27,13

R² = 0,96

15,00

25,00

35,00

45,00

55,00

0,00

5,00

10,00

15,00

∆

Ip

a

(µ

A

)

Konsentrasi glukosa (mM)

[2]. [Depkes] Departemen Kesehatan RI. Pedoman teknis penemuan dan tatalaksana

penyakit diabetes mellitus. Jakarta: Departemen Kesehatan RI; 2007.

[3]. Achmadi UF. Manajemen penyakit berbasis wilayah. Jakarta: Penerbit Buku

Kompas; 2005.

[4]. [WHO] World Health Organization. Global status report on noncommunicable

diseases

2010.

[Internet].

[cited

2012

June

30].

Available

from:

http://www.who.int/nmh/publications/ncd_report_full_en.pdf.

[5]. Monosik R, Stred’ansky M, Luspai K, Magdolen P, Sturdika E. Amperometric

glucose biosensor utilizing FAD-dependent glucose dehydrogenase immobilized on

nanocomposite electrode. Enzyme and Microbial Technology. 2012; 50: 227-232.

[6]. Tsujimura S, Kojima S, Kano K, Ikeda T, Sato M, Sanada H, Omura H. Novel

FAD-dependent glucose dehydrogenase for a dioxygen-insensitive glucose biosensor.

Biosci Biotechnol Biochem. 2006; 70: 654-663.

[7]. Shan C, Yang H, Han D, Zhang Q, Ivaskab A, Niu L. Graphene/AuNPs/chitosan

nanocomposites film for glucose biosensing. J. Biosensors and Bioelectronics.

2010; 25: 1070–1074.

[8]. Xing GW, Li XW, Tiang GL, Ye YH. Enzymatic peptide synthesis in organic solvent

with different zeolites as immobilization matrixes. Tetrahedron. 2000; 56:

3517-3522.

[9]. Mirel S, Sandulescu R, Kauffmann JM, Roman L. Electrochemical study of some

2-mercapto-5-R-ammino-1,3,4-thiadiazole derivatives using carbon paste electrodes.

J Pharm Biomed Anal. 1998; 18(4-5): 535-544.

[10]. Salih KK. Preparation of functional surfaces using zeolite nanocrystals for biosensor

and biomedical applications. [tesis]. Turki (TR): Middle East Technical University;

2012.

[11]. Amri C, Siswanta D, Mudasir. Determination of trace nitrite as

4-(4-nitrobenzenazo)-aminonaphthalene complex by extraction spectrophotometry. Indo.J Chem. 2009;

9(2): 254-260.